湯江泉+張毅

【摘要】 目的 研究補(bǔ)腎益氣方對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞p16基因表達(dá)的的影響。方法 24只健康雄性SD大鼠， 隨機(jī)分為中藥組（補(bǔ)腎益氣方灌胃）、黃芪組（黃芪水煎液灌胃）、生理鹽水組（生理鹽水灌胃）， 各8只。提取含藥血清， 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株， 采用β-半乳糖苷酶（β-gal）染色鑒定細(xì)胞衰老；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化， 用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 方法檢測(cè)p16基因的表達(dá)。結(jié)果 中藥組、黃芪組G0/G1期細(xì)胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理鹽水組（79.56±2.88）%， 中藥組G0/G1期細(xì)胞比例小于黃芪組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。中藥組、黃芪組mRNA灰度值/β-肌動(dòng)蛋白（β-actin） 灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理鹽水組（0.5126±0.0110）， 中藥組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黃芪組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。結(jié)論 補(bǔ)腎益氣方具有延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用， 其分子機(jī)制可能通過調(diào)控p16的表達(dá)使細(xì)胞周期停滯于G1 期發(fā)揮作用， 具有一定參考價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 補(bǔ)腎益氣方；血管內(nèi)皮細(xì)胞；p16基因；中藥

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.14.111

【Abstract】 Objective To study the impact of Bushen Yiqi prescription on p16 gene expression in vascular endothelial cells of rats. Methods A total of 24 healthy male SD rats were randomly divided into traditional Chinese medicine group （gavage of Bushen Yiqi prescription）， astragalus group （gavage of astragalus water decoction） and normal saline group （gavage of normal saline）， with 8 rats in each group. Drug-containing serum was extracted to cultivate human umbilical vein endothelial cell strain， and β- galactosidase （β-gal） dyeing was used to identify cell aging. Cell cycle changes was analyzed by flow cytometry， and p16 gene expression was detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results The traditional Chinese group and astragalus group had G0/G1 phase cell proportion as （63.18±1.07） and （71.73±1.32）%， which were less than （79.56±2.88）% in normal saline group， and the traditional Chinese group had less G0/G1 phase cell proportion than astragalus group. Their difference had statistical significance （P<0.05）. The traditional Chinese group and astragalus group had mRNA gray value/β-actin gray value ratio as （0.1231±0.0064） and （0.1835±0.0057）， which were less than （0.5126±0.0110） in normal saline group， and the traditional Chinese group had less mRNA gray value/β-actin gray value ratio than astragalus group. Their difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion Bushen Yiqi prescription plays a role in delaying vascular endothelial apoptosis， and its molecular mechanism may regulate the expression of p16 to stagnate the cell cycle at G1 phase， along with certain reference value.

【Key words】 Bushen Yiqi prescription； Vascular endothelial cells； p16 gene； Traditional Chinese medicine

相關(guān)臨床資料表示， 出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化或者是心血管事件發(fā)生情況的危險(xiǎn)因素一般為年齡增長(zhǎng)， 而隨著人們的年齡逐漸增長(zhǎng)， 自身的機(jī)能也會(huì)逐漸的變化， 出現(xiàn)較多的血管衰老等現(xiàn)象， 而為了能夠研究血管內(nèi)皮細(xì)胞所實(shí)施的凋亡一般是我國(guó)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病理生理的一種機(jī)制， 也算是出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的因素[1， 2]。本文研究中， 作者主要觀察大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞是否會(huì)出現(xiàn)凋亡作用， 并將其試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 詳情如下。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 藥物 補(bǔ)腎益氣方， 藥方組成：熟地20 g、山茱萸20 g、補(bǔ)骨脂15 g、白參15 g、枸杞子15 g、淫羊藿15 g、黃芪30 g。

1. 1. 2 試劑與儀器 流式細(xì)胞儀FACScan（BD公司， 美國(guó)）、GeneAmpPCRSystem9700 擴(kuò)增儀（PE公司， 美國(guó)）、UVP凝膠成像及分析系統(tǒng)（UVP公司， 英國(guó)）。

1. 1. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取24只健康雄性SD大鼠， 體重為（200±10）g。

