蘇培森,王 彪,王宏偉,孔令讓,李安飛

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東 泰安 271018

禾谷鐮刀菌對(duì)二穗短柄草的致病性及侵染過(guò)程

蘇培森,王 彪,王宏偉,孔令讓,李安飛*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東 泰安 271018

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌引起的真菌病害，不僅造成小麥的產(chǎn)量損失而且降低小麥的品質(zhì)。為了研究小麥赤霉病II型抗性機(jī)理，作為一種新型的單子葉模式植物，二穗短柄草（Bd21）能夠和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生互作，在正常生長(zhǎng)條件下卻表現(xiàn)相對(duì)抗性表型。本文篩選了禾谷鐮刀菌侵染二穗短柄草穗部的發(fā)病條件，并確認(rèn)了最適發(fā)病條件為28℃,75%濕度。在禾谷鐮刀菌侵染二穗短柄草的早期，分生孢子主要在雌蕊萌發(fā)，然后菌絲迅速生長(zhǎng)并沿子房蔓延至小花的底部，通過(guò)穗軸節(jié)點(diǎn)向下延伸，然而菌絲并沒(méi)有進(jìn)入子房?jī)?nèi)部。另外，當(dāng)禾谷鐮刀菌侵染二穗短柄草的胚芽鞘時(shí)，菌絲可以進(jìn)入胚芽鞘細(xì)胞，向下延展。因此，二穗短柄草可在小麥II型抗性研究中發(fā)揮重要作用。

小麥赤霉病;二穗短柄草;II型抗性

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麥穗部的一種真菌病害，其不僅造成小麥產(chǎn)量降低，而且在小麥籽粒積累脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等真菌毒素，導(dǎo)致小麥品質(zhì)下降[1]。近幾十年來(lái)，由于氣候和耕作的改變，小麥赤霉病頻繁爆發(fā)[2]。小麥赤霉病主要分布于濕潤(rùn)、半濕潤(rùn)地區(qū)。目前中國(guó)的赤霉病主要發(fā)生在長(zhǎng)江中下游流域并且赤霉病發(fā)病區(qū)域有逐漸北移的趨勢(shì)[3-6]。赤霉病在小麥整個(gè)生育期均可發(fā)生，引起苗枯、基莖腐爛和穗枯等癥狀，穗枯癥狀危害尤為重要。根據(jù)寄主對(duì)于赤霉病的抗性類型的差異，主要?jiǎng)澐譃橐韵挛宸N類型：一為抗侵染型（Type I）；二為抗蔓延型（TypeⅡ）；三為抗毒素積累型（TypeⅢ）；四為籽?？垢腥荆═ypeⅣ）；五為耐病型（Type V）[7]。目前研究最為廣泛的為II型抗性。在過(guò)去的一百年，數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）已被廣泛應(yīng)用于小麥抗赤霉病的研究[8]，但對(duì)于病原菌感染過(guò)程分子機(jī)理知之甚少。另外相比其他小麥病害如銹病，白粉病等病害的抗源，普通小麥種內(nèi)可供利用的有效的抗赤霉病基因資源尚欠豐富[9]，這嚴(yán)重限制了小麥赤霉病的研究。

二穗短柄草（Bd21）作為一種廣泛生長(zhǎng)在溫帶的單子葉植物，種質(zhì)資源非常豐富。其植株矮小，易于種植，生命周期短,遺傳轉(zhuǎn)化效率高和基因組小[10]，它已成為理想的用于單子葉植物功能基因組學(xué)研究的模式植物。更重要的是其整個(gè)基因組測(cè)序已于2010年完成[11]。Bd21是二倍體(2 n=2 x= 10)，基因組大小大約272 Mb[11]，介于擬南芥(約119 Mb)和水稻(大約382 Mb)基因組之間[12,13]，并且包含15%的重復(fù)序列[14]。與普通小麥同屬于早熟禾亞科，在進(jìn)化上二穗短柄草與小麥等溫季型禾谷類作物的親緣關(guān)系相比于水稻更為相近[15]，同源性較高。近10余年間來(lái)，隨著對(duì)于二穗短柄草的研究逐漸增多，其T-DNA插入突變體庫(kù)的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立都將促進(jìn)其作為模式植物在功能基因組學(xué)方面的研究[10]。

