陳云剛, 譚國(guó)慶,任維龍,徐展望

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 1.第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2.附屬醫(yī)院脊柱骨科，山東 濟(jì)南 250014)

骨碎補(bǔ)含藥血清經(jīng)wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

陳云剛1, 譚國(guó)慶2,任維龍1,徐展望1

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 1.第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2.附屬醫(yī)院脊柱骨科，山東 濟(jì)南 250014)

目的 研究骨碎補(bǔ)含藥血清經(jīng)wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的作用，探討其可能的作用機(jī)制。方法 用不同濃度含藥血清干預(yù)BMSCs，CCK-8法分別檢測(cè)血清干預(yù)BMSCs 3、5、7、9 d BMSCs的增殖能力，連續(xù)誘導(dǎo)7、10、14 d并進(jìn)行ALP活性檢測(cè)，誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色評(píng)價(jià)BMSCs的礦化能力，RT-PCR法檢測(cè)β-catenin、LRP5、GSK-3β、RUNX-2及Osteriex mRNA表達(dá)；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)量。結(jié)果 骨碎補(bǔ)含藥血清具有明顯的促進(jìn)BMSCs增殖的作用，在一定的時(shí)間段提高了ALP活性，促進(jìn)鈣化結(jié)節(jié)形成；上調(diào)wnt/β-catenin信號(hào)通路β-catenin、LRP5、RUNX-2及Osteriex mRNA表達(dá)；下調(diào)GSK-3β mRNA表達(dá)，上調(diào)β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)。結(jié)論 骨碎補(bǔ)含藥血清可以促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨分化，其機(jī)制與激活wnt/β-catenin信號(hào)通路，上調(diào)β-catenin、LRP5、RUNX-2及Osteriex mRNA表達(dá)，下調(diào)GSK-3β mRNA表達(dá)及上調(diào)β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

骨碎補(bǔ)；含藥血清；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；wnt/β-catenin；增殖；堿性磷酸酶；成骨分化

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是絕經(jīng)后婦女和老年人的常見(jiàn)病，以骨量丟失為主要特征，易發(fā)生脆性骨折，具有較高的致殘率和致死率，給社會(huì)增加了沉重的負(fù)擔(dān)，是僅次于心血管疾病的第二大疾病。據(jù)國(guó)際骨質(zhì)疏松基金會(huì)統(tǒng)計(jì)，34%的絕經(jīng)期婦女、20%的老年男性會(huì)發(fā)生骨質(zhì)疏松癥[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化能力，可以定向分化為成骨細(xì)胞。隨著研究的深入，BMSCs在OP發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮的作用日益引起關(guān)注，其成骨分化能力的強(qiáng)弱可能是OP的發(fā)病機(jī)制之一。研究證實(shí)，經(jīng)典的wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，補(bǔ)腎類(lèi)中藥對(duì)OP具有良好的治療效果，并促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。骨碎補(bǔ)(Rhizoma drynariae)作為補(bǔ)腎壯骨代表藥物，其活性成分骨碎補(bǔ)黃酮已被證實(shí)可以促進(jìn)體外BMSCs增殖，并促進(jìn)其向成骨方向分化[4]。目前，關(guān)于骨碎補(bǔ)治療OP的實(shí)驗(yàn)研究多集中在其促進(jìn)BMSCs增殖、促進(jìn)成骨分化及成骨相關(guān)基因的表達(dá)上，探討骨碎補(bǔ)經(jīng)wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化的研究極少。本實(shí)驗(yàn)以BMSCs為靶細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)的方式探討骨碎補(bǔ)含藥血清促進(jìn)BMSCs成骨分化可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠40只，♀♂各半，3月齡，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(魯)20140007，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑及試劑 骨碎補(bǔ)購(gòu)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，L-DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)F04ED090,MACGENE)、南美胎牛血清(批號(hào)NZJ1221，HyClone)、β-甘油磷酸鈉(批號(hào)S20S7G21494，上海源葉生物科技有限公司)、堿性磷酸酶染液(批號(hào)20160818，南京建成生物有限公司)、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20160813，南京建成生物有限公司)，TRIpure Reagent(批號(hào)231527AX, 北京艾德萊生物科技有限公司)，Transcriptor Frist Strand cDNA Synthesis Kit(批號(hào)13713422,Roche)，Rat β-catenin ELISA Kit(批號(hào)GR201612-1,武漢基因美生物科技有限公司)，Rat LRP5 ELISA Kit(批號(hào)GR201612-1,武漢基因美生物科技有限公司)，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，β-actin引物序列：上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′；β-catenin序列：上游5′-TGGTGGGCTGCAGAAAATGGTT-3′，下游5′-ACGATGGCCGGCTTGTTGC-3′； LRP5序列：上游5′-CCTGGCGCTGTGACGGCTTCC-3′， 下游5′-CAATGGCGCTGCTGTGGGCTGGTA-3′； GSK-3β序列：上游5′-TGGGTCATTTGGTGTGGTAT-3′，下游5′-GACCTCATCTTTCTTCTCGC-3′。RUNX-2序列：上游5′-GAACCCACGGCCCTCCCTGAACTC-3′，下游5′-AGCGGCGTGGTGGAATGGATGGAT-3′，Osterix序列：上游5′-CTGGGGGCAATTGGTTAGGTGGTG-3′，下游5′-GGGGGCAAAGTCAGACGGGTAAGT-3′。

