馬千謝曉燕葉玲尉明洋張娟

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院杭州3100062.湖北省十堰市太和醫(yī)院

芍藥甘草湯對脂多糖誘導大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷的保護機制研究

馬千1謝曉燕2葉玲1尉明洋1張娟1

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院杭州3100062.湖北省十堰市太和醫(yī)院

[目的]通過脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(dorsal root ganglion neuron,DRGn)發(fā)生損傷，探討芍藥甘草湯對DRGn炎性損傷的保護作用及機制。[方法]實驗分為4組：空白對照(Con)組、LPS(LPS)組、芍藥甘草湯(SGD)組、芍藥甘草湯+尼克酰胺（SGD+NAM）組。相差顯微鏡下觀察各組DRGn形態(tài)的改變；CCK法檢測各組DRGn的存活率，并且通過Western blot法檢測各組神經(jīng)元沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silencing information regulator 2,Sir2)相關酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)、mTOR、p-mTOR和Ac-NF-κB的表達。[結果]LPS組較Con組DRGn的形態(tài)發(fā)生明顯改變，存活率明顯降低(P＜0.01)，SIRT1和p-mTOR表達降低(P＜0.05)，mTOR和Ac-NF-κB表達增高(P＜0.05)；SGD組較LPS組DRGn的存活率增加(P＜0.01)，SIRT1和p-mTOR表達增加(P＜0.05)，mTOR和Ac-NF-κB的表達降低(P＜0.05)；SGD+NAM組較SGD組DRGn的存活率降低(P＜0.05)，SIRT1和p-mTOR的表達降低(P＜0.05)，mTOR和Ac-NF-κB的表達增高(P＜0.05)。[結論]LPS可誘導背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元發(fā)生損傷。芍藥甘草湯可能是通過增加SIRT1的表達，促進mTOR向p-mTOR轉化，降低Ac-NF-κB的表達，進而抑制細胞內(nèi)后續(xù)炎癥因子的釋放從而發(fā)揮其神經(jīng)元保護作用。

芍藥甘草湯；神經(jīng)性病理性疼痛；炎性損傷；DRGn；SIRT1；鎮(zhèn)痛；Ac-NF-κB；mTOR

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NP)的病理改變主要表現(xiàn)為中樞敏化，具體機制為神經(jīng)損傷后局部合成和釋放的多種炎性疼痛相關因子，作用于脊髓痛覺傳遞神經(jīng)元使其處于超敏化狀態(tài)，同時通過正反饋效應進一步增強初級傳入神經(jīng)末梢傷害性神經(jīng)遞質的釋放，參與NP的發(fā)生和發(fā)展[1-3]。背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（dorsal root ganglion neuron,DRGn）作為軀體初級感覺神經(jīng)元，被廣泛運用于NP的研究中。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silencing information regulator 2,Sir2)相關酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)作為一種核蛋白，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)。SIRT1在維持神經(jīng)元的功能、促進神經(jīng)元軸突的生長以及樹突的分支中都發(fā)揮著重要的作用[4]。作為SIRT1激動劑的白藜蘆醇在各類炎癥性和NP中都有鎮(zhèn)痛作用，如在脊神經(jīng)結扎模型中有減輕觸覺痛敏作用[5]，以及減弱角叉菜膠誘導大鼠的痛覺過敏[6]。

芍藥甘草湯(shaoyao-gancao decoraton,SGD)出自《傷寒論》，由芍藥和甘草二藥組成。該方系仲景為傷寒誤汗亡陽、陽復后腳攣急證而設，奏柔肝舒筋、緩急止痛之效。國內(nèi)外研究已證實本方具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[7]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)SGD能增加坐骨神經(jīng)慢性損傷(chronic constrictive injury,CCI)大鼠脊髓背角SIRT1的表達，其作用被SIRT1基因沉默所減弱[8]。

