劉紅，孫偉，顧劉寶

（1.武漢市第一醫(yī)院武漢430022；2.江蘇省中醫(yī)院南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南京210029；3.江蘇省省級機關(guān)醫(yī)院江蘇省老年醫(yī)學(xué)研究所南京210024）

大黃素誘導(dǎo)自噬改善順鉑導(dǎo)致腎小管細胞損傷機制探索＊

劉紅1，孫偉2＊＊，顧劉寶3

（1.武漢市第一醫(yī)院武漢430022；2.江蘇省中醫(yī)院南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南京210029；3.江蘇省省級機關(guān)醫(yī)院江蘇省老年醫(yī)學(xué)研究所南京210024）

目的：觀察大黃素對順鉑所致的腎小管上皮細胞（NRK-52E）損傷的影響，探討其可能分子調(diào)節(jié)機制。方法：觀察大黃素對順鉑所致NRK-52E細胞形態(tài)學(xué)改變的影響；采用Western Blot方法檢測順鉑單獨處理和加入大黃素共同處理細胞后，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達情況；用大黃素干預(yù)細胞不同的時間點，觀察微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）II/I的表達和pmRFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后熒光顆粒的變化情況，同時觀察雷帕霉素處理細胞不同時間點后LC3-II/I的表達情況及其對順鉑環(huán)境下細胞形態(tài)學(xué)改變的影響，并觀察大黃素對自噬上游通路AMPK的活化和mTOR信號的影響。結(jié)果：順鉑可以誘導(dǎo)NRK-52E細胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，大黃素能夠改善順鉑導(dǎo)致的變化。另外，大黃素干預(yù)可以下調(diào)順鉑導(dǎo)致的cleaved Caspase-3蛋白表達的增多；大黃素處理細胞不同時間點LC3-II/LC3-I的比值明顯上升，pmRFP-LC3轉(zhuǎn)染觀察到大黃素處理細胞后自噬顆粒明顯增多。同時雷帕霉素處理細胞后LC3-II/LC3-I的比值明顯上升，其與順鉑共同干預(yù)能明顯改善順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡；大黃素干預(yù)時間的延長，p-mTOR蛋白表達明顯下調(diào)，p-AMPK的表達明顯上調(diào)。結(jié)論：大黃素可以改善順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細胞凋亡，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬來發(fā)揮腎保護作用。

大黃素順鉑自噬凋亡腎小管上皮細胞

順鉑是臨床常用的治療多種惡性腫瘤的廣譜化療藥物，然而其導(dǎo)致的腎毒性限制了在臨床的應(yīng)用[1,2]。自噬是一個溶酶體依賴性的大分子蛋白質(zhì)和自身受損的細胞器降解的過程，該過程為細胞修復(fù)提供原料與營養(yǎng)，實現(xiàn)細胞器更新[3]。自噬通常在饑餓、氧化應(yīng)激、缺氧等病理情況下發(fā)生。體內(nèi)外研究[4-6]表明，在順鉑導(dǎo)致的腎小管上皮細胞損傷早期出現(xiàn)了自噬，晚期則出現(xiàn)凋亡，這種自噬被認為是順鉑導(dǎo)致腎損傷的一個防御性保護作用。大黃素是中藥大黃的主要有效單體，具有諸多腎保護作用，包括抗腎纖維化、抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)血脂異常代謝，以及抑制炎癥反應(yīng)等[7]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素作為一種有效的自由基清除劑，對順鉑誘導(dǎo)的人類腎HEK293細胞損傷具有保護作用[8]。近年來有報道稱，大黃素可以誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和人血管平滑肌細胞發(fā)生自噬[9,10]。鄭英等[11]研究表明，在低氧條件下大黃素聯(lián)合細胞因子可通過增強細胞的自噬對大鼠小腸隱窩上皮細胞（IEC-6）起到保護作用。然而，大黃素是否可以通過自噬途徑，對抗順鉑導(dǎo)致的腎損傷起到保護或改善作用，目前還沒有相關(guān)報道。因此，本研究借助順鉑誘導(dǎo)的腎小管細胞損傷模型，體外用大黃素進行干預(yù)，觀察大黃素對順鉑環(huán)境下細胞損傷的影響及其分子生物學(xué)機制。