本研究以二穗短柄草為模式植物探究了小麥與禾谷鐮刀菌之間的互作，確定了對(duì)于小麥赤霉病II型抗性研究的發(fā)病條件，并跟蹤了禾谷鐮刀菌在穗部的侵染過(guò)程。此外，我們對(duì)于二穗短柄草胚芽鞘也進(jìn)行了禾谷鐮刀菌的侵染，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌也可以侵染進(jìn)入胚芽鞘細(xì)胞。這可以為我們研究小麥赤霉病II型抗性提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

二穗短柄草Bd21（Brachypodiam distachyon）；帶有綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）禾谷鐮刀菌菌株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院梁元存副教授提供。GFP禾谷鐮刀菌菌絲在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光，以此用來(lái)觀察菌絲生長(zhǎng)延展情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 禾谷鐮刀菌的培養(yǎng) 將帶有GFP禾谷鐮刀菌菌株移至土豆培養(yǎng)基中，28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3～5 d。將菌絲挑至盛有30 mL左右綠豆湯培養(yǎng)基的三角瓶中振蕩培養(yǎng)，200 rpm，28℃，培養(yǎng)2～3 d，檢測(cè)孢子濃度。

1.2.2 二穗短柄草穗部禾谷鐮刀菌的接種 在二穗短柄草開(kāi)花期采用單花滴注的方法接種小穗部基部單個(gè)小花，接種2 μL禾谷鐮刀菌菌液（濃度為每毫升5～10×105個(gè)），分別置于不同溫度25℃，28℃和不同濕度40%，75%的培養(yǎng)箱發(fā)病，在3 d，6 d和10 d通過(guò)熒光顯微鏡觀察禾谷鐮刀菌在二穗短柄草穗部的發(fā)病情況。

1.2.3 二穗短柄草胚芽鞘禾谷鐮刀菌的接種 二穗短柄草種子發(fā)芽3～5 d，將胚芽鞘的頂端剪掉1 mm左右，然后于傷口的橫截面上套上經(jīng)GFP禾谷鐮刀菌菌液浸潤(rùn)的濾紙（禾谷鐮刀菌濃度為每亳升5～10×105個(gè)），置于相對(duì)濕度為85%的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)（28℃光照16 h，18℃黑暗8 h）。在GFP禾谷鐮刀菌接種后的1 d、6 d和12 d通過(guò)熒光顯微鏡觀察菌絲在胚芽鞘內(nèi)部的侵染。

2 結(jié)果與分析

2.1 二穗短柄草赤霉病最適發(fā)病條件

采用單花滴注的方法探究了在不同條件下二穗短柄草小穗感染禾谷鐮刀菌情況。我們發(fā)現(xiàn)在在25℃或28℃，濕度40%，發(fā)病3 d，在接菌小花出現(xiàn)褐色病斑,但發(fā)病較輕。保持25℃或28℃，濕度75%的條件下，禾谷鐮刀菌已經(jīng)蔓延整個(gè)接菌小花，開(kāi)始向鄰近小花延展。當(dāng)接種6 d，在高濕環(huán)境下，菌絲會(huì)明顯向上延展，約1/2小穗發(fā)生褐色病癥。當(dāng)侵染10 d之后，28℃，濕度75%，菌絲會(huì)延展至整個(gè)小穗（圖1）。對(duì)比不同發(fā)病條件下，禾谷鐮刀菌在穗部的發(fā)病情況，最后發(fā)現(xiàn)在28℃，濕度75%為比較合適的發(fā)病條件。

圖1 不同溫度和濕度環(huán)境下禾谷鐮刀菌在二穗短柄草穗部的侵染Fig.1 Fusarium graminearum against Brachypodium distachyon(Bd)spikes under different humidity and temperature

2.2 禾谷鐮刀菌侵染二穗短柄草穗部過(guò)程

在侵染早期，我們觀察了禾谷鐮刀菌在小花內(nèi)的侵染進(jìn)程。接菌24 h后，通過(guò)觀察，我們發(fā)現(xiàn)孢子已經(jīng)完成萌發(fā)，菌絲由柱頭延展至子房。接菌24～48 h，菌絲蔓延至小花基部，整個(gè)子房完全壞死（圖2）。通過(guò)熒光顯微鏡觀察子房，發(fā)現(xiàn)菌絲僅僅沿子房表面延展，而子房?jī)?nèi)部并沒(méi)有菌絲（圖3A）。當(dāng)菌絲侵染完整個(gè)接種小花之后，我們調(diào)查了禾谷鐮刀菌在鄰近小花間的侵染方式，切開(kāi)穗軸，發(fā)現(xiàn)在穗軸內(nèi)并沒(méi)有綠色熒光，而在鄰近小花表面發(fā)現(xiàn)綠色熒光，因此禾谷鐮刀菌菌絲通過(guò)侵染鄰近小花表面侵染進(jìn)入鄰近小花，卻并沒(méi)有通過(guò)穗軸（圖3B，圖4）。

