吳 梅,劉 燕,李庭喜,段 平,肖 春*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

一種馬鈴薯塊莖蛾卵的計(jì)數(shù)新方法

吳 梅1,2,劉 燕1,李庭喜2,段 平2,肖 春1*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

為了解決常規(guī)馬鈴薯塊莖蛾卵計(jì)數(shù)過(guò)程中存在的工作量大、卵聚集程度高時(shí)計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確等，建立了一種新的卵粒計(jì)數(shù)方法，即采用70%乙醇浸泡卵30 min，用毛筆輕輕刷下，再置于顯微鏡下計(jì)數(shù)。經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察，洗脫計(jì)數(shù)法的準(zhǔn)確性高、精密度、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，可用于馬鈴薯塊莖蛾卵粒的計(jì)數(shù)。

馬鈴薯塊莖蛾；卵粒；計(jì)數(shù)方法

馬鈴薯塊莖蛾[Phthorimaeaoperculella(Zeller)]又名煙草潛葉蛾，屬鱗翅目，麥蛾科(以下簡(jiǎn)稱PTM)。原產(chǎn)于南美洲，目前已發(fā)展成為一種世界性害蟲，在我國(guó)也擴(kuò)展到西南、西北、中南、華東10余個(gè)省、自治區(qū)，且發(fā)生較為普遍[1-2]。

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院是我國(guó)較早開(kāi)展PTM防治研究的單位之一，本實(shí)驗(yàn)室已有成熟的PTM人工續(xù)代飼養(yǎng)方法，為相關(guān)科研工作提供充足的蟲源。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)常需要對(duì)PTM產(chǎn)卵量進(jìn)行計(jì)數(shù)。PTM的卵橢圓形，微透明，卵的平均長(zhǎng)、寬分別為(0.40±0.02) mm和(0.30±0.01) mm，初產(chǎn)時(shí)乳白色，孵化前變成黑褐色。由于卵粒較小，需要在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，而PTM單雌產(chǎn)卵量可達(dá)150～200粒[3]，使得卵的計(jì)數(shù)工作量很大、耗時(shí)較長(zhǎng)。此外，PTM產(chǎn)卵的習(xí)性，如常出現(xiàn)卵聚集、疊壓的情況，在馬鈴薯塊莖上多產(chǎn)于芽眼、破皮下或縫隙中，隱蔽性較強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中除了在馬鈴薯、濾紙上產(chǎn)卵，還會(huì)在容器壁等處產(chǎn)卵等，上述情況使得用常規(guī)直接計(jì)數(shù)方法既不易也很難保證其準(zhǔn)確性。鱗翅目昆蟲產(chǎn)卵分泌物的基本功能是包裹卵并將卵固定，分泌物成分復(fù)雜，主要是水，還有蛋白質(zhì)、游離氨基酸、碳水化合物等[4-5]。本研究旨在尋找一種新的準(zhǔn)確性高、精密度及重現(xiàn)性好、簡(jiǎn)便易行的方法，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確并達(dá)到減少工作量目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲卵 馬鈴薯塊莖蛾飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院養(yǎng)蟲室，飼養(yǎng)條件為：(27±2) ℃，相對(duì)濕度50%～70%，L/D=14 h/10 h。收集成蟲于1 L玻璃燒杯中，喂以10%蜂蜜水，杯口用24目紗網(wǎng)封口，上置濾紙，用以收集蟲卵。

1.1.2 儀器與試劑 顯微鏡：XTL-2400(梧州奧卡光學(xué)儀器有限公司)。乙醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚(30～60 ℃)均為化學(xué)純，蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶劑及浸泡時(shí)間的選擇

1.2.1.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 將產(chǎn)有卵的濾紙浸泡于水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚等不同溶劑中，用毛筆輕輕刷拭，只有乙醇可將卵洗下，故選擇乙醇作為供試溶液。