1 主要儀器與試藥

CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；CK40型倒置熒光顯微鏡（日本OYLMPUS公司）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)移設(shè)備（美國BIO-RAD公司）等。

順鉑（用生理鹽水溶解并配制成2 mmol·L-1溶液）、大黃素（用二甲基亞砜溶解并配制成10 mmol·L-1溶液）、雷帕霉素（用二甲基亞砜溶解并配制成100 μmol·L-1溶液）均購自美國Sigma-Aldrich公司（批號分別為：P4394、E7881、R0395）；Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s F-12（DMEM/F-12培養(yǎng)基）、雙抗（青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1）、胰蛋白酶（0.25%EDTA）均購自美國Hyclone公司（批號分別為：C113305HB7、15140.22、SH30042.01）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司，批號：302220F）；pmRFP-LC3質(zhì)粒（美國Addgene公司，批號：21075）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司，批號：1464341）；兔抗大鼠LC3 A/B（D3U4C）單克隆抗體（批號：12741）、兔抗大鼠Caspase-3抗體（批號：9662）、兔抗大鼠cleaved Caspase-3（Asp175）抗體（批號：9664）、兔抗大鼠phospho-mTOR（Ser2481）抗體（批號：2974）、兔抗大鼠mTOR抗體（批號：2972）、兔抗大鼠phospho-AMPKα（Thr172）抗體（批號：2531）、兔抗大鼠AMPKα抗體（批號：2532）、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（批號：4967）、辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG抗體（批號：7074）均購自美國Cell Signaling Technology公司；蛋白相對分子量Marker（美國Thermo Scientific公司，批號：26616）；偏聚二氟乙烯膜和ECL發(fā)光液（美國Millipore公司，批號：1409001）；X光膠片（美國Kodak公司）；顯影、定影試劑盒（上海碧云天公司，P0019）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及干預(yù)措施

傳代培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞株（NRK-52E）由日本山梨大學(xué)北村正敬教授惠贈。細胞用含5% FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基（含1%青霉素鏈霉素），置于37℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，當細胞生長覆蓋率達到80%-90%，以1∶3或1∶4率傳代。棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，加入0.25%胰酶1 mL，放入恒溫孵箱中消化約3 min，加入5 mL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 rpm離心4 min，棄去上清，加入適量培養(yǎng)基，1/4-1/3隔日傳代。取正常生長的NRK-52E細胞，用胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以2×105個/孔的密度接種于12孔板中。正常對照組用含5%FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基；實驗組根據(jù)不同刺激條件加入不同終濃度的順鉑（10、50 μmol·L-1）、大黃素（10、50、100 μmol·L-1）和雷帕霉素（100 nmol·L-1）進行干預(yù)。

2.2 NRK-52E細胞形態(tài)觀察

細胞經(jīng)不同條件處理后，用倒置光學(xué)顯微鏡觀察各組NRK-52E細胞形態(tài)并拍照。

2.3 細胞轉(zhuǎn)染及pmRFP-LC3熒光顆粒觀察

在35 mm培養(yǎng)皿中接種密度為1.5×105/孔的正常生長的NRK-52E細胞，待細胞生長至50%-80%時開始進行轉(zhuǎn)染。將3.5μL待轉(zhuǎn)染重組RFP-LC3質(zhì)粒加入150μL無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基中稀釋，將6μL LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑加入150μL無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基中稀釋，混勻兩組稀釋液后，室溫放置5 min。取出250μL均勻滴入細胞培養(yǎng)皿中進行轉(zhuǎn)染，置于恒溫箱中培養(yǎng)，8 h后換液，即得到轉(zhuǎn)染了pmRFP-LC3質(zhì)粒的細胞。將轉(zhuǎn)染了pmRFP-LC3質(zhì)粒的細胞重新鋪板于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按各組干預(yù)藥物濃度進行刺激，熒光顯微鏡下觀察pmRFPLC3熒光顆粒數(shù)目的變化。