1. 1. 4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（ATCC公司）。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 實(shí)驗(yàn)分組 將24只健康雄性SD大鼠通過動(dòng)態(tài)化隨機(jī)分組的方法分為中藥組（補(bǔ)腎益氣方灌胃）、黃芪組（黃芪水煎液灌胃）、生理鹽水組（生理鹽水灌胃）， 各8只。分別給予三組大鼠實(shí)施所在組別的治療方法， 2次/d ， 共治療8 d。接著取出大鼠的腹主動(dòng)脈血液， 將其存放在已經(jīng)高溫消毒后的玻璃管里， 然后對(duì)其進(jìn)行離心， 取出上清液， 接著凍存、管裝， 在冰箱中保存， 進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)對(duì)其進(jìn)行30 min滅活處理。

1. 2. 2 細(xì)胞培養(yǎng) 將培養(yǎng)基中的血清在培養(yǎng)箱中逐漸的進(jìn)行培養(yǎng)， 需要時(shí)刻觀察其情況， 在第2～3天需要密切對(duì)其進(jìn)行換液培養(yǎng)， 從而進(jìn)一步維持一個(gè)較為良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。然后將三組已經(jīng)采集后的血清分別放進(jìn)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

1. 2. 3 細(xì)胞周期測(cè)定 將三組的細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化， 之后將其進(jìn)行收集。

1. 2. 4 RT-PCR方法測(cè)定p16基因mRNA表達(dá) 對(duì)三組一般選用第56代作為衰老細(xì)胞凍存細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 細(xì)胞周期 中藥組、黃芪組G0/G1期細(xì)胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理鹽水組（79.56±2.88）%， 中藥組G0/G1期細(xì)胞比例小于黃芪組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。見表1。

2. 2 p16基因表達(dá) 中藥組、黃芪組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理鹽水組（0.5126±0.0110）， 中藥組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黃芪組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。見表2。

3 討論

相關(guān)臨床資料表示[3， 4]， 人們總會(huì)隨著時(shí)間的變化導(dǎo)致自身機(jī)體出現(xiàn)衰老的現(xiàn)象， 而衰老也是臨床各種系統(tǒng)性生理性的一種表現(xiàn)， 當(dāng)患者的年齡出現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的現(xiàn)象后， 其會(huì)出現(xiàn)較多老年疾病， 同時(shí)患者自身的心血管疾病的發(fā)生幾率也會(huì)逐漸上升。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是患者自身血管內(nèi)側(cè)中較多的一種多功能細(xì)胞， 主要是能夠起到促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的作用， 而我國(guó)現(xiàn)今臨床一直在采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行研究， 主要是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究將研究的情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 之后再根據(jù)研究的結(jié)果進(jìn)行判斷[5， 6]。

p16基因是一種細(xì)胞周期中的基本基因， 可以在一定的程度上有效抑制細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合， 還能夠使得細(xì)胞分裂逐漸出現(xiàn)減少的現(xiàn)象， 進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增值效應(yīng)， 效果較佳。相關(guān)臨床資料表示[7， 8]， 當(dāng)p16基因出現(xiàn)了衰老表型， 那么就表示p16基因是一種細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵調(diào)控基因， 而p16蛋白會(huì)成為調(diào)控的中心環(huán)節(jié)， 從而在一定的程度上抑制細(xì)胞增殖且引起患者出現(xiàn)細(xì)胞衰老的變化情況。

隨著社會(huì)的發(fā)展以及臨床醫(yī)學(xué)的逐漸變化， 臨床上的中醫(yī)藥對(duì)于衰老也取得了一定的臨床研究數(shù)據(jù)， 較多學(xué)者認(rèn)為， 人的機(jī)體會(huì)出現(xiàn)衰老現(xiàn)象， 其主要是因?yàn)榛颊叩闹袎鄱M與瘀血內(nèi)阻具有一定的關(guān)系， 在患者出現(xiàn)腎陰虛血少的情況下， 導(dǎo)致陰血不足， 很有可能會(huì)出現(xiàn)血瘀的情況， 從而加速患者出現(xiàn)衰老的現(xiàn)象[9， 10]。

本文研究結(jié)果表示， 中藥組、黃芪組G0/G1期細(xì)胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理鹽水組（79.56±2.88）%， 中藥組G0/G1期細(xì)胞比例小于黃芪組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。中藥組、黃芪組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理鹽水組（0.5126±0.0110）， 中藥組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黃芪組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。表明黃芪組能夠有效延緩細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象， 從而起到一定的研究效果， 同時(shí)， 從本文研究結(jié)果中還可以看出， 采用補(bǔ)腎益氣中藥遠(yuǎn)遠(yuǎn)要比黃芪的作用更加的明顯。

綜上所述， 補(bǔ)腎益氣方可以有效延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況， 在一定的程度上能夠發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用， 具有一定的參考價(jià)值。

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[收稿日期：2016-12-12]