圖2 侵染早期，禾谷鐮刀菌在二穗短柄草穗小花的侵染Fig.2 Fusarium graminearum against Brachypodium distachyon spikes at early stage

圖3 二穗短柄草子房和小穗穗軸觀察Fig.3 Observation on ovary and rachis in BdA.子房觀察 (a～c)Observation on ovary;B.小穗穗軸觀察 (a,b)Observation on rachis。比例尺：500μm。Scale:500μm

圖4 禾谷鐮刀菌在二穗短柄草穗部的侵染Fig.4 The processes of Fusarium graminearum against Brachypodium distachyon spikes

2.3 二穗短柄草、小麥及大麥禾谷鐮刀菌侵染模式對(duì)比

將二穗短柄草禾谷鐮刀菌侵染模式與小麥、大麥侵染模式作了比較。接種小麥，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌在接種小花發(fā)病后，菌絲會(huì)通過(guò)穗軸侵染鄰近小花。相比之下，當(dāng)大麥接種禾谷鐮刀菌之后，菌絲在接種小花發(fā)病之后，并不會(huì)通過(guò)穗軸侵染鄰近小花，而是直接在穗軸表面延展，侵染鄰近小花（圖5a，b）[16]。我們發(fā)現(xiàn)二穗短柄草在接種禾谷鐮刀菌之后，在小穗內(nèi)部菌絲不會(huì)通過(guò)穗軸而是沿著表面侵染至鄰近小花（圖3C，圖4B），而在穗基部節(jié)點(diǎn)菌絲則會(huì)侵染至穗軸內(nèi)部，然后向下侵染。（圖5C）。

圖5 二穗短柄草、小麥及大麥禾谷鐮刀菌侵染模式比較Fig.5Comparisonof infectedmodelsamongFusariumgraminearumagainstBrachypodiumdistachyon,wheat and barley

2.4 禾谷鐮刀菌侵染二穗短柄草胚芽鞘

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們觀察了禾谷鐮刀菌在短柄草胚芽鞘的侵染方式。首先我們借鑒了小麥胚芽鞘研究方法[17]。將生長(zhǎng)3 d左右的二穗短柄草幼苗頂端剪去1 mm，套上經(jīng)GFP禾谷鐮刀菌菌液浸潤(rùn)的濾紙（圖6A）。在接種不同時(shí)間，通過(guò)熒光顯微鏡觀察了菌絲在胚芽鞘內(nèi)的侵染。當(dāng)接種1天后，我們發(fā)現(xiàn)孢子已經(jīng)萌發(fā)并侵染至胚芽鞘內(nèi)部。當(dāng)接種6 d后，菌絲進(jìn)一步侵染，并且菌絲在胚芽鞘細(xì)胞內(nèi)完成橫向侵染。當(dāng)接種12 d后，菌絲侵染至整個(gè)胚芽鞘（圖6B）。

圖6 禾谷鐮刀菌在二穗短柄草胚芽鞘中的侵染Fig.6 Fusarium graminearum against Brachypodium distachyon in coleoptiles

