毛貴珠++章曄敏++邵一凡++熊妍妍++陳小娥++方旭波

摘要：對(duì)浙江舟山蝦蟹養(yǎng)殖場(chǎng)附近的土壤進(jìn)行針對(duì)性地采樣，通過(guò)殼聚糖平板初篩、搖瓶復(fù)篩獲得一株具有產(chǎn)殼聚糖酶活性的菌株，編號(hào)為ZJOU-AC1。通過(guò)形態(tài)觀察、ITS全序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建，確定ZJOU-AC1為鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus）。對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為膠體殼聚糖1.5%，（NH4）2SO4 0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%。最適發(fā)酵周期為96 h。ZJOU-AC1產(chǎn)酶活力由2.05 U/mL提高到4.85 U/mL，與優(yōu)化前相比提高了2.36倍。

關(guān)鍵詞：殼聚糖酶，土壤，菌株篩選，菌株鑒定，發(fā)酵條件，優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）10-1913-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.029

Screening and Identification of Chitosanase-producing Microorganisms from Soil and Optimization of the Fermentation Conditions

MAO Gui-zhua，ZHANG Ye-mina，SHAO Yi-fana，XIONG Yan-yana，CHEN Xiao-ea，F(xiàn)ANG Xu-boa，b

（a.College of Food and Medicine；b.State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang， China）

Abstract： In order to screen desirable strains， we take sample of soil from areas adjacent to manufacturing locations of those plants which culture shrimps and crabs in Zhoushan. In this study，we had isolated a high Chitosanase-producing fungus ZJOU-AC1 from the soil by primary screening of plate specula and shaking cultivation. Based on standard morphological，physiological properties，ITS rDNA sequence and the construction of phylogenetic tree，the fungus ZJOU-AC1 was identified as Aspergillus cervinus. We also optimized the fermentation conditions to increase its productivity of chitosanase. The optimum medium components for chitosanase production by fungus ZJOU-AC1 were determined and listed as follows：colloid chitosan 1.5%，（NH4）2SO4 0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%. The optimum fermentation period is 96 h. The maximal chitosanase activity could reach 4.85 U/mL when ZJOU-AC1 was incubated in flask under the optimum cultural conditions. The activity increased by 2.36 times in comparison with initial activity of 2.05 U/mL.

Key words：chitosanase；soil；strain screening；strain identification；fermentation condition；optimization

殼聚糖是甲殼素脫N-乙?；漠a(chǎn)物，在自然界中儲(chǔ)量豐富，具有安全、無(wú)毒、抑菌、成膜、可降解、可食用等多種特性[1]，但其分子量大，晶體結(jié)構(gòu)緊密，水溶性差，在開發(fā)應(yīng)用上存在一定局限性[2]。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)降解殼聚糖可得聚合度在20以下的殼寡糖，其水溶性好且易被吸收。由于具備獨(dú)特的功能性質(zhì)，殼寡糖在廢水處理、食品工業(yè)、日用化學(xué)品、紡織、化工、農(nóng)業(yè)、生物工程和醫(yī)藥等方面均具有廣泛的應(yīng)用前景[3-5]。

殼聚糖的水解方式一般有化學(xué)法、物理法和生物酶法，其中，生物酶法是利用非專一或?qū)Ｒ恍悦笇?duì)殼聚糖進(jìn)行降解產(chǎn)生殼寡糖的方法，具有反應(yīng)過(guò)程容易控制、專一性高和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。雖然已報(bào)道有30多種非專一性酶能降解殼聚糖[6]，但這些商品酶制劑的水解效率并不高，也尚未被證實(shí)是否含殼聚糖酶（EC3.2.1.132）。殼聚糖酶是一種專一性水解酶，是酶法降解殼聚糖研究的重要內(nèi)容[7]。同時(shí)，從自然環(huán)境中尋找到產(chǎn)殼聚糖酶的新菌株也是殼聚糖應(yīng)用研究的關(guān)鍵內(nèi)容[8]。

本研究目的是首先從浙江省舟山市毗鄰的常年養(yǎng)殖蝦蟹的養(yǎng)殖場(chǎng)附近的山坡及海域篩選殼聚糖酶產(chǎn)生菌株，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)復(fù)篩確定產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，并進(jìn)一步通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化提高其產(chǎn)酶能力，以期獲得較好的殼聚糖酶產(chǎn)生菌株，為酶法降解殼聚糖的研究提供高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 樣品采集于浙江省舟山市定海區(qū)五雷山及浙江省舟山市沈家門水產(chǎn)加工廠旁的海灘。在采樣地區(qū)分別確定5個(gè)采樣點(diǎn)，在確定的采樣點(diǎn)上，先用土鏟去除表層5 cm左右的土壤，然后傾斜向下去除片狀土壤，將各采樣點(diǎn)土壤集中在一起混合均勻，各取50 g左右裝入無(wú)菌袋中帶回。