2.4 Western Blot實驗

采用Western Blot實驗檢測LC3 I/II蛋白、Caspase-3蛋白、cleaved Caspase-3蛋白、p-mTOR和mTOR蛋白、p-AMPKα和AMPKα蛋白的表達。具體步驟如下：細胞經(jīng)藥物處理后，棄去培養(yǎng)板中的液體，用預(yù)冷的PBS漂洗2遍，加入裂解液（每孔加入裂解液100 μL），于冰上充分震蕩裂解15-30 min，用已高溫消毒的搶頭快速來回刮每孔的細胞，最后收集于1.5 mL離心管中，置于-80℃保存。實驗前將蛋白樣品于100℃沸水中煮4 min使蛋白變性，根據(jù)目的蛋白相對分子量配制分離膠和濃縮膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，取各蛋白樣品20 μL上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacryl-Amide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳分離。電泳完后，將蛋白移電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含3%BSA的聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（Tris Buffered Saline Tween，TBST）緩沖液封閉1 h；孵育一抗（LC3 I/II抗體、Caspase-3抗體和cleaved Caspase-3抗體、p-mTOR和mTOR抗體、p-AMPKα和AMPKα抗體均為1：1 000稀釋，β-actin抗體1：2 000稀釋），4℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，每次5 min，室溫孵育HRP標記的二抗（1：2 000-5 000稀釋）1.5 h，TBST再次洗膜3次，每次5 min，將ECL發(fā)光液均勻滴在PVDF膜上，進行X光膠片壓片、曝光和定影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析，結(jié)果以LC3 II/LC3 I比值，或以各指標的目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值表示目的蛋白的相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用xˉ±s表示，組間差異比較采用獨立樣本t檢驗或非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃素改善順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細胞形態(tài)學(xué)改變

已經(jīng)有研究表明，順鉑可以誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡[5]。細胞正常生長時形成融合的單層細胞，呈圓形或者多邊形貼壁細胞，細胞間緊密連接（圖1A），經(jīng)50 μmol·L-1的順鉑處理24 h后，細胞出現(xiàn)皺縮變圓死亡（圖1B）。

以往研究表明，大黃素對順鉑導(dǎo)致的細胞損傷具有保護作用[8,12]。本研究用不同濃度的大黃素（10、100 μmol·L-1）干預(yù)細胞24 h后，觀察到不同濃度的大黃素干預(yù)后，能明顯改善單獨順鉑處理組導(dǎo)致的細胞皺縮變圓死亡，并且高濃度大黃素干預(yù)組改善更明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1C、圖1D）。該結(jié)果提示順鉑可以誘導(dǎo)NRK-52E細胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，大黃素能夠改善順鉑導(dǎo)致的這種細胞形態(tài)學(xué)改變。

3.2 大黃素抑制順鉑上調(diào)的cleaved Caspase-3蛋白的表達

為了進一步證明大黃素對順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細胞改變具有保護作用，本研究選擇50 μmol·L-1的順鉑處理細胞，Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達情況。結(jié)果顯示，當順鉑處理細胞24 h時，與正常對照組相比，Caspase-3蛋白表達量明顯下調(diào)，cleaved Caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)，100 μmol·L-1濃度的大黃素干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)順鉑刺激下的Caspase-3和cleaved Caspase-3蛋白的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。該結(jié)果提示，順鉑可以引起細胞損傷，導(dǎo)致細胞凋亡；大黃素能夠改善順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細胞凋亡。

3.3 大黃素誘導(dǎo)NRK-52E細胞自噬

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（Microtubule-Associated Protein 1 Light Chain 3，LC3）被認為是自噬形成的標志分子，定位于自噬泡膜表面，LC3存在兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式即LC3-I和其脂化形式LC3-II，LC3-II/LC3-I的比值大小可以反映自噬活化的強度[13，14]。本研究用100 μmol·L-1大黃素干預(yù)細胞不同的時間點（0.5、1、2、6 h）；結(jié)果顯示，LC3-II/LC3-I的比值明顯上升，并且在1-2h時間點，LC3-II/LC3-I的比值最大，說明100μmol·L-1大黃素處理細胞在1-2 h時間點自噬最明顯（P＜0.05）（圖3A）。該結(jié)果提示大黃素能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，并且在1-2 h的干預(yù)時間點最明顯。本實驗應(yīng)用pmRFPLC3轉(zhuǎn)染技術(shù)，在熒光顯微鏡下觀察到用100 μmol·L-1大黃素處理NRK-52E細胞1 h后，細胞內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒狀LC3分布，與正常對照組相比，紅色自噬顆粒明顯增多（圖3B），更進一步提示大黃素能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