1.3 器材 CO2培養(yǎng)箱(HF160W，上海力康發(fā)展有限公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge23R，上海力康發(fā)展有限公司)，研究用萬(wàn)能級(jí)顯微鏡(OLYMPUS/IX71，日本奧林巴斯公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler480II,瑞士)，酶聯(lián)免疫儀(美國(guó)Biotek Elx800，美國(guó)伯騰儀器有限公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSVERSE,美國(guó))，數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2(江蘇金壇榮華儀器公司)，微量紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(凱奧/K5600，北京凱奧科技發(fā)展有限公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 骨碎補(bǔ)含藥血清制備 根據(jù)成人每日所需藥量換算成大鼠總的用藥劑量，將骨碎補(bǔ)用水煎法進(jìn)行藥液濃縮，所得藥液4℃冰箱儲(chǔ)藏備用，用藥前恢復(fù)到常溫。SPF健康SD大鼠32只，3月齡，體質(zhì)量(200±30)g，隨機(jī)均分為低劑量、中劑量、高劑量、空白組4組，每組8只，每日8 ∶00am和2 ∶00pm灌胃，低劑量組每日灌服正常人給藥量1倍劑量(0.81 g·kg-1)骨碎補(bǔ)水煎液，中劑量組每日灌服正常人給藥量5倍劑量(4.05 g·kg-1)骨碎補(bǔ)水煎液,高劑量組每日灌服正常人給藥量10倍劑量(8.1 g·kg-1)骨碎補(bǔ)水煎液,空白組每日灌服等體積生理鹽水，連續(xù)3 d。末次灌胃全天劑量，1.5 h后腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h后，離心(2 500 r·min-1,4 ℃，15 min)后去上層血清，56℃水浴滅活補(bǔ)體，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，-20℃保存。

2.2 分組和給藥 將細(xì)胞分為空白1組、空白2組、空白3組、低劑量組、中劑量組、高劑量組?？瞻?組(Control group 1)給予L-DMEM、100 kU·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素、10%胎牛血清培養(yǎng)基；空白2組(Control group 2)給予L-DMEM、100 kU·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素、10%空白大鼠血清培養(yǎng)基；空白3組(Control group 3)給予L-DMEM、10%空白大鼠血清及成骨分化誘導(dǎo)液(100 U·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素的DMEM培養(yǎng)基、1 mmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸)；低劑量組(low dose group，LDG)給予L-DMEM，10%低劑量含藥血清、成骨分化誘導(dǎo)液；中劑量組(middle dose group，MDG)給予L-DMEM、10%中劑量含藥血清、成骨分化誘導(dǎo)液；高劑量組(high dose group，HDG)給予L-DMEM、10%高劑量含藥血清、成骨分化誘導(dǎo)液。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增 采取全脊髓貼壁法，按以下方法分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs:大鼠麻醉后，置于75%酒精溶液浸泡15 min，超凈臺(tái)內(nèi)快速去除周?chē)M織，取出股骨，75%酒精溶液浸泡30 s,咬骨鉗咬除兩干骺端，5 ml注射器吸取含10%胎牛血清和100 kU·L-1青、鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔，直至骨質(zhì)外觀微亮。收集髓腔沖洗液，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后首次換液，以后每2 d換液1次。待細(xì)胞融合80%以上后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1 ∶3傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。選擇生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面抗原檢測(cè)，以確定其具有BMSCs的免疫表型。

