陳計(jì)芳，段江燕

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000)

鹽脅迫下木炭對小麥幼苗根系蛋白表達(dá)的影響

陳計(jì)芳，段江燕

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000)

為明確木炭對小麥鹽脅迫的緩解效應(yīng)，以冬小麥品種臨汾6339為材料，對小麥幼苗分別進(jìn)行鹽和木炭單因素處理及二者復(fù)合處理，應(yīng)用蛋白質(zhì)雙向電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對小麥根系差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，相對鹽處理，在鹽和木炭復(fù)合處理的小麥根系中共檢測到豐度變化在2倍以上的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)12個。經(jīng)過MALDI-TOF-TOF分析及數(shù)據(jù)庫檢索,被鑒定的12個蛋白點(diǎn)按其功能大致可歸為5類。其中，第Ⅰ類為與能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì),包括ATP合酶和ATP酶；第Ⅱ類為與糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括磷酸甘油醛異構(gòu)酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶以及烏頭酸水合酶；第Ⅲ類為與氨基酸代謝相關(guān)的蛋白質(zhì),如半胱氨酸合成酶；第Ⅳ類為與遺傳物質(zhì)有關(guān)的蛋白質(zhì),如染色體的結(jié)構(gòu)蛋白；第Ⅴ類為未知功能蛋白質(zhì)。

小麥；根系；鹽脅迫；木炭；蛋白表達(dá)

土壤鹽漬化影響植物正常生長發(fā)育[1]，因而一直是世界農(nóng)業(yè)發(fā)展研究關(guān)注的問題。研究表明，NaCl等環(huán)境脅迫條件會使植物部分蛋白發(fā)生變性[2-7]。施用NO供體SNP[8]、稀土元素鈰[9]、赤霉素[10]等物質(zhì)可緩解鹽脅迫對植株的傷害，但這些材料都普遍存在著價格貴、稀缺、難制備、不易用于生產(chǎn)等缺點(diǎn)。木炭是一種碳含量極其豐富的生物炭。它富含微孔，不但可以提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，還可以有效地保存水分和養(yǎng)料，提高土壤肥力，已廣泛應(yīng)用于固碳減排、水源凈化、重金屬吸附、土壤改良等方面。有研究發(fā)現(xiàn)，生物炭對土壤鹽分表聚現(xiàn)象有顯著的影響,但影響效果與生物炭添加量密切相關(guān)。當(dāng)添加量較低(不超過5%)時,抑制土壤蒸發(fā),降低土壤表層返鹽量；當(dāng)添加量較大時(不小于10%),增強(qiáng)土壤蒸發(fā)能力,加劇表層土壤鹽堿化的程度[11]。生物炭浸提液可以提高鹽脅迫下水稻幼苗的抗氧化能力和對鹽脅迫的耐受性[12]。施用棉稈碳可有效改良新疆鹽漬化土壤的理化性質(zhì),改善土壤特性,在提高土壤質(zhì)量的同時增加作物產(chǎn)量[13]。在回收利用的廢水污泥土壤中，加入木炭能減少溫室氣體排放，并能促進(jìn)小麥生長和增產(chǎn)[14]。Díaz-Rojas等[5]的研究也得出同樣的結(jié)論。施用0.05%的木炭對甜椒的小孢子花粉粒胚的形成有明顯促進(jìn)作用[16]。在木薯培養(yǎng)過程中，加入木炭可促進(jìn)木薯的萌發(fā)和細(xì)胞的分化。然而，有關(guān)木炭對植物抗氧化酶活性、蛋白質(zhì)含量及表達(dá)等方面的影響[17],目前尚未見報(bào)道。本研究擬借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),分析在NaCl脅迫下加入木炭后小麥幼苗根部蛋白的差異表達(dá),以期從蛋白質(zhì)水平揭示木炭對小麥?zhǔn)艿降柠}脅迫傷害的緩解效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試冬小麥為品系6339，種子由山西省農(nóng)科院小麥研究所提供。木炭為市場上比較普遍的闊葉木炭。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取飽滿、大小均一的冬小麥種子,將其用70%～75%的酒精表面消毒0.5～1.0 min后，用無菌水漂洗數(shù)次，用MilliQ水浸種24～48 h,待其露白后,腹溝朝下,均勻排列于鋪有兩層濾紙的大培養(yǎng)皿里,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天光照10 h[18]。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將NaCl、木炭分別按照1.0%和4.0%的比例與營養(yǎng)土混勻后裝入花盆，以不加鹽和木炭為對照，共形成4個處理，即CK、NaCl、木炭及NaCl+木炭處理。待小麥長到兩葉一心時移栽到花盆中，9 d后取出小麥幼苗,剪根稱量待用。