圖1 大黃素改善順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細胞形態(tài)學(xué)改變

圖2 大黃素抑制順鉑上調(diào)的cleaved Caspase-3蛋白的表達

3.4 雷帕霉素誘導(dǎo)自噬達到改善順鉑引起的NRK-52E細胞凋亡

為了觀察自噬是否參與順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡的保護作用，我們選用雷帕霉素，哺乳動物雷帕霉素mTOR靶蛋白的抑制劑，在應(yīng)激條件下它可以通過抑制mTOR活性而激活自噬[15]，有研究表明，雷帕霉素在體內(nèi)外對腎小管上皮細胞自噬有促進作用[16]。本研究采用雷帕霉素在體外干預(yù)細胞，觀察其對LC3-II/LC3-I蛋白表達的影響。Western Blot結(jié)果顯示，100 nmol·L-1雷帕霉素處理細胞0.5、1、2和6 h，與對照組相比，在1 h和6 h時LC3-II/LC3-I的比值明顯上升，并且在1 h時間點，LC3-II/LC3-I的比值最大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

本實驗采用100 nmol·L-1雷帕霉素與50 μmol·L-1順鉑聯(lián)合干預(yù)細胞24 h，倒置顯微鏡下觀察，雷帕霉素與順鉑共同干預(yù)能明顯改善順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡（圖5）。這些結(jié)果表明，雷帕霉素可以誘導(dǎo)NRK-52E細胞自噬，改善順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細胞凋亡。

3.5 大黃素通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬

為了進一步明確大黃素誘導(dǎo)自噬的機制，本研究觀察了大黃素對公認的自噬上游通路AMPK的活化和mTOR信號的影響。用50 μmol·L-1濃度的大黃素干預(yù)細胞不同時間點（0.5、1、2、6 h），Western Blot檢測pmTOR和p-AMPK的表達情況。結(jié)果顯示，隨著大黃素干預(yù)時間的延長，p-mTOR蛋白表達明顯下調(diào)，p-AMPK的表達在6 h時增加最明顯，與沒有大黃素干預(yù)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。該結(jié)果提示大黃素可能通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)NRK-52E發(fā)生自噬。

圖3 大黃素誘導(dǎo)NRK-52E細胞自噬

圖4 雷帕霉素誘導(dǎo)NRK-52E細胞自噬

圖5 雷帕霉素改善順鉑導(dǎo)致的NRK-52E細胞凋亡

4 討論

機體正常生理狀態(tài)下，基礎(chǔ)水平的自噬幾乎存在于所有的細胞，在細胞生長、增生以及死亡等過程中發(fā)揮著重要作用，自噬通過降解長壽命蛋白和細胞器，參與細胞器代謝和生物能量的供給，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而保護細胞[17]。已有研究報道，在腎臟病理生理過程中，它與腎臟固有細胞，如足細胞、腎小管上皮細胞等密切相關(guān)[18,19]。還有研究報道研究，在糖尿病腎損傷[20]、腎臟缺血-再灌注損傷[21]，以及中毒性腎損傷[22]模型中出現(xiàn)了自噬，表明自噬可能在多種腎臟疾病中起著重要作用。

順鉑的腎毒性主要表現(xiàn)為對腎小管上端損傷，引起急性腎損傷，且與其用藥劑量和時間呈正相關(guān)，其具體機制可能與導(dǎo)致腎小管細胞的凋亡和壞死，產(chǎn)生氧化應(yīng)激等有關(guān)[23-25]。近年來，順鉑誘導(dǎo)的自噬和凋亡在腎小管上皮細胞中的關(guān)系，已成為腎臟疾病領(lǐng)域被越來越廣泛研究的熱點。Yang等[5]用順鉑干預(yù)腎小管上皮細胞后，發(fā)現(xiàn)順鉑處理早期有自噬體的形成，自噬的標記物L(fēng)C3、Beclin-1和Atg5等表達增加，而晚期則出現(xiàn)凋亡。Periyasamy等[4]也發(fā)現(xiàn)用順鉑干預(yù)后，在小鼠腎小管上皮細胞中出現(xiàn)了自噬囊泡和自噬體，并且早于凋亡，如果用相應(yīng)的自噬抑制劑將自噬阻斷或者通過敲除自噬基因Beclin，能加重順鉑所致的小管上皮細胞凋亡。Rovetta等[19]通過體外培養(yǎng)NRK-52E細胞，發(fā)現(xiàn)順鉑處理可以早期誘導(dǎo)自噬，晚期則出現(xiàn)凋亡，并且自噬可以作為一種保護機制減輕順鉑所致的NRK-52E細胞凋亡。