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 根據(jù)查閱文獻(xiàn)[5]，BMSCs的表面抗原標(biāo)記對(duì)CD29、CD44、CD105等反應(yīng)陽(yáng)性，CD34、CD45等反應(yīng)陰性。檢測(cè)步驟如下:首先用 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，1 500 rpm離心3 min，PBS重懸,細(xì)胞濃度2×108·L-1,PBS沖洗2次取細(xì)胞懸液400 μL,分別加入FITC、APC、PE標(biāo)記的抗體避光孵育40 min，PBS沖洗1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 CCK-8檢測(cè) 選用各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以1×107·L-1接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(含細(xì)胞數(shù)目約1 000個(gè))，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別加入各組對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，標(biāo)記后置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在d 3、5、7、9取板檢測(cè)。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔吸光度(A)，結(jié)果以A490吸光度值表示細(xì)胞增殖水平。

2.6 ALP活性檢測(cè)及礦化結(jié)節(jié)數(shù)計(jì)算 另取各組第3代BMSCs，以1×107·L-1接種于24孔板，共72孔。每組18孔，加入相應(yīng)的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)7、10、14 d，每組每次取6孔，按照AKP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ALP活性檢測(cè),562 nm處測(cè)定吸光度并換算為金氏單位。將第3代BMSCs接種到6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)至d 21時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，95%乙醇固定30 min, 0.2%茜素紅染色30 min，清水沖洗。置40倍鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取不重復(fù)的12個(gè)視野，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)數(shù)，評(píng)價(jià)BMSCs的礦化能力。

2.7 wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)mRNA及成骨相關(guān)mRNA檢測(cè) BMSCs按1×107·L-1接種到6孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞80%以上鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，各組分別加入各組對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，培養(yǎng)7 d后，用Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度A260/A280在1.8～2.2。cDNA單鏈合成條件：① 30 ℃，10 min；② 42 ℃，60 min；③ 95 ℃，5 min；④ 5 ℃，5 min，共一個(gè)循環(huán)。qPCR反應(yīng)條件:① 95 ℃，5 min；② 95 ℃，20 s；③ 62 ℃，15 s；④ 72 ℃，15 s；⑤ 72 ℃，5 min。②～④為45個(gè)循環(huán)。檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中基因的表達(dá)情況，反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)生成熒光擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熔解曲線，根據(jù)靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組基因拷貝數(shù)，記錄CT值，通過(guò)ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)處理組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)空白組，計(jì)算各組2-ΔΔCT值，即得該目的基因給藥組mRNA表達(dá)與空白組mRNA的倍數(shù)。

2.8 BMSCs總蛋白提取及酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、LRP5的表達(dá) 取各組連續(xù)培養(yǎng)7 d BMSCs細(xì)胞，每組取6孔提取細(xì)胞總蛋白，按如下方法：胰蛋白酶消化細(xì)胞后，4 ℃，1 500 r·min-1離心5 min，PBS洗3次，估計(jì)細(xì)胞總體積，加入RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min。離心10 min(12 000 r·min-1,4 ℃)，取上清，-80 ℃保存。取各組細(xì)胞總蛋白產(chǎn)物分別按照β-catenin、LRP5酶聯(lián)免疫試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)各組蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 BMSCs形態(tài)及流式細(xì)胞術(shù)表型鑒定結(jié)果 剛接種時(shí)BMSCs與其他細(xì)胞混雜，呈圓形。培養(yǎng)24 h后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，呈短紡錘狀，數(shù)量較少。3 d后貼壁細(xì)胞體積逐漸增大，數(shù)量增多，細(xì)胞逐漸伸展，呈梭形、多角形，開(kāi)始成簇生長(zhǎng)。7～9 d集落數(shù)量逐漸增多，并相互融合。9～11 d一般能達(dá)到80%以上細(xì)胞融合狀態(tài)。傳代后細(xì)胞呈圓形，接種12 h內(nèi)貼壁，逐漸伸展呈紡錘形，形態(tài)均一，增殖速度較快，5 d可鋪滿(mǎn)瓶底80%以上，呈漩渦狀(Fig 1)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)果顯示，其表面 CD29、CD44、CD45 陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為94.17%、95.50%、0.37%，結(jié)合BMSCs的形態(tài)觀察可以認(rèn)定本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