本研究通過建立脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導激活DRGn模型，了解神經(jīng)元損傷的炎性相關病理生理機制以及SGD對該損傷的保護作用及機制，為今后NP的治療及藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑和藥品Neurobasal培養(yǎng)基(批號：12348017)、DMEM-高糖培養(yǎng)基(批號：A1443101)、胎牛血清(批號：10100147)、B27(批號：17504044)購自Gibco公司，NGF(批號：11050HNA)購自Invitrogen公司，L-多聚賴氨酸(批號：P0296)、脂多糖(批號：L2880)、胰蛋白酶(批號：T7409)、L-谷氨酰胺(批號：T7309)購自Sigma公司，CCK-8試劑盒(批號：C0038)、RIPA裂解液(批號：P0013)、預染蛋白marker(批號：P0072)購自碧云天公司，Tris(批號：0497)、甘氨酸(批號：0167)購自Amresco公司，化學發(fā)光檢測試劑(批號：NCI4106)購自Thermo公司。芍藥甘草湯(浙江省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由浙江中醫(yī)藥大學中藥制劑室蔣建平主任鑒定，每1mL相當于生藥2g)。

1.2 動物成年雌雄SD大鼠20只，體質量200～250g，浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境。胎鼠孕齡的確定根據(jù)雌雄SD大鼠合籠后，次晨在鼠籠下面看到黃白色的陰栓為妊娠第1d，待孕15d取材。

1.3 儀器超凈工作間(浙江中醫(yī)藥大學骨研所)；移液槍(Eppendorf)；酶標分析儀(Biotek)；自動電泳凝膠成像系統(tǒng)(Chemi Imager 5500,USA)；通用電泳儀(Bio-Rad,USA)；倒置顯微鏡(Olympus,Japan)；低溫高速離心機（Thermo Forma,USA）；-80℃超低溫冰箱（Thermo Forma,USA）。

2 方法

2.1 SD胎鼠DRGn的分離培養(yǎng)及純化參考李全波等[9-10]的方法，腹腔注射麻醉孕15d SD大鼠后，無菌條件下取出胚胎，在體視顯微鏡下用眼科剪沿背部沿脊椎剪開，暴露脊髓，用顯微鑷將脊髓兩側呈串珠狀的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)取出，剔除神經(jīng)節(jié)被膜后置于預冷的DMEM-高糖液中。眼科剪充分剪碎組織，加入0.25%胰蛋白酶，37°C消化30min。加入胎牛血清終止消化，用吸管小心反復吹打成單細胞懸液，收集細胞懸液后移至15mL離心管中，加入淋巴細胞分離液(淋巴細胞分離液濃度為60%)，水平離心2000r/min 20min。用細吸管插入到云霧層吸取細胞，置入另一離心管中，加入5倍以上體積的DMEM-高糖液重懸，離心1500r/min，5min，小心吸出上清液，加入一定體積的貼壁培養(yǎng)基（DMEM-高糖培養(yǎng)基+ 10%胎牛血清），細胞計數(shù)后按一定細胞密度接種于預先包被多聚賴氨酸的容器中(96孔板：5×105/孔，6孔板：2×105/孔，T25培養(yǎng)瓶：5×105/瓶)。6h后棄貼壁培養(yǎng)基，換用無血清神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(Neurobasal培養(yǎng)基+2%B27+10ng·mL-1神經(jīng)生長因子+2mmol·L-1L-谷氨酰胺+雙抗)。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48h后用于實驗。

2.2 芍藥甘草湯血清及正常大鼠血清制備將大鼠分為芍藥甘草湯組和生理鹽水組，灌胃2次/d，每次2mL，連續(xù)3d。于末次灌胃后2h內(nèi)進行腹主動脈采血。室溫靜置2h后，低溫離心4000 r/min，10min分離血清，置-80℃條件下保存?zhèn)溆?，使用時56℃水浴滅活30min，0.22μm濾器過濾滅菌。

2.3 分組及給藥將培養(yǎng)的DRGn細胞隨機分為4組：空白對照(Con)組、脂多糖(LPS)組、芍藥甘草湯(SGD)組、芍藥甘草湯+尼克酰胺(SGD+NAM)組。給藥：SGD+NAM組：SIRT1拮抗劑組尼克酰胺98nM[11]間斷24h給予兩次，LPS(100ng·mL-1)作用24h后再加入10%芍藥甘草湯血清作用24h；SGD組：LPS(100ng·mL-1)刺激作用24h后加入10%芍藥甘草湯血清作用24h；LPS組：LPS(100ng·mL-1)作用24h后加入10%正常大鼠血清作用24h；Con組加入10%正常大鼠血清作用24h。