前期研究表明，大黃素對順鉑導(dǎo)致的腎損傷具有保護作用[8，12]，另有研究報道大黃素具有抗凋亡的作用，代智等[26]研究表明大黃素可以通過影響細胞周期，從而改善順鉑導(dǎo)致的WI-38細胞凋亡。因此，本研究借助順鉑誘導(dǎo)的腎小管細胞損傷模型，在體外用大黃素進行干預(yù)，觀察大黃素對順鉑環(huán)境下腎小管細胞損傷的作用。同時采用順鉑處理NRK-52E細胞，發(fā)現(xiàn)順鉑可以引起細胞損傷，導(dǎo)致細胞凋亡，而加用高低濃度的大黃素干預(yù)細胞后，能明顯改善順鉑導(dǎo)致的細胞損傷。Western Blot實驗結(jié)果表明，大黃素干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)順鉑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3表達的上調(diào)，表明大黃素能夠改善順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細胞凋亡。大黃素對順鉑導(dǎo)致的腎損傷保護作用具體的機制需要本課題組進行了進一步的研究。

近年來有研究報道大黃素可以誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和人血管平滑肌細胞發(fā)生自噬[9,10]。鄭英等[11]研究表明在低氧條件下，大黃素聯(lián)合細胞因子可通過增強細胞的自噬對大鼠小腸隱窩上皮細胞（IEC-6）起到保護作用。也有研究表明大黃素是一種有效的腺苷單磷酸（AMP）激活蛋白激酶（AMPK）活化劑[27]，可以調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑[28]。那么大黃素是否可以通過自噬途徑，從而起到對抗順鉑導(dǎo)致的腎損傷作用，目前還沒有相關(guān)報道。LC3蛋白被認為是自噬形成的標志分子，可以用LC3-II/LC3-I的比值來評估自噬活化的強度[13,14]。mTOR是雷帕霉素的靶蛋白，可以調(diào)節(jié)細胞生長和自噬。在營養(yǎng)充足或無應(yīng)激狀態(tài)時，細胞中mTOR被激活，自噬通路受到抑制；然而，當營養(yǎng)缺乏，細胞處于應(yīng)激狀態(tài)或是饑餓環(huán)境時，mTOR活性受到抑制，自噬通路被激活[29]。在應(yīng)激條件下雷帕霉素可以特異性結(jié)合mTOR，抑制mTOR的蛋白激酶活性，從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生[30]。本研究用雷帕霉素干預(yù)NRK-52E細胞，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理可以上調(diào)LC3-II/LC3-I的比值，同時雷帕霉素與順鉑共同干預(yù)能明顯改善順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡。另外對大黃素干預(yù)細胞不同的時間點（0.5、1、2、6 h）進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LC3-II/LC3-I的比值也明顯上升，說明大黃素具有類似于雷帕霉素誘導(dǎo)自噬的作用，大黃素處理細胞后自噬熒光顆粒也明顯增多，進一步證實大黃素能誘導(dǎo)自噬。AMP-依賴性蛋白激酶（AMPK）通路是mTOR上游通路之一，AMPK被活化后可以抑制mTOR，達到增強自噬的目的。大黃素是一種有效的AMPK活化劑[27]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著大黃素干預(yù)時間的延長，p-mTOR蛋白表達明顯下調(diào)，p-AMPK的表達上調(diào)，在6 h時增加最明顯。故推測大黃素可能通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)了NRK-52E細胞自噬的發(fā)生。

圖6 大黃素通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬

順鉑可以導(dǎo)致腎小管上皮細胞凋亡從而引起腎損傷，從某種程度上來講，阻止或延緩腎小管上皮細胞凋亡就可以緩解順鉑的腎毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素作為中藥大黃的主要生物活性物質(zhì)，可以改善順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡，其保護作用機制可能是通過誘導(dǎo)自噬來發(fā)揮腎保護作用，該研究結(jié)果為大黃素腎臟保護作用的機制提供新的思路。

1Sahni V,Choudhury D,Ahmed Z.Chemotherapy-associated renal dysfunction.Nat Rev Nephrol,2009,5(8)：450-462.