Fig 1 Photomicrograph of BMSCs cultured for different time points

3.2 CCK-8檢測(cè)結(jié)果 與空白3組對(duì)比，其他各組在各時(shí)間點(diǎn)吸光度值更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，中、高劑量組在各時(shí)間點(diǎn)吸光度值較低劑量組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在7、9 d時(shí)，中劑量組和高劑量組對(duì)比，無(wú)明顯差異，P>0.05。低、中、高劑量組在3～5 d時(shí)促進(jìn)BMSCs增殖作用更明顯，7～9 d進(jìn)入平臺(tái)期。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Effect of drug-containing serum on proliferation of BMSC

*P<0.05vscontrol group 3;#P<0.05vsControl group 1,2,3,LDG

3.3 ALP染色和活性檢測(cè)結(jié)果 各組在不同培養(yǎng)液培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，空白3組、低劑量組、高劑量組在7～14 d隨時(shí)間延長(zhǎng)ALP活性逐漸增強(qiáng)，并維持在一個(gè)較高的水平；中劑量組在培養(yǎng)10 d后ALP活性即達(dá)到較高的水平，并隨時(shí)間延長(zhǎng)ALP活性呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。與空白1組、空白2組、空白3組對(duì)比，低、中、高劑量組在各時(shí)間點(diǎn)ALP活性更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，中劑量組在各時(shí)間點(diǎn)ALP活性明顯較其他組更高，以培養(yǎng)10 d ALP活性增強(qiáng)最為明顯(P<0.05)。見(jiàn)Tab 1。

GroupTime7d10d14dControlgroup13.23±0.194.06±0.175.09±0.09Controlgroup23.21±0.104.14±0.145.16±0.18Controlgroup34.37±0.25*5.29±0.16*6.31±0.181*LDG5.22±0.22*#6.14±0.21*#6.71±0.17*#MDG6.17±0.26*#△▽8.91±0.17*#△▽7.88±0.19*#△▽HDG5.38±0.24*#△6.28±0.27*#△6.96±0.18*#△

*P<0.05vsControl group 1,2;#P<0.05vsControl group 3;△P<0.05vsLDG;▽P<0.05vsHDG

3.4 各組BMSCs礦化結(jié)節(jié)數(shù)比較 干預(yù)21 d后，各組均有礦化結(jié)節(jié)形成。茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)各組均呈現(xiàn)大小不均的紅色致密結(jié)節(jié)(Fig 3)，與空白1組、空白2組、空白3組比較，低、中、高劑量組礦化結(jié)節(jié)數(shù)均明顯增加(P<0.05)，中濃度組礦化結(jié)節(jié)數(shù)最多，與低、高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)Tab 2。

Fig 3 A:Control group 1;B:Control group 2;C:Control group 3;D:LDG,E:MDG;F:HDG

Tab 2 Comparisons of mineralized nodule in different groups(n=12)

*P<0.05vscontrol group 1,2;#P<0.05vscontrol group3;△P<0.05vsLDG;▽P<0.05vsHDG

3.5 BMSCs培養(yǎng)7 d β-catenin、LRP5、GSK-3β、RUNX2及Osterix mRNA表達(dá)水平比較 如Fig 4所示，含藥血清干預(yù)7 d后低、中、高劑量組的β-catenin、RUNX2、LRP5及Osterix mRNA表達(dá)較空白1組、空白2組明顯增加，GSK-3β明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組β-catenin、RUNX2及Osterix mRNA的表達(dá)水平明顯高于空白3組低劑量組和高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4 Effect of expression of LRP5, beta-catenin, GSK-3 beta, RUNX2 and Osterix mRNA containing serum on ±s，n=3)