3 討論

近十幾年，二穗短柄草作為一種新型的單子葉模式植物其研究工作經(jīng)歷由緩慢到快速的一個(gè)過(guò)程。二穗短柄草基因組測(cè)序完成，突變體庫(kù)逐漸完善以及遺傳轉(zhuǎn)化的日漸成熟使其被用于作物功能基因組學(xué)的研究[10,15,18,19]。赤霉病作為小麥主要的病害之一，禾谷鐮刀菌與小麥之間的互作機(jī)理并沒(méi)有被明確解釋。一般認(rèn)為，在開(kāi)花期，禾谷鐮刀菌是通過(guò)穎殼之間的空隙進(jìn)入到小穗內(nèi)部[20]。在侵染6～12 h，禾谷鐮刀菌已經(jīng)開(kāi)始萌發(fā)。在侵染12～24 h，禾谷鐮刀菌在穎殼內(nèi)開(kāi)始形成初步的菌絲網(wǎng)[21]。侵染48 h，禾谷鐮刀菌的菌絲開(kāi)始爆發(fā)增長(zhǎng)，并由寄生生長(zhǎng)開(kāi)始轉(zhuǎn)為腐生型侵染。對(duì)于禾谷鐮刀菌與二穗短柄草的互作已經(jīng)有所研究[15]。在二穗短柄草小花內(nèi)，當(dāng)我們接種禾谷鐮刀菌0～24 h，孢子已經(jīng)完成萌發(fā)，經(jīng)柱頭蔓延至子房。在接種48 h，菌絲已經(jīng)蔓延至整個(gè)接種小花。這和禾谷鐮刀菌在小麥小花內(nèi)侵染模式是非常相似的，但是禾谷鐮刀菌并沒(méi)有侵染進(jìn)入二穗短柄草的子房?jī)?nèi)，這與小麥侵染方式存在差別。關(guān)于小麥赤霉病的抗性研究主要集中在II型抗性[22]。通過(guò)單花滴注的方法用來(lái)評(píng)價(jià)小麥II型抗性[23]。我們通過(guò)此方法接種二穗短柄草，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌孢子在小花內(nèi)萌發(fā)后快速通過(guò)子房侵染整個(gè)小花，然后沿著小穗內(nèi)穗軸侵染鄰近的小花，菌絲并沒(méi)有進(jìn)入小穗內(nèi)穗軸，這與禾谷鐮刀菌在大麥中侵染模式相似[16]。而在小麥中菌絲在小花發(fā)病后，穿過(guò)穗軸侵染鄰近的小花，但是當(dāng)我們接種二穗短柄草小穗最下端小花，菌絲可以通過(guò)穗軸節(jié)點(diǎn)向下傳染。因此，我們認(rèn)為以此可以作為評(píng)價(jià)II型抗性的標(biāo)準(zhǔn)。

之前有人報(bào)道了小麥胚芽鞘接種禾谷鐮刀菌作為赤霉病致病性鑒定的一種方法的可行性[17]。我們參照此方法并作了調(diào)整，接種短柄草胚芽鞘。我們發(fā)現(xiàn)，短柄草胚芽鞘和禾谷鐮刀菌是可以產(chǎn)生互作，并且在第一天菌絲已經(jīng)侵染進(jìn)胚芽鞘，引起胚芽鞘正常發(fā)病，產(chǎn)生黃色或褐色的病斑，并且其侵染進(jìn)程和方式與小麥非常相似[24]。但是具體的二穗短柄草與禾谷鐮刀菌之間的互作模式以及是否可以作為小麥赤霉病II型抗性研究的一種評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究以模式植物二穗短柄草為研究對(duì)象，跟蹤調(diào)查禾谷鐮刀菌在二穗短柄草穗部和胚芽鞘的侵染模式，探究了二穗短柄草與禾谷鐮刀菌的互作方式，為小麥赤霉病II型抗性研究提供了支持。

[1]Bai G,Shaner G.Management and resistance in wheat and barley to Fusarium head blight[J].Annu.Rev.Phytopathol, 2004,42:135-161

[2]Miller D.DON-past,present and future.National Fusarium Head Blight Forum.2012

[3]Bai G,Kolb FL,Shaner G,et al.Amplified fragment length polymorphism markers linked to a major quantitative trait locus controlling scab resistance in wheat[J].Phytopathology,1999,89(4):343-348

[4]程順和,張 勇,張伯橋,等.控制小麥赤霉病流行的主要因素分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2003,19(1):55-58

[5]張凱鳴,馬鴻翔,陸維忠,等.小麥赤霉病與DON積累的抗性及其相關(guān)SSR位點(diǎn)差異[J].作物學(xué)報(bào),2006,32(12):1788-1795

[6]McMullen M,Jones R,Gallemberg D.Scab of wheat and barley:a re-emerging disease of devastating impact[J].Plant Disease,1997,81:1340-1348

[7]Patricia AC,Daryl JS,Julian T,et al.Fine mapping Fhb1,a major gene controlling fusarium head blight resistance in bread wheat(Triticum aestivum L.)[J].TheorEtical andApplied Genetics,2006,112:1465-1472

[8]Buerstmayr H,Ban T,Anderson JA.QTL mapping and marker-assisted selection for Fusarium head blight resistance in wheat:a review[J].Plant breeding,2009,128(1):1-26