2Yao X,Panichpisal K,Kurtzman N,et al.Cisplatin nephrotoxicity：a review.Am J Med Sci,2007,334(2)：115-124.

3Mizushima N.Autophagy：process and function.Genes Dev,2007,21 (22)：2861-2873.

4Periyasamy-Thandavan S,Jiang M,Wei Q,et al.Autophagy is cytoprotective during cisplatin injury of renal proximal tubular cells. Kidney Int,2008,74(5)：631-640.

5Yang C,Kaushal V,Shah S V,et al.Autophagy is associated with apoptosis in cisplatin injury to renal tubular epithelial cells.Am J Physiol Renal Physiol,2008,294(4)：F777-F787.

6 Kaushal G P,Kaushal V,Herzog C,et al.Autophagy delays apoptosis in renal tubular epithelial cells in cisplatin cytotoxicity.Autophagy 2008,4 (5)：710-712.

7劉紅,孫偉,顧劉寶,等.大黃素在腎臟病中藥理作用研究進展.臨床腎臟病雜志,2014,14(6)：378-381.

8Waly M I,Ali B H,Al-Lawati I,et al.Protective effects of emodin against cisplatin-induced oxidative stress in culture human kidney (HEK 293)cells.J Appl Toxicol,2013,33(7)：626-630.

9Mijatovic S,Maksimovic-Ivanic D,Radovic J,et al.Anti-glioma action of aloe emodin：the role of ERK inhibition.Cell Mol Life Sci,2005,62 (5)：589-598.

10 Wang X,Zou Y,Sun A,et al.Emodin induces growth arrest and death of human vascular smooth muscle cells through reactive oxygen species and p53.J Cardiovasc Pharmacol,2007,49(5)：253-260.

11鄭英.大黃素聯(lián)合KGF與HIF-1α在低氧細胞應(yīng)激損傷中的自噬機制研究.蘭州：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2015.

12 Ali B H,Al-Salam S,Al H I,et al.Abrogation of cisplatin-induced nephrotoxicity by emodin in rats.Fundam Clin Pharmacol,2013,27(2)：192-200.

13 Kimura S,Fujita N,Noda T,et al.Monitoring autophagy in mammalian cultured cells through the dynamics of LC3.Methods Enzymol,2009, 452：1-12.

14 Kadowaki M,Karim M R.Cytosolic LC3 ratio as a quantitative index of macroautophagy.Methods Enzymol,2009,452：199-213.

15 He C,Klionsky D J.Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.Annu Rev Genet,2009,43：67-93.

16 Geissler E K,Schlitt H J.The potential benefits of rapamycin on renal function,tolerance,fibrosis,and malignancy following transplantation. Kidney Int,2010,78(11)：1075-1079.

17 Xie Z,Klionsky D J.Autophagosome formation：core machinery and adaptations.Nat Cell Biol,2007,9(10)：1102-1109.

18Hartleben B,Godel M,Meyer-Schwesinger C,et al.Autophagy influences glomerular disease susceptibility and maintains podocyte homeostasis in aging mice.J Clin Invest,2010,120(4)：1084-1096.

19 Rovetta F,Stacchiotti A,Consiglio A,et al.ER signaling regulation drives the switch between autophagy and apoptosis in NRK-52E cells exposed to cisplatin.Exp Cell Res,2012,318(3)：238-250.

20 Wu W H,Zhang M P,Zhang F,et al.The role of programmed cell death in streptozotocin-induced early diabetic nephropathy.J Endocrinol Invest,2011,34(9)：e296-e301.

21 Jiang M,Liu K,Luo J,et al.Autophagy is a renoprotective mechanism during in vitro hypoxia and in vivo ischemia-reperfusion injury.Am J Pathol,2010,176(3)：1181-1192.

22Inoue K,Kuwana H,Shimamura Y,et al.Cisplatin-induced macroautophagy occurs prior to apoptosis in proximal tubules in vivo. Clin Exp Nephrol,2010,14(2)：112-122.

23 Ozkok A,Edelstein C L.Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury.Biomed Res Int,2014,2014：1-17.

24 Tsuruya K,Ninomiya T,Tokumoto M,et al.Direct involvement of the receptor-mediated apoptotic pathways in cisplatin-induced renal tubular cell death.Kidney Int,2003,63(1)：72-82.