*P<0.05vscontrol group 1,2;#P<0.05vscontrol group 3, LDG,HDG

3.6 BMSCs培養(yǎng)7 d各組Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較 如Fig 5所示，含藥血清干預(yù)7d后低、中、高劑量組，空白3組與空白1組，空白2組相比β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)組明顯增加(P<0.05)；中劑量組較低、高劑量組，空白3組更能促進(jìn)β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)(P<0.05)。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰退與腎精的盛衰密切相關(guān)。黃帝內(nèi)經(jīng)曰：“腎者，主骨生髓”。歷代醫(yī)家將骨質(zhì)疏松癥歸納為“骨痿、腎虛、虛勞”等范疇，基本病機(jī)為腎精虛衰，不能榮髓，髓不生骨，故多從補(bǔ)腎壯骨論治，以補(bǔ)腎作為治療之本。骨碎補(bǔ)作為補(bǔ)腎壯骨類(lèi)中藥在臨床應(yīng)用中已取得不錯(cuò)的療效[6]，骨碎補(bǔ)提取物在體外實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)對(duì)BMSCs增殖具有明顯的促進(jìn)作用，并可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化[4]。因此，應(yīng)用骨碎補(bǔ)研究其對(duì)BMSCs的成骨分化具有明確的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

BMSCs具有多向分化能力，在一定的誘導(dǎo)條件下可以定向分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等[7]，組織工程學(xué)中常選用β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸作為成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)BMSCs體外定向成骨分化[8]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一定濃度骨碎補(bǔ)提取物柚皮苷可以促進(jìn)BMSCs的增殖，但提取物最佳干預(yù)濃度不一[9-11]，分析可能與實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞、種類(lèi)及藥材的差異導(dǎo)致。目前關(guān)于骨碎補(bǔ)對(duì)BMSCs的體外增殖的作用大都應(yīng)用其提取物單體直接作用于細(xì)胞，含藥血清對(duì)BMSCs的體外增殖的研究較少。劉偉等[12]發(fā)現(xiàn)高濃度的骨碎補(bǔ)提取物作用細(xì)胞會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者抑制作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中劑量骨碎補(bǔ)含藥血清可以在3、5、7、9 d明顯促進(jìn)BMSCs的增殖，與低劑量組和各空白組比較有明顯差異，而在7 d、9 d中劑量組與高劑量組比較無(wú)明顯差異，分析可能是細(xì)胞達(dá)到一定密度后，由于受培養(yǎng)器材空間的限制，對(duì)其繼續(xù)增殖產(chǎn)生了影響。本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)含藥血清對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或抑制作用，在7 d以后即進(jìn)入平臺(tái)期。ALP是一種主要分布在細(xì)胞膜上的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是在BMSCs的成骨誘導(dǎo)過(guò)程中最早表達(dá)的、成骨細(xì)胞形成的標(biāo)志[13]。有文獻(xiàn)指出BMSCs在成骨分化過(guò)程中7～14 d是ALP分泌高峰期，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中劑量組ALP活性在誘導(dǎo)10 d后達(dá)到高峰，與其他各組有明顯差異，且誘導(dǎo)21 d后鈣結(jié)節(jié)形成的數(shù)量最多。

Fig 5 Effect of expression of LRP5 and beta-catenin protein containing serum on ±s，n=3)