1.3 方法

1.3.1 小麥幼苗根部總蛋白的提取與制備

尿素/硫脲法為本實(shí)驗(yàn)室提取蛋白的常用方法，具體提取過程參照劉偉霞[19]的報(bào)道，但略有改善，即把提取液組分中的DTT省略掉。

1.3.2 小麥幼苗根部蛋白質(zhì)的雙向電泳

第一向固相pH 梯度等電聚焦電泳(Isoelectricfocusing，IEF)：取出IPG預(yù)制膠條(7 cm,pH 3～10)，將上樣蛋白量和水化上樣液混勻。等電聚焦程序:50 V水化16 h，100 V線性除鹽1.5 h，300 V除鹽升壓1.5 h，1 000 V線性升壓30 min，3 000 V快速升壓30 min，6 000 V聚焦20 000 Vh，500 V保持。

第二向SDS-PAGE 電泳：聚焦完畢后,取出膠條,在10 mL平衡緩沖液Ⅰ(6 mol·L-1Urea、2% SDS、1.5 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.8)、20%Glycerinum、2% DTT)和10 mL平衡緩沖液Ⅱ(6 mol·L-1Urea、2%SDS、1.5 mol·L-1Tris-HCl、20%Glycerinum、2.5%Iodoacetamide)的溶脹盤里搖晃15 min。將膠條放到第二向SDS-PAGE凝膠的上表面,將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中,開始選用80 V,待觀測到蛋白樣品條帶成一條較平緩的直線后改換電壓120 V繼續(xù)電泳，等到溴酚藍(lán)指示劑的藍(lán)色出現(xiàn)在膠底部時,停止電泳。

1.3.3 考馬斯亮藍(lán)染色

電泳結(jié)束后,取出膠條轉(zhuǎn)入500 mL固定液(95%Alcoho，10.0%Glacial acetic acid.)固定30 mim后，選用考馬斯亮藍(lán)染色法(0.1%Coomassie brilliant blue R-250、95% Alcohol、10.0%Glacial acetic acid 定容至1 000 mL)染色2 h,后轉(zhuǎn)至1 000 mL脫色液(95%Alcohol、5.0%Glacial acetic acid)，期間不斷更換脫色液,直至條帶清晰可見。

1.3.4 雙向電泳圖譜分析

將已染色的凝膠用掃描儀進(jìn)行掃描,并使用PDQuest 8.0.1軟件對圖像進(jìn)行分析，將經(jīng)過裁剪、標(biāo)記的各實(shí)驗(yàn)組圖像進(jìn)行自動檢測和匹配,以2倍表達(dá)差異為標(biāo)準(zhǔn) (如2倍上升表達(dá)和2倍下降表達(dá)) 選擇差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.5 質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫檢索

切下膠點(diǎn),利用質(zhì)譜儀MicrOTOF-QII(BrukerDaltonics)鑒定蛋白質(zhì)。用Data Analysis Software和Mascot search engine version 2.3.01對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和搜索(通常使用軟件MASCOT在TAIR數(shù)據(jù)庫中檢索,對所搜索結(jié)果進(jìn)行分析鑒定,得分低于60者,定位為假陽性蛋白，應(yīng)舍棄)。

1.3.6 生物信息學(xué)分析

依據(jù)UniProtKB數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)提供的蛋白質(zhì)注釋信息對蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下小麥根部差異蛋白點(diǎn)的比較

通過2-DE技術(shù)，共檢測出100多個蛋白點(diǎn)，這些蛋白點(diǎn)pH值和分子量分別主要集中于3.5～7.5和30～85 kD范圍(圖1、圖2)。其中,與CK相比,木炭處理(C)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)8個,表達(dá)下調(diào)10個,未表達(dá)10個；NaCl處理(Y)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)1個，表達(dá)下調(diào)18個，未表達(dá)11個；NaCl+木炭復(fù)合處理(F)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)5個，表達(dá)下調(diào)12個，未表達(dá)13個。而與Y處理相比，F(xiàn)處理蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)15個，表達(dá)下調(diào)0個，未表達(dá)4個。

C：木炭；Y：NaCl；F：NaCl+木炭。圖2同。

C: Charcoal; Y: NaCl; F: NaCl+Charcoal.The same in Fig.2.