1.1.2 試劑 殼聚糖由浙江普陀新興藥業(yè)有限公司提供，脫乙酰度≥90%；膠體殼聚糖為實(shí)驗(yàn)室自制，參考孫玉英等[9]研究；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 恒溫生化培養(yǎng)箱SPX-250B型（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；雙人凈化工作臺(tái)SW-CJ-2D型（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；自動(dòng)高壓滅菌鍋 LMQ—R3260（上海昨非實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；UV-6000紫外分光光度計(jì)（蘇州江東精密儀器有限公司）；HHS電熱恒溫水浴鍋（上海棱光技術(shù)有限公司）；BS110電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；光學(xué)顯微鏡（Leica DM500）；冷凍離心機(jī)（Thermo LEGEND MICRO 17R）。

1.1.4 培養(yǎng)基 斜面保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）；初篩培養(yǎng)基（膠體殼聚糖平板）：A液為1%膠體殼聚糖（1%的醋酸溶解，調(diào)節(jié)pH至5.5～5.8），B液為酵母粉0.1%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂2%；液體培養(yǎng)基（復(fù)篩液體培養(yǎng)基）：膠體殼聚糖1%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 5.5；種子培養(yǎng)基：膠體殼聚糖0.2%，葡萄糖1%，KH2PO4 0.2%，（NH4）2SO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，自然pH。以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min，其中A、B液分開滅菌后再等體積混合。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株的分離 每份樣品取土樣10 g置于100 mL含有無(wú)菌生理鹽水的三角瓶（6顆玻璃珠）中，在150 r/min，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)30 min。將土壤樣品混合液進(jìn)行梯度稀釋，得到10-1～10-5稀釋度的土壤稀釋液。分別取1 mL涂布于膠體殼聚糖平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。挑選具有殼聚糖水解透明圈的菌落于另一膠體殼聚糖平板上劃線純化，于30 ℃烘箱中經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)2～3 d后移入4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選與純化 ①平板透明圈初篩與確認(rèn)。將分離得到的菌株在膠體殼聚糖平板上平行劃線，倒平板時(shí)注意控制各平板的厚度大致相同，30 ℃培養(yǎng)5～6 d。每天測(cè)量并記錄各菌落的直徑（d）以及各菌落周圍的透明圈直徑（D），以d值和D/d值大小為指標(biāo)挑選降解殼聚糖能力較強(qiáng)的菌株，選擇透明圈與菌落直徑比較大的菌株作為進(jìn)一步復(fù)篩的出發(fā)菌株。②產(chǎn)酶菌株的純化。通過(guò)劃線分離以達(dá)到純化培養(yǎng)的目的，即選取在膠體殼聚糖平板上形成的透明圈直徑與菌落直徑比較大的菌落，對(duì)其進(jìn)行多次劃線純化培養(yǎng)，然后挑取單菌落接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃烘箱中培養(yǎng)3～4 d，后移入 4 ℃冰箱中保存，備用。③菌株的復(fù)篩。從PDA斜面培養(yǎng)基中刮取一菌環(huán)接入種子培養(yǎng)基中（裝液量75 mL/250 mL三角瓶），在30 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d。將種子培養(yǎng)中得到的各菌株分別以1/15 mL培養(yǎng)基的量接種到復(fù)篩液體培養(yǎng)基中（裝液量75 mL/250 mL三角瓶），于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，每隔12 h測(cè)定一次發(fā)酵液的酶活力。將離心后的發(fā)酵液上清液稀釋100倍測(cè)定酶活，酶活測(cè)定方法為3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[10]。最終綜合考慮酶活及產(chǎn)酶菌株初篩結(jié)果，選擇高產(chǎn)殼聚糖酶菌株。

