趙志丹，劉建華，鐘白云，王恝歆，謝婷彥，張秋煥，馮斯斯，鄧輝

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗科，長沙 410008)

·研究生園地·

結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移基因譜表達差異分析

趙志丹，劉建華，鐘白云，王恝歆，謝婷彥，張秋煥，馮斯斯，鄧輝

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗科，長沙 410008)

目的 探討人結(jié)腸癌細胞系SW480、SW620基因譜的表達差異。方法 針對NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中編號為GDS756的基因芯片表達數(shù)據(jù)，用GSEA軟件進行基因集富集分析及領(lǐng)頭亞群分析，利用FunRich分析軟件針對SW480、SW620細胞領(lǐng)頭亞群基因進行驗證性功能注釋，STRING在線分析系統(tǒng)對顯著性富集基因集領(lǐng)頭亞群基因進行生物網(wǎng)絡(luò)分析，獲得SW480、SW620細胞中心節(jié)點基因，并將中心節(jié)點基因與高重疊領(lǐng)頭亞群基因進行聯(lián)合分析，以獲得參與多功能的中心節(jié)點基因。結(jié)果 GSEA軟件分析篩選出SW480細胞顯著性富集基因集12個，領(lǐng)頭亞群基因491個，高重疊基因7個；SW620細胞顯著性富集基因集80個，領(lǐng)頭亞群基因870個，高重疊基因6個。對顯著性富集基因集領(lǐng)頭亞群基因進行生物網(wǎng)絡(luò)分析篩選出SW480、SW620細胞相關(guān)中心基因數(shù)目分別為5個及8個；結(jié)合GSEA及生物網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，獲得SW620細胞2個參與多功能調(diào)控的核心基因TOP2A、CDK1。結(jié)論 遺傳背景相同的結(jié)腸癌SW620細胞與SW480細胞具有不同的基因功能分布特點，SW620細胞多功能中心節(jié)點基因TOP2A、CDK1與結(jié)腸癌發(fā)展相關(guān)信號通路高度相關(guān)。

SW480；SW620；基因表達譜；基因集富集分析；生物網(wǎng)絡(luò)

結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者5年生存率降低的重要原因[1]。目前認為，結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個多基因共同作用的過程，但其具體機制仍未明確。本研究利用結(jié)腸癌原發(fā)灶SW480細胞與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移SW620細胞基因芯片表達譜數(shù)據(jù)，聯(lián)合應(yīng)用基因集富集分析(GSEA)與差異基因生物網(wǎng)絡(luò)分析。探討結(jié)腸癌細胞從侵襲到轉(zhuǎn)移這一過程中的基因表達譜的差異。以期加深對結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移機制差異的認識，為進一步的分子生物學(xué)研究提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 獲取基因芯片表達譜數(shù)據(jù) 登陸美國國立生物信息中心(NCBI)基因表達共享數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。獲取系列號為GDS756的基因表達譜數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集包含原位結(jié)腸癌細胞(SW480)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶結(jié)腸癌細胞(SW620)的基因表達譜數(shù)據(jù)集。SW480的3次獨立重復(fù)芯片分析結(jié)果編號為GSM21712、GSM21713、GSM21714；SW620的3次獨立重復(fù)芯片分析結(jié)果編號為 GSM21715、GSM21716、GSM21718。兩細胞系來源于同一患者，購自歐洲細胞中心(ECACC, Salisbury, UK)。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 應(yīng)用Affymetrix Expression Console軟件對原始芯片數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，用RMA算法進行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。在GEO下載GPL96(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL96)基因平臺TEX文本，找到對應(yīng)探針的基因名稱(Gene Symbol)，對輸出基因進行注釋。