1.2.1.2 溶劑及處理時(shí)間的選擇 溶劑選擇了3個(gè)濃度的乙醇溶液，分別為無(wú)水乙醇、95%乙醇、70%乙醇；浸泡時(shí)間考察了10、30、60 min。將產(chǎn)有卵的濾紙置顯微鏡下觀察，直接數(shù)卵粒的數(shù)量(即直接計(jì)數(shù))。再將上述濾紙放入玻璃培養(yǎng)皿中，倒入溶劑浸泡，然后用毛筆輕輕將卵從濾紙上刷下，將培養(yǎng)皿傾斜，使卵集中于一側(cè)，吸去多余溶劑，留下少許溶劑保持卵的濕潤(rùn)又不會(huì)使卵隨意流動(dòng)，置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)(即洗脫計(jì)數(shù))。每組重復(fù)3次，計(jì)算卵的洗脫率。

1.2.1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 卵的洗脫率=∑卵量(洗脫計(jì)數(shù))/∑卵量(直接計(jì)數(shù))

當(dāng)卵量(洗脫計(jì)數(shù))>卵量(直接計(jì)數(shù))時(shí)，按后者計(jì)。

1.2.2 方法學(xué)考察

1.2.2.1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 根據(jù)卵粒分布情況分為聚集組和離散組，離散組又根據(jù)卵量多少分為高卵量組、中卵量組、低卵量組，卵量分別為50～100、20～50、0～20粒，每組3個(gè)重復(fù)。按照1.2.1.2所確定的方法進(jìn)行操作，將卵量(直接計(jì)數(shù))視為真實(shí)值，計(jì)算準(zhǔn)確率。

1.2.2.2精密度實(shí)驗(yàn) 按照1.2.2.1進(jìn)行分組和操作，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)計(jì)數(shù)6次，計(jì)算RSD%(n=6)。

1.2.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照1.2.2.1進(jìn)行分組和操作，每個(gè)實(shí)驗(yàn)由3個(gè)人分別計(jì)數(shù)，計(jì)算RSD%(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑及浸泡時(shí)間的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑是對(duì)卵洗脫率的主要影響因素，其中70%乙醇對(duì)卵有較好的洗脫率。在該濃度下，不同浸泡時(shí)間對(duì)卵均有較高的洗脫率，考慮到節(jié)約時(shí)間并確保卵的洗脫，確定70%乙醇浸泡卵30 min為最佳實(shí)驗(yàn)條件(表1)。

表1 溶劑及浸泡時(shí)間對(duì)卵洗脫率的影響

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 直接計(jì)數(shù)與洗脫計(jì)數(shù)所測(cè)卵量見(jiàn)圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以常規(guī)直接計(jì)數(shù)法所測(cè)卵量為標(biāo)準(zhǔn)。用洗脫計(jì)數(shù)法測(cè)定離散型分布的卵粒平均準(zhǔn)確率為98.1%，此類型卵量的多少對(duì)準(zhǔn)確率的影響不大。聚集型分布的卵粒所測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率受聚集卵粒的多少及密集程度的影響，如聚2、聚3為聚集在一起的卵粒不多的情況，所測(cè)結(jié)果與直接計(jì)數(shù)法十分接近；而聚1為聚集的卵粒多且整齊地排列成兩層，所測(cè)結(jié)果與直接計(jì)數(shù)法相差較大，但此結(jié)果并不能說(shuō)明洗脫計(jì)數(shù)法不準(zhǔn)確，在此情況下，直接計(jì)數(shù)法所測(cè)卵量并不是真實(shí)值，因?yàn)樯蠈涌梢杂?jì)數(shù)而下層看不見(jiàn)，就只能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)估計(jì)；而在洗脫計(jì)數(shù)法中，70%乙醇溶液浸泡可使卵發(fā)生蛋白質(zhì)變性，卵變得有彈性而不易破碎，可在顯微鏡下用解剖針將聚集在一起的卵分開(kāi)，并可撥動(dòng)以觀察各個(gè)面，計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。所以采用將卵在70%乙醇中浸泡30 min后，再將卵洗脫下來(lái)計(jì)數(shù)，結(jié)果準(zhǔn)確度高。