1.2.3 菌種鑒定 ①形態(tài)學(xué)觀察。將優(yōu)勢(shì)菌株劃線于膠體殼聚糖平板中，30 ℃培養(yǎng)5～6 d以獲得細(xì)菌的單菌落，利用光學(xué)顯微鏡和菌體染色制片對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察并拍照。同時(shí)，依據(jù)魏景超[11]的《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌種進(jìn)行初步鑒定。②ITS全序列分析。菌株的ITS序列鑒定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成[12]。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化研究 單因素試驗(yàn)：①碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。在液體培養(yǎng)基中，分別以葡萄糖、乳糖、淀粉、氨基葡萄糖以及乙酰氨基葡萄糖代替復(fù)篩液體培養(yǎng)基中的膠體殼聚糖作為碳源（碳源濃度為1%），考察不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。在此基礎(chǔ)上改變碳源濃度，分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察不同濃度的碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。②氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。在液體培養(yǎng)基中，分別以牛肉膏、硝酸鈉、蛋白胨、氯化銨、酵母粉代替復(fù)篩液體培養(yǎng)基中的硫酸銨（氮源濃度為0.2%），考察不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。在此基礎(chǔ)上，固定碳源濃度，改變氮源濃度，分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%，考察不同濃度的氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。數(shù)據(jù)分析：每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)取3組平行樣，最終的測(cè)量值取平均值[13]，3組平行樣的誤差控制在5%以內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果

從采集的土樣篩選到13株有產(chǎn)酶能力的菌株，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選、分離和純化，挑取菌落周圍產(chǎn)生明顯的水解透明圈，并且水解圈直徑和菌落直徑的比值（D/d）較大的6株，編號(hào)分別為ZJOU-AC1、ZJOU-AC2、ZJOU-AC3、ZJOU-AC4、ZJOU-AC5和ZJOU-AC6（表1）。

2.2 菌株復(fù)篩

根據(jù)菌株在膠體殼聚糖平板上產(chǎn)生透明圈直徑和菌落直徑的比值（D/d）大小進(jìn)行初步篩選是可行的，但透明圈的大小并不能完全反映菌株的產(chǎn)酶能力，因?yàn)榫渲車该魅Φ拇笮〕伺c產(chǎn)酶能力有關(guān)，還與菌株本身產(chǎn)生的殼聚糖酶的種類有關(guān)[6]。因此，通過(guò)搖瓶復(fù)篩來(lái)達(dá)到精選的目的。將已純化的具有較強(qiáng)產(chǎn)殼聚糖酶能力的6株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，測(cè)每株菌株0～7 d的最高酶活力（表2）。

由圖1可以看出，菌株ZJOU-AC1最高酶活力達(dá)2.05 U/mL，為產(chǎn)酶活力最高的菌株，也是初篩中透明圈直徑與菌落直徑比值最大的菌株。綜合考慮兩者結(jié)果，將ZJOU-AC1作為進(jìn)一步研究的試驗(yàn)菌株。

2.3 菌株ZJOU-AC1鑒定

2.3.1 菌株ZJOU-AC1的形態(tài)觀察及鏡檢 菌株ZJOU-AC1的菌落特征：菌株在膠體殼聚糖平板以及PDA培養(yǎng)基上均能良好生長(zhǎng)。菌株在膠體殼聚糖平板上的菌落直徑為5.5～6.5 mm，米白色，表面粗糙、隆起、呈饅頭形、絮狀、結(jié)構(gòu)疏松且邊緣整齊；在PDA培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)前期呈米白色，后期微黃且不透明。菌株ZJOU-AC1的顯微鏡形態(tài)特征：較多分支的有隔菌絲及其頂端的孢子和孢子囊，子囊殼有包被，無(wú)孔口，分生孢子串生。參照魏景超[11]的研究，菌株ZJOU-AC1與曲霉（Aspergillus）的形態(tài)特征描述基本一致。

2.3.2 ITS rDNA序列克隆結(jié)果 PCR擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，獲得1條約600 bp大小的特異DNA帶（圖3），基因組DNA的條帶清晰，無(wú)降解。

2.3.3 ITS全序列分析 真菌核糖體基因包括4種，分別為28S rDNA，5S rDNA，18S rDNA和5.8S rDNA，相互之間由間隔區(qū)（Internal Transcribed Space，ITS）分隔。真菌的ITS序列包括ITS1和ITS2兩部分，其進(jìn)化速度快，具有多態(tài)性，適用于對(duì)親緣關(guān)系較近的菌株進(jìn)行區(qū)分鑒定。

將菌株ZJOU-AC1進(jìn)行36次純化培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行ITS序列測(cè)定，將菌株ZJOU-AC1的ITS基因序列在NCBI官網(wǎng)中使用Nucleotide BLAST比對(duì)，選取該菌種使用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。由圖4可知，菌株ZJOU-AC1的ITS序列與Aspergillus cervinus的同源性達(dá)到99%以上。結(jié)合菌株形態(tài)觀察、顯微特征以及ITS同源性分析，鑒定菌株ZJOU-AC1為鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus）。

2.4 菌株ZJOU-AC1的產(chǎn)酶曲線

將菌株ZJOU-AC1接種到液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)0～7 d，每隔12 h測(cè)定酶活一次。