25 Mitazaki S,Hashimoto M,Matsuhashi Y,et al.Interleukin-6 modulates oxidativestressproducedduringthedevelopmentofcisplatin nephrotoxicity.Life Sci,2013,92(12)：694-700.

26代智,仲來福.大黃素對抗順鉑引起的WI-38細胞凋亡.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2003,17(4)：276-280.

27 Song P,Kim J H,Ghim J,et al.Emodin regulates glucose utilization by activating AMP-activated protein kinase.J Biol Chem,2013,288(8)：5732-5742.

28 Liu K,Park C,Li S,et al.Aloe-emodin suppresses prostate cancer by targeting the mTOR complex 2.Carcinogenesis,2012,33(7)：1406-1411.

29 Yang Z,Klionsky D J.Mammalian autophagy：core molecular machinery and signaling regulation.Curr Opin Cell Biol,2010,22(2)：124-131.

30Noda T,Ohsumi Y.Tor,a phosphatidylinositol kinase homologue, controls autophagy in yeast.J Biol Chem,1998,273(7)：3963-3966.

Mechanism Exploration on EmodinAmeliorates Cisplatin-induced Renal Tubular Cell Injury throughActivation ofAutophagy

Liu Hong1,Sun Wei2,Gu Liubao3
(1.Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,China;2.Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China;3.Hospital of the Provincial Organization,Jiangsu Province Institute of Geriatrics,Nanjing 210024,China)

This study was aimed to observe the effect of emodin on cisplatin-induced renal tubular epithelial cells(NRK-52E)injury,in order to explore its possible molecular mechanisms.Firstly,effects of emodin on cisplatin-induced morphological changes in NRK-52E cells were observed.Secondly,the apoptosis-related protein expression of Caspase-3 and cleaved Caspase-3 were detected after the treatment of cisplatin alone or cisplatin together with emodin by western blot.Then,the expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3)II/I was detected after the treatment of emodin or rapamycin at different time points by western blot.Changes of pmRFP-LC3 fluorescent particles were observed by fluorescence microscopy.And effects of rapamycin on cellular morphological changes were observed in the environment of cisplatin.Finally,effects of emodin on the activation of AMPK and mTOR signal pathway were further observed,which is considered as the upstream of autophagy signaling pathway.The results showed that cisplatin can induce morphological changes in NRK-52E cell,which was obviously ameliorated by the intervention of emodin. Additionally,the increased protein expression of cleaved Caspase-3 induced by cisplatin was obviously reduced after the intervention of emodin.The LC3-II/LC3-I ratio was significantly increased after the treatment of emodin or rapamycin at different time points.Rapamycin can significantly ameliorate NRK-52E cell apoptosis induced by cisplatin. Simultaneously,the number of pmRFP-LC3 fluorescent particles increased after the treatment of emodin.As the extension of time by intervention of emodin,the protein expression of p-mTOR was significantly reduced.In contrast,the protein expression of p-AMPK was significantly increased.It was concluded that emodin can ameliorate cisplatininduced apoptosis in NRK-52E cells.Its potential mechanism may be attributed to the activation of autophagy by regulating AMPK/mTOR signaling pathway.And thus,it played a role in renal protective effects.

Emodin,cisplatin,autophagy,apoptosis,renal tubular epithelial cells

10.11842/wst.2017.03.023

R285.5

A

（責(zé)任編輯：陳寧，責(zé)任譯審：王晶）

2016-10-17

修回日期：2017-02-25

＊江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（SJLX15_0445）：大黃素通過自噬途徑對順鉑致NRK-52E細胞損害的保護及其機制研究，負責(zé)人：劉紅；國家自然科學(xué)基金委面上項目（81373607）：基于調(diào)控PI3K/Akt通路的大黃附子湯保護腎小管上皮細胞凋亡的研究，負責(zé)人：孫偉；江蘇省科技廳科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化（生命健康科技）專項資金（BL2012032）：基于“腎虛濕瘀”理論延緩慢性腎臟?。–KD3期）進展中西醫(yī)優(yōu)化方案研究及推廣應(yīng)用，負責(zé)人：孫偉。

＊＊通訊作者：孫偉，本刊編委，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：慢性腎臟病的發(fā)病機制與中醫(yī)藥干預(yù)。