2.4 CCK-8測定細胞活力DRGn分離培養(yǎng)后接種于96孔板，各組均設6個平行孔，100μL/孔，換用無血清神經(jīng)元專用培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，各組加入不同藥物置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)液，加90μL神經(jīng)元專用培養(yǎng)基后各孔加入10μL CCK-8溶液，孵育2h后用酶標儀比色(波長選擇570nm)，測定各孔的吸光度(A值)，記錄結果，計算各組細胞活力。備注：A(加藥)：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度，A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度，A(0加藥)：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

細胞活力(%)=[A(加藥)－A(空白)]/[A(0加藥)－A(空白)]×100。

2.5 Western Blot檢測SIRT1、mTOR、p-mTOR、Ac-NF-κB蛋白的表達分別提取各組細胞的總蛋白制成蛋白樣品，將含有目標蛋白（抗原）的樣品用5% SDS-PAGE電泳分離蛋白，硝酸纖維素膜轉膜，30mA恒流，4°C轉移過夜。封閉后先后加入一抗和二抗，室溫下分別孵育1.5h和1h?；瘜W發(fā)光法檢測，與發(fā)光底物結合后，經(jīng)X片曝光顯影，存儲用ImageJ分析。

3 結果

3.1 芍藥甘草湯對LPS誘導DRGn形態(tài)學的影響通過倒置顯微鏡觀察各組DRGn的形態(tài)(圖1)，正常培養(yǎng)下DRGn貼壁生長，突起細長，少部分DRGn可聚集在一起，四周有樹枝狀的神經(jīng)突起。LPS作用后大部分DRGn死亡，懸浮在培養(yǎng)液中，小部分DRGn突起變小，體積縮小。而加入芍藥甘草湯后DRGn的數(shù)量增多，細胞突起變大。

圖1 倒置顯微鏡下各組DRGn細胞的形態(tài)(×40)Fig.1 Groups of DRGn cell morphology under inverted microscope(×40)

3.2 CCK-8檢測各組細胞活性如圖2所示：與Con組相比，其他各組DRGn活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與LPS組相比，SGD組、SGD+NAM組的DRGn活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與SGD組相比，SGD+NAM組細胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3.3 各組SIRT1、mTOR、p-mTOR、Ac-NF-κB蛋白的表達如圖3所示：LPS組較Con組SIRT1、pmTOR表達降低，mTOR、Ac-NF-κB的表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。SGD組較LPS組SIRT1、pmTOR表達增加，mTOR、Ac-NF-κB的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SGD+NAM組較SGD組SIRT1、p-mTOR的表達降低，mTOR、Ac-NF-κB的表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 各組細胞活性比較(±s，n=6)Fig.2 Comparison of cell activity in each group(±s，n=6)

圖3 各組SIRT1、mTOR、p-mTOR、Ac-NF-κB表達Fig.3 The expression of SIRT1,mTOR,p-mTOR,Ac-NF-κB in each group

4 討論

NP的病理改變主要表現(xiàn)為中樞敏化，而神經(jīng)損傷處的免疫反應則在NP的敏化中發(fā)揮了重要作用：神經(jīng)損傷處有免疫細胞浸潤和炎性細胞因子釋放的增多；膠質細胞的激活；局部應用免疫抑制劑能減輕NP的行為反應等。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的的主要成分，是引起各種急慢性炎癥損傷的關鍵介質之一[12]。國內(nèi)外研究均表明LPS可誘導神經(jīng)膠質細胞的炎性改變及神經(jīng)元細胞的炎性損傷。鋸齒動物和人類研究表明全身性炎癥可誘發(fā)痛覺過敏[13]。臨床上用芍藥甘草湯治療各種神經(jīng)病理性疼痛如糖尿病后神經(jīng)病變、三叉神經(jīng)痛和帶狀皰疹后神經(jīng)痛等均取得良效。故本實驗采取LPS誘導激活DRGn，體外模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)慢性炎癥的發(fā)生及探討SGD緩解NP的可能機制。

SIRT1作為一種核蛋白，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+）的組蛋白去乙?；?。它通過去乙?；揎?，抑制轉錄和誘導基因沉默。近年來研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在調(diào)控細胞衰老、凋亡和氧化應激損傷等過程中扮演重要角色。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。參與非神經(jīng)細胞的增殖、神經(jīng)元的發(fā)育和突觸的可塑性。目前發(fā)現(xiàn)SIRT1 和mTOR同時在年齡相關性疾病中起到重要作用，激活SIRT1和抑制mTOR可以產(chǎn)生保護作用：包括抑制炎癥因子的釋放、促進神經(jīng)細胞的生成等。在大鼠癌痛和脊神經(jīng)拮扎模型中，脊髓背角和DRGn中p-mTOR表達增加[14]。因此課題組推測SIRT1的激活并抑制mTOR從而減少炎癥因子的釋放是緩解NP的關鍵步驟。