圖1 不同處理的蛋白表達(dá)圖譜

Fig.1 Images of protein spots under different treatments

2.2 小麥根部差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

選取復(fù)合處理中豐度變化相對于鹽處理在2倍以上的12個差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-TOF/MS質(zhì)譜鑒定(表1)。依據(jù)UniProtKB數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)蛋白點(diǎn)的信息資料，將所鑒定的12個差異表達(dá)的小麥幼苗根系蛋白按其功能歸為五類。第Ⅰ類為與能量代謝相關(guān)的蛋白，即ATP酶(Vacuolar proton-ATPase subunit A，SSP1901和SSP1701)；第Ⅱ類為與糖代謝相關(guān)的蛋白，包括磷酸甘油醛異構(gòu)酶(Phosphoglycerate kinase，SSP1902和SSP2903)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase， SSP1401)、6-磷酸葡糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,decarboxylating，SSP1502)、蘋果酸脫氫酶(Malic enzyme，SSP4801)以及烏頭酸水合酶(Aconitate hydratase，SSP4901)；第Ⅲ類為與氨基酸代謝相關(guān)的蛋白，如半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase，SSP1503)；第Ⅳ類為與遺傳物質(zhì)相關(guān)的蛋白，如染色體的結(jié)構(gòu)蛋白(Chromosome 3B,genomic scaffold,cultivar Chinese Spring，SSP0501、SSP1903和SSP3601)；第Ⅴ類為未知功能的蛋白質(zhì)。

圖2 不同處理的蛋白點(diǎn)命名圖譜

3 討 論

3.1 鹽脅迫及木炭對小麥幼苗根部形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化的影響

鹽脅迫能導(dǎo)致植株矮化,降低干重和鮮重,影響植物的光合作用,使植物提前發(fā)育并過早衰老[20]，引起作物減產(chǎn)[21]，影響植物體內(nèi)離子運(yùn)輸。這是因?yàn)樵邴}脅迫的應(yīng)答過程中，高濃度的NaCl改變碳水化合物代謝和能量代謝、離子的膜轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡，使細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞壁重構(gòu)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，少量的鹽脅迫能促進(jìn)植物抗氧化酶系統(tǒng)增強(qiáng)，提高SOD、POD和CAT活性；而過高含量的鹽分則使植物體內(nèi)抗氧化酶活性受到抑制。這一現(xiàn)象被很多學(xué)者已證實(shí)。周丹丹研究表明，5%鹽濃度脅迫下，隨著鹽脅迫時間的延長，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì))含量有所下降，SOD、POD、CAT 活性隨著脅迫時間的延長先升高后降低[23]。NaCl對冬小麥的抗氧化酶活性的抑制作用與植物體內(nèi)ROS含量劇增有關(guān)[24-25]。而木炭是近幾年來迅猛發(fā)展起來的對環(huán)境無二次污染的新型肥料[15]。木炭的添加能增加植物新生根的數(shù)目，提高植物鮮重、株高和葉面積，促進(jìn)植物器官分化，提高作物產(chǎn)量[14]，同時也使植物體內(nèi)MDA含量下降，顯著增加SOD、POD和CAT活性。同時冬小麥在鹽脅迫下根部可溶性糖有所積累，這可能是對鹽脅迫的適應(yīng)性表現(xiàn)，或是起信號物質(zhì)的作用[26]，還有待進(jìn)一步研究。

表1 鹽脅迫及木炭處理下小麥幼苗根部差異蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF-TOF/MS鑒定結(jié)果

3.2 木炭對鹽脅迫下小麥幼苗根部差異蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)共成功鑒定出12個蛋白點(diǎn)，按其功能可歸為五類蛋白質(zhì)。

第Ⅰ類為與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì),即ATP酶(Vacuolar proton-ATPase subunit A，SSP1901和SSP1701 )。ATP酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜、葉綠體類囊體及異養(yǎng)菌和光合菌的質(zhì)膜上,參與氧化磷酸化和光合磷酸化,在Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)和亞細(xì)胞分布以及離子平衡中具有重要作用[27]。ATP合成酶與能量代謝緊密相關(guān)。這些蛋白質(zhì)在鹽脅迫下表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)，而在木炭處理下有部分上調(diào)。研究表明，干旱條件下，ATP合酶表達(dá)下調(diào)，這將不可避免地影響光合磷酸化的產(chǎn)生，進(jìn)一步影響卡爾文循環(huán)，這可能是干旱脅迫條件下植物凈光合速率下降的一個主要原因[28]。