1.3 基因集富集分析 本次分析選取了以下7個參照基因集：H:hallmark gene sets(效應(yīng)特征基因集合)，共50組；C1:位置基因集合(positional gene sets)，根據(jù)染色體位置，共326個；C2:專家共識基因集合(curated gene sets)，基于通路、文獻等；C3:模式基因集合(motif gene sets)，主要包括microRNA和轉(zhuǎn)錄因子靶基因兩部分；C4:計算基因集合(computational gene sets)，通過挖掘癌癥相關(guān)芯片數(shù)據(jù)定義的基因集合；C5:基因本體論集合(Gene Ontology gene sets)，包括生物學(xué)過程(biological process)，細胞原件(cellular component)和分子功能(molecular function)3個部分；C6:癌癥特征基因集合(oncogenic signatures)，大部分來源于GEO未發(fā)表芯片數(shù)據(jù)；涉及廣泛生理調(diào)控機制。選擇default weighted enrichment statistic方法，并設(shè)置錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)Q<0.25，每次隨機選擇100次重復(fù)分析(Number of permutation=100)、總體錯誤率(family-wise error rate，F(xiàn)WR)<0.05的基因集作為陽性基因集。

1.4 基因集領(lǐng)頭亞群分析 按標(biāo)準(zhǔn)化富集評分(Normalized Enrichment Score，NES)>2.0、FDRQ<0.25、FWR<0.05篩選顯著富集基因集，進行領(lǐng)頭亞群分析(1eading edge subset analysis)。領(lǐng)頭亞群基因是富集評分(Enrichment Score，ES)絕對值從0增加至最大的這段區(qū)間內(nèi)的基因集合。由于SW480、SW620領(lǐng)頭亞群基因的最高重疊次數(shù)不同，高重疊基因篩選需進行差異性處理，以保證所得基因在各自細胞中的重要性一致。以0.7×最高重疊次數(shù)作為閾值，重疊次數(shù)大于該閾值為標(biāo)準(zhǔn)，分別篩選SW480細胞領(lǐng)頭亞群中的高重疊基因及SW620細胞領(lǐng)頭亞群中的高重疊基因。

1.5 領(lǐng)頭亞群基因功能注釋 利用FunRich分析軟件[2]針對SW480、SW620細胞針對領(lǐng)頭亞群基因進行生物學(xué)過程(Biological process)功能富集、信號通路(Biological pathway)注釋。針對每個功能富集分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析得到領(lǐng)頭亞群基因在功能集中的總數(shù)，以及FunRich數(shù)據(jù)庫中基因在功能集中的總數(shù)，利用超幾何檢驗計算顯著性程度(P值)，再通過BH糾正P值來降低假陽性，以P<0.01為顯著性閾值，分別得到具有統(tǒng)計意義的高頻率注釋、信號通路；選取存在差異的前12個生物學(xué)過程進行對比分析。

1.6 領(lǐng)頭亞群基因的生物網(wǎng)絡(luò)分析 STRING 10.0生物網(wǎng)絡(luò)的生成主要基于：(1)已有實驗性數(shù)據(jù)，(2)文獻報道，(3)生物信息學(xué)分析預(yù)測。將1.4中所得領(lǐng)頭亞群基因合并提交STRING 10.0網(wǎng)絡(luò)軟件(http://string-db.org/)，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。計算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的度值(d)，分別對SW480、SW620結(jié)果進行差異性處理，以0.7×最高度值作為閾值，d大于該閾值為標(biāo)準(zhǔn)，分別篩選SW480細胞領(lǐng)頭亞群中的中心節(jié)點以及SW620細胞領(lǐng)頭亞群中的中心節(jié)點。

1.7 領(lǐng)頭亞群高重疊基因與中心節(jié)點基因的聯(lián)合分析 將SW480細胞領(lǐng)頭亞群分析所得高重疊基因與領(lǐng)頭亞群基因生物網(wǎng)絡(luò)分析所得中心節(jié)點基因取交集，篩選出高重疊基因中所含的中心節(jié)點基因；同理可篩得SW620細胞高重疊基因中所含的中心節(jié)點基因。

2 結(jié)果

2.1 GSEA富集的基因集 有4 917個基因集在SW480細胞中表達上調(diào)，其中205個FDRQ<0.25，722個P<0.05，339個P<0.01。5 014個基因集在SW620細胞中表達上調(diào)，其中1 310個FDRQ<0.25，1 337個P<0.05，861個P<0.01。