圖1 直接計(jì)數(shù)法與洗脫計(jì)數(shù)法所測(cè)卵量對(duì)比

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洗脫計(jì)數(shù)法的精密度高，而常規(guī)直接計(jì)數(shù)法在卵粒多而密集的情況下精密度較差(表2)。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(RSD%，n=6)

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洗脫計(jì)數(shù)法有較好重復(fù)性，而常規(guī)直接計(jì)數(shù)法在卵粒多而密集的情況下的重復(fù)性較差(表3)。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(RSD%，n=3)

3 討論

本方法準(zhǔn)確性高、精密度及重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，可用于馬鈴薯塊莖蛾卵粒的計(jì)數(shù)。本方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于卵粒的洗脫，70%乙醇浸泡30 min可使卵粒有較高的洗脫率。只要能將卵粒都洗脫下來(lái)，置顯微鏡下計(jì)數(shù)就很容易了，一方面由于卵的蛋白質(zhì)變性，卵由半透明變成白色，方便觀察；另一方面，卵集中在一起，1～2個(gè)視野下就可數(shù)完。

本實(shí)驗(yàn)采用的是產(chǎn)在濾紙上的卵，而實(shí)驗(yàn)中馬鈴薯塊莖蛾的卵還可能產(chǎn)在馬鈴薯、燒杯等容器壁上，都可以使用本方法進(jìn)行卵粒的計(jì)數(shù)。燒杯等容器可裝滿70%乙醇浸泡，由于杯壁比濾紙更光滑，卵粒易被洗脫，且卵粒較重，沉于容器底部，可用吸管將其吸取轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中；馬鈴薯上的卵由于多分布于芽眼、破皮下或裂縫中，難以用毛筆刷下，可將未刷下的卵粒連同少量馬鈴薯塊莖切下，在顯微鏡下，用解剖針將卵粒慢慢剝離出，耗時(shí)會(huì)較長(zhǎng)，但準(zhǔn)確性高，此外，實(shí)驗(yàn)時(shí)挑選光滑、無(wú)起皮、無(wú)傷口的馬鈴薯，可大大降低馬鈴薯上卵粒計(jì)數(shù)的難度。

[1] 丁錦華,洪曉月.農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)(第二版)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2007:144-146.

[2] 農(nóng)業(yè)部外業(yè)入侵生物預(yù)防與控制研究中心.中國(guó)主要農(nóng)林入侵物種與控制(第1輯)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2004:27-29.

[3] Devi M B D A. Biology of potato tuber mothPhthorimaeaopercullela(Zeller)[J]. Ann. Pl. Protec. Sci., 2015, 21(2): 276-278.

[4] 金鳳,嵇保中,劉曙雯,等.昆蟲產(chǎn)卵分泌物的產(chǎn)生方式、成分及功能[J].昆蟲學(xué)報(bào),2009,52(9):1008-1016.

[5] 朱保健,劉朝良,董勝?gòu)?等.家蠶蛾粘液腺及其分泌物的初步研究[J].蠶業(yè)科學(xué),2003,29(4):436-438.

(責(zé)任編輯：曾小軍)

A New Method for Counting of Eggs of Potato Tuber Moth

WU Mei1,2, LIU Yan1, LI Ting-xi2, DUAN Ping2, XIAO Chun1*

(1. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;2. College of Pharmaceutical Science, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China)

In order to overcome the shortcomings of the conventional method for the counting of eggs of potato tuber moth, such as large workload, inaccurate counting results due to the high gathering of eggs, this research established a new method for the counting of eggs of potato tuber moth: soaking eggs in 70% ethanol solution for half an hour, then brushing the eggs down gently by brush pen, finally counting them under a microscope. The methodological survey proves that this method is accurate, precise, repeatable and simple, and it can be applied to count the eggs of potato tuber moth.

Potato tuber moth; Egg; Counting method

2017-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金(31560607)。

吳梅(1975─)，女，云南昆明人，博士研究生，從事昆蟲化學(xué)生態(tài)方面研究。*通訊作者：肖春。

S435.32

A

1001-8581(2017)06-0063-03