NF-κB是一種轉錄激活因子，促進多種促炎癥細胞因子和趨化因子的表達，參與普瑞巴林和加巴噴丁等一線藥物的抗NP治療中。SIRT1敲除小鼠巨噬細胞的NF-κB表現(xiàn)為高乙?；?，增加致炎因子基因的表達[15]。在阿爾茨海默病研究中，高表達SIRT1的小膠質細胞通過NF-κB的去乙?；?，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

本實驗中倒置相差顯微鏡下可以觀察到LPS組較Con組DRGn的數(shù)量明顯減少，形態(tài)明顯改變，CCK-8實驗中存活率明顯降低，LPS組較Con組SIRT1、pmTOR的表達降低，mTOR、Ac-NF-κB的表達增高，說明LPS誘發(fā)的炎癥損傷后，SIRT1表達降低，其機制可能和mTOR、Ac-NF-κB的表達增高有關。而SGD含藥血清組較LPS組，DRGn的存活率增加，SIRT1、p-mTOR表達增加，mTOR、Ac-NF-κB的表達降低，說明SGD對于LPS誘導的神經(jīng)炎性損傷具有保護作用，其機制可能同抑制下游炎性因子的表達有關。而這種保護作用可以被SIRT1拮抗劑尼克酰胺所逆轉，說明SGD可能是通過增加SIRT1表達，促進mTOR向p-mTOR轉化，降低Ac-NF-κB的表達，即通過SIRT1-p-mTOR-Ac-NF-κB通路來發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)痛作用的。本實驗的完成，對NP分子機制的研究提供了一種新思路，為中藥治療NP提供了理論依據(jù)，為開發(fā)針對NP的中藥復方提供了新的靶點和技術平臺。

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The Protective Effect of the Extracts of the Chinese Medicine Shaoyao and Gancao to DRGn Damaged by LPS

MA Qian1,XIE Xiaoyan2,YE Ling1,et al 1.Zhejiang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310006),China;2.Taihe Hospital of Shiyan City,Hubei Provine

[Objective]By establishing the cell model of dorsal root ganglion neuron(DRGn)impaired by lipopolysaccharide(LPS),to explore the extracts of Chinese medicine Shaoyao and Gancao on DRGn protective effect and mechanism of inflammatory damage.[Method]Cells were divided randomly into four groups:Control group(Con),LPS group(LPS),SGD group(SGD),SGD+Nicotinamide(SGD+NAM).The morphology of the DRGn was observed by microscope and the survival rate of DRGn was detected by CCK-8 test.The expression levels of silent mating type information regulation 2 homolog 1(SIRT1),mTOR, p-mTOR and Ac-NF-κB were detected by Western blot.[Results]Compared with the Con group:The morphology in the DRGn of the LPS group significantly changed and the survival rate of it declined with the declining expression levels of SIRT1 and p-mTOR,and the elevating expression levels of mTOR and Ac-NF-κB.In contrast to LPS group:the survival rate of DRGn and the expression of SIRT1 and p-mTOR increased in SGD group,and the expressions of mTOR and Ac-NF-κB were lower.However,the survival rate of DRGn and the expression of SIRT1 and p-mTOR declined in SGD+NAM group,and the expression of mTOR and Ac-NF-κB increased compared with SGD group.[Conclusion]The extracts of the Chinese medicine Shaoyao and Gancao may perform its protective effect through SIRT1-p-mTOR-Ac-NF-κB pathway to DRGn which was impaired by LPS.

Shaoyao Gancao Decoction;NP;inflammatory injury;DRGn;SIRT1;analgesia;Ac-NF-κB;mTOR

R331

A

1005-5509（2017）06-0513-05

10.16466/j.issn1005-5509.2017.06.016

2017-01-06）

國家自然基金(81202823/H2902)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃(2014KYA157)；浙江省自然基金(LY16H290003)

Fund projects:National Natural Science Fund(81202823/H2902);Zhejiang Medical and Health Science and Technology Plan(2014KYA157);Natural Science Fund of Zhejiang Province(LY16H290003)

張娟，E-mail：zhangjuan8989@hotmail.com