按NES>2.0、FDRQ<0.25、FWR<0.05篩選顯著富集基因集，篩選出12個SW480細胞顯著富集基因集和80個SW620細胞顯著富集基因集。在SW480細胞顯著富集基因集中，細胞增殖相關(guān)基因集7個，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因集3個，腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因集1個，角蛋白相關(guān)的基因集1個。SW620細胞前20個顯著富集基因集中，關(guān)于細胞周期的基因集有7個，關(guān)于細胞增殖的基因集有6個，關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移的基因集有4個，與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)的基因集有2個，與RNA剪切相關(guān)基因集有1個。見表1。

2.2 GSEA領(lǐng)頭亞群分析結(jié)果 SW480細胞12個顯著富集基因集中，分析得到491個領(lǐng)頭亞群基因，篩選出7個至少參與3個基因集領(lǐng)頭亞群基因(KRT5、SLC2A3、KRT81、KRT13、SPINT2、S100A2、LCN2)；SW620細胞80個顯著富集基因集中，分析得到870個領(lǐng)頭亞群基因，篩選出6個至少參與35個基因集領(lǐng)頭亞群基因(CDK1、RRM1、ZWINT、TOP2A、MCM2、KIF11)。兩細胞領(lǐng)頭亞群基因無交集。

表1 SW480、SW620顯著富集基因集生物學(xué)功能

2.3 領(lǐng)頭亞群基因的功能標(biāo)注 按生物學(xué)過程(Biological process)標(biāo)簽標(biāo)注兩領(lǐng)頭亞群基因，選取存在差異的前12個生物學(xué)過程進行對比分析。見圖1。SW480細胞領(lǐng)頭亞群基因中有483個基因具有生物學(xué)過程功能注釋，其中與細胞生長/存活(cell growth and/or maintenance)關(guān)聯(lián)基因占11.2%(P<0.01)、細胞通訊(cell communication)關(guān)聯(lián)基因占25.1%(P<0.01)、蛋白質(zhì)代謝(protein metabolism)關(guān)聯(lián)基因占10.1%(P<0.01)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)關(guān)聯(lián)基因占25.9%(P<0.01)、核酸代謝調(diào)控(regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism)關(guān)聯(lián)基因占16.4%(P<0.01)；SW620細胞領(lǐng)頭亞群基因中有858個基因具有生物學(xué)過程功能注釋，其中與細胞生長/存活(cell growth and/or maintenance)關(guān)聯(lián)基因占6.3%(P<0.01)、細胞通訊(cell communication)關(guān)聯(lián)基因占18.3%(P<0.01)、蛋白質(zhì)代謝(protein metabolism)關(guān)聯(lián)基因占7.1%(P<0.01)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)關(guān)聯(lián)基因占19.9%(P<0.01)、核酸代謝調(diào)控(regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism)關(guān)聯(lián)基因占30.2%(P<0.01)。

圖1 SW480、SW620細胞12個生物學(xué)過程比較

按信號通路(biological pathway)標(biāo)簽標(biāo)注兩領(lǐng)頭亞群基因，選取存在差異的前12個信號通路進行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW480細胞領(lǐng)頭亞群基因中有206個基因具有信號通路功能注釋，其中與整合素家族細胞表面相互作用信號通路(integrin family cell surface interactions)關(guān)聯(lián)基因占39.3%(P<0.01)、與Beta1整合素細胞表面相互作用信號通路(beta1 integrin cell surface interactions)關(guān)聯(lián)基因占38.3%(P<0.01)、與IFN-γ信號通路(IFN-gamma pathway)關(guān)聯(lián)基因占36.9%(P<0.01)、蛋白聚糖粘附分子介導(dǎo)信號通路(proteoglycan syndecan-mediated signaling events)關(guān)聯(lián)基因占37.9%(P<0.01)、鞘氨醇磷酸酯調(diào)控信號通路(sphingosine 1-phosphate (S1P) pathway)關(guān)聯(lián)基因占36.9%(P<0.01)、PDGF受體信號網(wǎng)(PDGF receptor signaling network)關(guān)聯(lián)基因占36.4%(P<0.01)；SW620細胞領(lǐng)頭亞群基因中有448個基因具有信號通路功能注釋，其中與前體RNA修飾信號通路(processing of capped intron-containing pre-mRNA)關(guān)聯(lián)基因占14.7%(P<0.01)、與mRNA合成信號通路(mRNA processing)關(guān)聯(lián)基因占15.2%(P<0.01)、與mRNA剪切信號通路(mRNA splicing)關(guān)聯(lián)基因占12.5%(P<0.01)、與mRNA剪切核心信號通路(mRNA splicing - major pathway)關(guān)聯(lián)基因占12.5%(P<0.01)、與mRNA轉(zhuǎn)錄子成熟信號通路(formation and maturation of mRNA transcript)關(guān)聯(lián)基因占15.4%(P<0.01)、與細胞周期信號通路(cell cycle, Mitotic)關(guān)聯(lián)基因占17.6%(P<0.01)。