*P<0.05vscontrol group1,2;#P<0.05vscontrol group 3, LDG,HDG

目前，骨碎補(bǔ)對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)研究主要集中在其促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨分化，其分子生物學(xué)機(jī)制研究鮮有報(bào)道。眾所周知，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控BMSCs成骨分化的一條重要通路，β-catenin是該通路的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞增殖、定向分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其在胞質(zhì)中的濃度決定著經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的激活與關(guān)閉。該通路的調(diào)控機(jī)制為：Wnt蛋白與Frizzled受體及LRP5/6結(jié)合，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)散落蛋白(DSH)來(lái)激活GSK-3β結(jié)合蛋白(GBP)，而GBP可以抑制GSK3β對(duì)β-catenin的磷酸化，進(jìn)而抑制β-catenin降解，使胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin得以穩(wěn)定并不斷積累入核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[14]?？梢?jiàn)LRP5、GSK-3β及β-catenin是wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要節(jié)點(diǎn)。RUNX2能通過(guò)上調(diào)骨鈣素、I型膠原、骨橋蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)BMSCs的成骨分化[15]，而Osterix是處在RUNX2下游的成骨分化關(guān)鍵調(diào)控因子。該通路還可以通過(guò)β-catenin增強(qiáng)wnt信號(hào)通路的靶基因堿性磷酸(alkaline phosphatase,ALP)的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)成骨分化。本研究顯示，BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)7d后骨碎補(bǔ)含藥血清明顯上調(diào)β-catenin、LRP5、RUNX2及Osterix mRNA的表達(dá)，下調(diào)GSK-3β的表達(dá)，胞質(zhì)中β-catenin、LRP5的蛋白表達(dá)水平升高，且中劑量組三者的表達(dá)量較其他組有明顯差異，提示骨碎補(bǔ)含藥血清通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，并提高該通路調(diào)控的RUNX2、Osterix mRNA表達(dá)及提高ALP的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)BMSCs的成骨分化。

總之，本實(shí)驗(yàn)分別從血清藥理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)3個(gè)角度對(duì)骨碎補(bǔ)含藥血清促進(jìn)BMSCs成骨分化的機(jī)制進(jìn)行探討，認(rèn)為骨碎補(bǔ)含藥血清促進(jìn)BMSCs成骨分化與wnt/β-catenin細(xì)胞通路的激活密切相關(guān)，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院眼科研究所完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室各位老師的指導(dǎo)和幫助表示衷心的感謝！)

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Effect of Rhizoma drynariae drug-containing serum on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by wnt/beta-catenin signaling pathway

CHEN Yun-gang1, Tan Guo-qing2, REN Wei-long1, XU Zhan-wang1

(1.TheFirstclinicalMedicalCollege，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250014,China;2.SpinalDeptofOrthopedics，theAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250014,China)

Aim To investigate the drug-containing serum of Rhizoma drynariae on osteogenesis differentiation of bone marrow mesenchymal stem, and discuss the possible mechanism.Methods BMSCs were cultured in media with different concentrations of medicine containing serum．BMSCs proliferation ability was detected in 3,5,7,9 days by CCK-8. ALP activity was detected after 7,10,14 days′ induction. After 3 weeks culturing, alizarin red staining was performed to observe the formation of calcium nodules. The expression of β-catenin,LRP5,RUNX-2 and Osteriex mRNA were detected using RT-PCR. The protein expression of β-catenin,LRP5 was detected using Elisa method.Results Rhizoma drynariae drug-containing serum could obviously promote the proliferation of BMSCs and calci-fied nodule formation.Besides, the ALP activity was improved in a certain period of time. The expression of β-catenin,LRP5,GSK-3β,RUNX-2 and Osteriex mRNA were significantly up-regulated,and the protein expression of β-catenin,LRP5 was up-regulated too. The expression of GSK-3β was down-trgulated. Conclusions Rhizoma drynariae drug-containing serum promotes mineralization and osteogenic differentiationof BMSCs, and the mechanism is closely related with activating WNT/beta-catenin signaling pathway, raising the beta-catenin, LRP5, RUNX-2, and Osteriex mRNA expression， beta-catenin, LRP5 protein expression，and down-regulation of GSK-3β mRNA expression.

Rhizoma drynariae; containing serum;bone marrow mesenchymal stem cells; wnt/β-catenin; proliferation; alkaline phosphatase; osteogenesis differentiation

時(shí)間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.034.html

2017-01-17,

2017-02-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473709)

陳云剛(1984-)，男，博士生，研究方向：脊柱脊髓損傷，脊柱退行性疾病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:chen_yungang@163.com； 徐展望(1960-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：脊柱脊髓損傷，脊柱退行性疾病的基礎(chǔ)與臨床, 通訊作者, E-mail:xzw6001@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.017

A

1001-1978(2017)06-0830-07

R-332；R282.71；R329.24；R336；R681；R977.3