由圖5可知，前24 h產(chǎn)酶量極低，自24～96 h產(chǎn)酶量迅速增長(zhǎng)，到96 h為最大產(chǎn)酶量，其酶活力達(dá)2.05 U/mL，自96～120 h，產(chǎn)酶量幾乎保持恒定，120 h之后緩慢減弱。

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.5.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響 由表3可知，在濃度均為1%的葡萄糖、乳糖、淀粉、膠體殼聚糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖6種碳源中，最適合菌株ZJOU-AC1產(chǎn)酶的是膠體殼聚糖，以葡萄糖、乳糖、淀粉等作為碳源時(shí)，菌株ZJOU-AC1產(chǎn)酶效果相對(duì)較差。由圖6可知，酶活最高時(shí)對(duì)應(yīng)的膠體殼聚糖濃度為1.5%，此時(shí)測(cè)得菌株ZJOU-AC1酶活為3.28 U/mL，故1.5%為最適碳源濃度。

2.5.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 由表4可知，在硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、氯化銨、酵母粉、蛋白胨6種不同氮源中，硫酸銨和酵母粉的效果較好。但兩者所對(duì)應(yīng)酶活大小相差甚小，綜合經(jīng)濟(jì)成本考慮，選擇硫酸銨為該菌株產(chǎn)酶的最適氮源。由圖7可知，硫酸銨濃度達(dá)到0.4%時(shí)，酶活可達(dá)4.85 U/mL，故0.4%為最適氮源濃度。

3 小結(jié)與討論

國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，殼聚糖有抗菌抑菌、抗腫瘤等功效[13，14]。由降解殼聚糖加工制成的殼寡糖產(chǎn)品在國(guó)外已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、保健食品、農(nóng)林畜牧等領(lǐng)域[15，16]，但中國(guó)尚無(wú)商品化殼寡糖的產(chǎn)品的問(wèn)世。因此，篩選具有高效產(chǎn)殼聚糖酶能力的菌株并進(jìn)一步優(yōu)化其產(chǎn)酶條件顯得至關(guān)重要。

浙江舟山是海洋大省，也是水產(chǎn)加工大省，每年均有大量甲殼素資源無(wú)法合理利用，這些甲殼素資源往往堆積在各海域海灘或一些常年養(yǎng)殖蝦蟹的廠家生產(chǎn)場(chǎng)地附近。由于海洋中蘊(yùn)含的甲殼素資源極其豐富，因此，在長(zhǎng)期的能量代謝、循環(huán)利用以及生物進(jìn)化過(guò)程中，必然會(huì)產(chǎn)生很多獨(dú)特的降解殼聚糖的菌種，這些菌種分布在海域海灘及山坡的可能性較大[7]。因此，本研究從海灘以及一些毗鄰常年養(yǎng)殖蝦蟹的廠家生產(chǎn)場(chǎng)地附近的山坡采樣。

本研究以膠體殼聚糖為碳源才能誘導(dǎo)菌株ZJOU-AC1高效產(chǎn)酶，在此條件下測(cè)得菌株ZJOU-AC1酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以葡萄糖、乳糖、淀粉等作為碳源時(shí)所測(cè)得的酶活，說(shuō)明該菌為較專一的殼聚糖酶降解菌，且其所產(chǎn)殼聚糖酶為誘導(dǎo)酶，這與康立新等[17]的報(bào)道基本一致。

已報(bào)道的能產(chǎn)殼聚糖酶的微生物種類較多，包括細(xì)菌（Bacillus[18]、Pseudomonas[19]、Arthrobacter[20]、Sphingomon[21]），放線菌（Keratanolyticum[22]），霉菌（Penicillium[23]、 Aspergillus[24]）等，但其中能高效產(chǎn)殼聚糖酶的菌株較少。如閻賀靜等[25]在其研究中篩選所得煙曲霉（Aspergillus fumigatus）經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后最高酶活力為3.1 U/mL，尹愛(ài)國(guó)等[2]在其研究中篩選所得菌株經(jīng)發(fā)酵條件初步優(yōu)化后酶活為0.272 U/mL。本研究篩選所得的鹿皮色曲霉（Aspergillus cervinus），經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，酶活力從最初的2.05 U/mL提高到4.85 U/mL，達(dá)優(yōu)化前的2.36倍。由于目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)該菌的相關(guān)報(bào)道，因此，該菌株是高產(chǎn)殼聚糖酶的一個(gè)新菌種，可為高產(chǎn)菌株酶法降解殼聚糖的加工應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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