[9]劉光欣,陳佩度,周 波,等.小麥-大賴草易位系對(duì)赤霉病抗性的聚合[J].麥類作物學(xué)報(bào),2006,26(3):34-40

[10]李海峰,孫其信.模式植物短柄草研究新進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2012,32(3):633-638

[11]Vogel JP,Garvin DF,Mockler TC,et al.Genome sequencing and analysis of the model grass Brachypodium distachyon[J].Nature,2010,463(7282):763-768

[12]Thole V,Alves SC,Worland B,et al.A protocol for efficiently retrieving and characterizing flanking sequence tags (FSTs)in Brachypodium distachyon T-DNAinsertional mutants[J].Nature protocols,2009,4(5):650-661

[13]Garvin DF.Brachypodium:a new monocot model plant system emerges[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2007,87(7):1177-1179

[14]Catalán P,Shi Y,Armstrong L,et al.Molecular phylogeny of the grass genus Brachypodium P.Beauv.based on RFLP and RAPD analysis[J].Botanical Journal of the Linnean Society,1995,117(4):263-280

[15]Draper J,Mur LAJ,Jenkins G,et al.Brachypodium distachyon.A new model system for functional genomics in grasses[J].Plant Physiology,2001,127:1539–1555

[16]Carin J,Diter W,Wilhelm S,et al.Infection patterns in barley and wheat spikes inoculated with wild-type and trichodiene synthase gene disrupted Fusarium graminearum[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica PNAS,2005,46(102):16892–16897

[17]Wu AB,Li HP,Zhao CS,et al.Comparative pathogenicity of Fusarium graminearum isolates from China revealed by wheat coleoptile and floret inoculations[J].Mycopathologia,2005,160:75–83

[18]Opanowicz M,Vain P,Draper J,et al.Brachypodium distachyon:making hay with a wild grass[J].Trends in Plant Science,2008,13:1360–1385

[19]Mur LAJ,Allainguillaume J,Catalan P,et al.Tansley review:exploiting the brachypodium toolbox in cereal and grass research[J].New Phytologist,2011,191:334–347

[20]Lewandowski SM,Bushnell WR,Evans CK.Distribution of mycelial colonies and lesions in field-grown barley inoculated with Fusarium graminearum[J].Phytopathology,2006,96(6):567-581

[21]Kang Z,Buchenauer H.Cytology and ultrastructure of the infection of wheat spikes by Fusarium culmorum[J]. Mycological Research,2000,104(9):1083-1093

[22]Schroeder HW,Christensen JJ.Factors affecting resistance of wheat to scab caused by Gibberella zeae[J]. Phytopathology,1963,53:831-838

[23]Parry DW,Jenkinson P,McLeod L.Fusarium ear blight(scab)in small grain cereals-a review[J].Plant Pathology, 1995,44:207-238

[24]Zhang XW,Jia LJ,Zhang Y,et al.In planta stage-specific fungal gene profiling elucidates the molecular strategies of Fusarium graminearum growing inside wheat coleoptiles[J].The Plant Cell,2012,24(2):5159-5176

Pathogenicity and Infection Process of Fusarium graminearum against Brachypodium distachyon

SU Pei-sen,WANG Biao,WANG Hong-wei,KONG Ling-rang,LIAn-fei*
College of Agronomy/Shandong Agricultural University,Taian 271018,China

Fusarium head blight(FHB)of wheat is mainly caused by Fusarium graminearum.It results in yield reduction and deteriorates seed quality.As a new monocotyledonous model plant,Brachypodium distachyon(Bd21)is able to interact with F.graminearum but often shows relatively resistant phenotype at normal growth condition.In this paper,we studied the progress of F.graminearum against B.distachyon 21 spikes at different conditions and confirmed the optimal condition for type II resistance evaluation at 28℃,75%humidity.In the early stage of F.graminearum infection of B.distachyon,the spores mainly germinated on pistil,then the hyphae quickly moved to ovary and extended to the bottom of the floret and entered into spikes nodes,extending down along the rachis.In addition,when F.graminearum infected the coleoptile of B. distachyon,hyphae can enter the coleoptile cells and stretch downward.B.distachyon can play an important role in the study of wheat type II resistance.

Fusarium head blight;Brachypodium distachyon;type II resistance

S51

:A

:1000-2324(2017)03-0379-05

2016-10-07

:2016-10-11

蘇培森(1989-),男,碩士研究生,主要從事作物分子遺傳育種工作.E-mail:pssu2014@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:lianfei@sdau.edu.cn