第Ⅱ類為與糖代謝相關(guān)蛋白質(zhì),包括磷酸甘油醛異構(gòu)酶(Phosphoglycerate kinase，SSP1902，SSP2903)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase，SSP1401)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,decarboxylating，SSP1502)、蘋果酸脫氫酶(Malic enzyme，SSP4801)以及烏頭酸水合酶(Aconitate hydratase，SSP4901)。這些蛋白在受到鹽脅迫時會表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)，而木炭則可緩解這些脅迫，使部分蛋白點(diǎn)恢復(fù)上調(diào)。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑的限速酶。磷酸戊糖途徑存在于細(xì)胞質(zhì)中,是葡萄糖在體內(nèi)生成5-磷酸核糖的唯一途徑。后者是合成核苷酸輔酶及核酸的主要原料,故在損傷后修復(fù)及脅迫處理的細(xì)胞中,磷酸戊糖途徑比較活躍。該蛋白的特異性表達(dá)可能對其修復(fù)鹽脅迫造成的損傷具有一定作用[27]。磷酸丙糖異構(gòu)酶是生物體中重要的異構(gòu)酶之一，存在于多種組織中，其主要參與糖酵解過程，對于 ATP 的儲存與生成是必不可少的[28]。研究發(fā)現(xiàn)，干旱逆境條件下，磷酸丙糖異構(gòu)酶的表達(dá)量下調(diào)，說明在鹽脅迫條件下，糖酵解途徑受到了阻礙，影響了細(xì)胞內(nèi)糖代謝和能量代謝的正常進(jìn)行。

第Ⅲ類為與氨基酸代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)，如半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase，SSP1503),鹽脅迫抑制了其表達(dá)，而復(fù)合處理組則表達(dá)上調(diào)，表明鹽脅迫阻礙了氨基酸相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。該蛋白的特異性表達(dá)說明鹽脅迫下,氨基酸合成明顯提高,促進(jìn)了氮代謝，從而提高了它的耐鹽能力[27]。

第Ⅳ類為與遺傳物質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)，如染色體的結(jié)構(gòu)蛋白(Chromosome 3B,genomic scaffold,cultivar Chinese Spring，SSP0501，SSP1903和SSP3601)這些蛋白點(diǎn)能夠控制遺傳表現(xiàn)，使染色質(zhì)保持一定的結(jié)構(gòu)。

第Ⅴ類為未知功能蛋白質(zhì)。在后續(xù)的研究中，將對其進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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Effect of Charcoal on Protein Expression of Wheat Seedling Root under Salt Stress

CHEN Jifang，DUAN Jiangyan

(College of Life Science,Shanxi Normal University,Linfen,Shanxi 041000,China)

Winter wheat Linfen 6339 was used to determine the effect of charcoal on wheat seedling root under salt stress.The wheat seedlings were treated with single factor (salt or charcoal) and two factors (salt and charcoal). The differential expression proteins in wheat roots were analyzed by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The results showed that compared with single factor treatment,with the increase of NaCl and charcoal concentration,a total of 12 differentially expressed protein spots were detected in the root system of wheat with abundance variation more than 2 times. The identified 12 protein spots could be classified into 5 categories according to their functions through MALDI-TOF-TOF analysis.Among them,ATP synthase and ATP enzymes belonged to ClassⅠ,which are relative to energy metabolism. Class Ⅱ contained sugar metabolism related proteins,including phosphoglycerate kinase,triosephosphateisomerase,6-phosphogluconate dehydrogenase,malic enzyme and aconitatehydratase. Class Ⅲ contained cysteine synthase belonging to amino acid metabolism related proteins. Class Ⅳ contained structural proteins of chromosome,belonging to hereditary substance related proteins. Class Ⅴ contained unknown function proteins.

Wheat; Root;Salt stress; Charcoal;Protein expression

時間：2017-05-12

2016-12-04

2017-01-12

E-mail：2575814547@qq.com

段江燕(E-mail：506777055@qq.com)

S512.1；S311

A

1009-1041(2017)05-0705-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170512.2001.038.html