2.4 領(lǐng)頭亞群基因的生物網(wǎng)絡(luò)分析 SW480細胞領(lǐng)頭亞群相互作用網(wǎng)絡(luò)由490個結(jié)點和1 009條邊連接而成。上調(diào)基因中d值大于40的中心節(jié)點5個，分別為：ITGA2、FOS、CDH1、IL-6、RANBP2。其中ITGA2參與的信號通路包括：整合素家族細胞表面相互作用(integrin family cell surface interactions)、 整合素細胞表面相互作用(beta1 integrin cell surface interactions)、蛋白多糖syndecan介導(dǎo)的信號通路(proteoglycan syndecan-mediated signaling events)、血管內(nèi)皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子受體相關(guān)信號通路網(wǎng)(VEGF and VEGFR signaling network)；FOS、CDH1、IL-6參與所有篩選所得信號通路。

SW620細胞領(lǐng)頭亞群相互作用網(wǎng)絡(luò)由867個結(jié)點和8 734條邊連接而成。上調(diào)基因中d值大于98的中心節(jié)點8個，分別為：TOP2A、CDK1、PCNA、PLK1、CCNB1、AURKB、SNRPB、HDAC1。其中TOP2A、SNRPB、HDAC1參與核酸代謝調(diào)控(regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism)；TOP2A、CDK1、PCNA、PLK1、CCNB1、AURKB、HDAC1參與細胞周期(cell cycle)、有絲分裂(mitotic)、DNA復(fù)制(DNA replication)相關(guān)信號通路；SNRPB參與mRNA加帽(processing of capped intron-containing Pre-mRNA)、mRNA剪切(mRNA splicing)mRNA轉(zhuǎn)錄、成熟(formation and maturation of mRNA transcript)、mRNA翻譯(gene expression)相關(guān)信號通路。

2.5 領(lǐng)頭亞群高重疊基因與中心節(jié)點基因的聯(lián)合分析 SW480細胞的領(lǐng)頭亞群高重疊基因不含中心節(jié)點基因；SW620細胞領(lǐng)頭亞群高重疊基因中存在2個中心節(jié)點基因：TOP2A、CDK1。根據(jù)領(lǐng)頭亞群基因功能標(biāo)注可知TOP2A參與了細胞有絲分裂與核苷酸代謝的調(diào)控(regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism, cell cycle, mitotic)，CDK1參與了細胞周期,DNA復(fù)制的調(diào)控(cell cycle, mitotic, DNA replication, mitotic M-M/G1 phases)。

3 討論

生物信息學(xué)的快速發(fā)展為分子生物研究的大數(shù)據(jù)分析處理提供了有力支持?；蛐酒磉_譜分析技術(shù)領(lǐng)域中，傳統(tǒng)上以差異基因分析為基礎(chǔ)的分析方法可以有效篩選樣本間明顯上調(diào)或下調(diào)的基因，但容易遺漏部分差異表達不明顯但卻有重要生物學(xué)意義的基因[3]。GSEA的原理是使用預(yù)定義的基因集，通常來自功能注釋或者先前實驗的結(jié)果，將基因按兩類樣本中的差異表達程度進行排序，然后分析預(yù)先設(shè)定的基因集合是否在這個序列表的頂端或底端富集[4]。GSEA軟件分析基因集合而非單個基因的表達變化，因此不容易忽略細微的表達變化，遺漏部分差異表達不顯著卻有重要生物學(xué)意義的基因[5-6]。

Affymetrix Human Genome U133A Array覆蓋了33 000多種已經(jīng)被證實的人類基因，可以對人類基因組中的絕大多數(shù)基因表達進行分析。本研究所選取的結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片GDS756基于以上平臺，通過基因集合富集分析得到12個SW480顯著富集基因集，80個SW620細胞顯著富集基因集；兩細胞系基因表達譜存在較大差異(表1)。將領(lǐng)頭亞群高重疊基因與中心節(jié)點基因取交集篩選多功能節(jié)點基因，結(jié)果顯示SW480的中心節(jié)點基因未參與3個以上功能亞群；TOP2A、CDK1作為SW620細胞的中心節(jié)點基因，同時參與了35個以上的功能亞群。

拓撲異構(gòu)酶Topo Ⅱ α 是基因TOP2A的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在細胞核內(nèi)催化DNA的斷裂重組，可形成斷裂、非斷裂兩種類別的復(fù)合體，參與細胞有絲分裂周期的調(diào)控，是維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的重要蛋白酶，可作為蒽環(huán)類藥物的作用靶點[7]。Kang等[8]研究發(fā)現(xiàn)TOP2A是PTEN維持細胞核內(nèi)基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵靶標(biāo)，是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵靶點。CDK1基因編碼細胞周期蛋白依賴性激酶1，可與細胞周期蛋白(Cyclin B1)相結(jié)合，二者參與細胞有絲分裂G2/M期調(diào)控促進細胞增殖[9-10]。Yang等[11]研究表明，CDK1高表達卵巢癌患者5年生存率較低，抑制CDK1的表達可減弱卵巢癌的增殖能力。TOP2A、CDK1與細胞增殖功能均有密切關(guān)系，但在結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移領(lǐng)域的研究相對薄弱仍具有較大的空間。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)方法分析已有的結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移芯片數(shù)據(jù)，低成本、高效地篩選出潛在的結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)多功能中心節(jié)點基因TOP2A、CDK1。因本研究僅涉及生物信息學(xué)分析，TOP2A、CDK1與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性仍需在臨床樣本中進行驗證，同時兩者參與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具體機制也有待進一步探索。這也是本研究的不足之處及后續(xù)的研究方向。

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(本文編輯：許曉蒙)

Differential analysis of gene expression profiles for lymphonode metastasis of colon cancer

ZHAOZhi-dan,LIUJian-hua,ZHONGBai-yun,WANGJia-xin,XIETing-yan,ZHANGQiu-huan,FENGSi-si,DENGHui

(DepartmentofClinicalLaboratoryXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,Hunan,China)

Objective To investigate the differences in the gene expression profiles between SW480 and SW620 cell lines. Methods A dataset of GDS756 containing the gene expression profiles of SW480 and SW620 was downloaded from the GEO database in NCBI. The differential expression genes between SW480 and SW620 were analyzed with gene set enrichment analysis (GSEA) and leading edge subset analysis. The genes in leading edge subset were re-annotated by FunRich software. The core genes of leading edge subset closely relating to SW480 or SW620 were analyzed with the STRING on-line analytical system. The functional core genes closely relating to SW480 or SW620 were obtained by the combined analysis of the core genes and high frequency genes from leading edge subset. Results GSEA identified 12 significantly enriched gene sets, 491 leading edge genes and 7 highly overlapping genes from SW480 and 80 significantly enriched gene sets, 870 leading edge genes and 6 highly overlapping genes from SW620. The STRING system identified 5 core genes from SW480 and 8 from SW620. The combined analysis of GSEA and bionetwork obtained 2 functional core genes,TOP2AandCDK1, from SW620. Conclusion The SW480 and SW620 cells with identical genetic background have different functional gene expression profiles, and the functional core genesTOP2AandCDK1 in SW620 cells may be related to the signal pathways of colon cancer metastasis.

SW480; SW620; gene expression profile; gene set enrichment analysis; bionetwork

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.17

趙志丹，1991年生，男，技師，碩士研究生，主要從事腫瘤學(xué)與分子生物學(xué)研究。

鐘白云，教授，E-mail：zbycsu@hotmail.com。

R735.3+5

A

2017-02-21)