李乾豪，仉紅剛，張秋菊，修瑞娟

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所 衛(wèi)生部微循環(huán)重點實驗室，北京100730)

高血壓伴肥胖患者血漿CD31+/CD42b+血小板來源微泡研究

李乾豪，仉紅剛*，張秋菊，修瑞娟

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所 衛(wèi)生部微循環(huán)重點實驗室，北京100730)

目的 對高血壓伴肥胖患者血漿中CD31+/ CD42b+表型的血小板來源微泡進(jìn)行研究和分析。方法 本研究共計招募29例高血壓患者，其中19例為高血壓不伴肥胖；10例為高血壓伴肥胖；采用分步離心法分離制備血小板微泡，以小鼠抗人CD42b-FITC，小鼠抗人CD31-PE，小鼠IgG1-PE/k同型對照和小鼠IgG1-FITC/k同型對照進(jìn)行血小板微泡流式細(xì)胞術(shù)分析，采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量數(shù)據(jù)是正態(tài)分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗法；不是正太分布的數(shù)據(jù)采用百分位法表示，并通過LG轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗及非參數(shù)分析中的Mann-Whitney U檢驗法。計數(shù)資料采用卡方檢驗。血小板微粒和臨床各參數(shù)之間的相關(guān)性采用多元線性回歸分析。結(jié)果 高血壓不伴肥胖組的患者年齡及高密度脂蛋白(HDL)明顯高于高血壓伴肥胖組，而甘油三酯與高密度脂蛋白比值(TG/HDL)顯著低于高血壓伴肥胖組；CD31+/42b+血小板微粒(PMPs)在高血壓伴肥胖癥患者的外周血中的數(shù)量(154.9±216.2)明顯高于高血壓不伴肥胖患者(14.7±17.24，P=0.003)；血小板微粒的數(shù)量與患者年齡、性別和其他臨床參數(shù)包括BMI、收縮壓/舒張壓、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)和血小板(PLT)水平無顯著相關(guān)性，與高密度脂蛋白(HDL)和血脂指數(shù)包括TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C、log(TG/HDL-C)顯著相關(guān)。結(jié)論 血小板微泡水平與HDL-C水平及血脂指數(shù)呈顯著的相關(guān)性，血小板微泡是一個潛在的高血壓伴肥胖的標(biāo)記物，同時也是可以用來預(yù)測冠心病(CAD)風(fēng)險的生物標(biāo)記物，為臨床診斷和治療肥胖癥及高血壓提供新的思路。

高血壓；肥胖；血小板激活；血小板來源的微泡；冠心病

(ChinJLabDiagn,2017,21:0935)

有很大比例的高血壓患者伴有肥胖[1]，肥胖與高血壓的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓患者和肥胖患者中均有血小板來源的微泡(platelet microparticles ，PMPs)的增高[3,4]，PMP有可能是聯(lián)系肥胖和高血壓及發(fā)生冠心病(CAD)的重要機制分子，但至今在高血壓伴肥胖患者中PMP的水平情況尚未見報道。為此，本文對高血壓伴肥胖患者血漿中CD31+/ CD42b-表型的PMP進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 對象與分組

本研究共計招募29例高血壓患者，其中19例為高血壓不伴肥胖；10例為高血壓伴肥胖。本研究高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)為收縮壓/舒張壓≥140/90 mmHg，并且排除繼發(fā)性高血壓及以下病史的患者：慢性炎癥史；慢性腎功能衰竭需要透析；肝臟或血液學(xué)疾病；自身免疫性疾病或腫瘤疾病；外周血管性疾病或呼吸系統(tǒng)性疾病等。肥胖診斷標(biāo)準(zhǔn)為：基于身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)，根據(jù)中國衛(wèi)生部提出的BMI(kg/m2)分類標(biāo)準(zhǔn)：正常：18.5-23.9；超重：24-27.9；肥胖：≥28。上述病例研究均經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所倫理委員會批準(zhǔn)，并獲患者知情同意。

1.2 實驗儀器

微量移液器(Gilson,France)，-80℃超低溫冰箱(Thermo Fisher)，臺式離心機(Thermo Fisher Scientific)，振蕩器(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司)，流式細(xì)胞儀(Accuri C6,BD)。

1.3 實驗試劑

0.8 μm微珠標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,St.Louis,MO)，小鼠抗人CD42b-FITC(BD)，小鼠抗人CD31-PE(BD)，小鼠IgG1-PE/k同型對照(BD)，小鼠IgG1-FITC/k同型對照(BD)。

1.4 實驗方法和步驟

1.4.1 每個患者取外周血樣本3 ml，注入被枸緣酸鈉處理過的一次性抗凝管中。

1.4.2 獲取樣本后1 h內(nèi)離心提取血小板貧瘠血漿，離心條件：a.在16℃條件下,1 500 g離心10 min，去除血細(xì)胞，獲得富含血小板的血漿，移入1.5 ml的EP管中；b.在4℃條件下,13,000 g離心10 min，去除血小板，獲得血小板貧瘠血漿，移入另一1.5 ml的EP管中，將EP管裝入帶有編號的冷凍盒中，-80℃保存待測。

1.4.3 從-80℃中取出本研究所有的樣本，一次性凍融后，從每個樣品中各取50 μl血小板貧瘠血漿，分別加入4 μl小鼠抗人CD42b-FITC(BD)和小鼠抗人CD31-PE(BD)；再從每個樣本另各取50 μl血漿，分別加入4 μl小鼠IgG1-PE/k同型對照(BD)和小鼠IgG1-FITC/k同型對照(BD)做為同型對照。室溫下避光孵育20 min。最后各管中再加入1 ml經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾的PBS稀釋。一次凍融不影響微粒的檢測。

1.4.4 取直徑為0.8 μm標(biāo)準(zhǔn)大小聚苯乙烯微珠1 μl，溶于1 ml的ddH2O中，在振蕩器上振蕩混勻，作為內(nèi)參來確定微粒的大小。

1.4.5 AccuriC6流式細(xì)胞儀上機檢測：通過0.8 μm微珠在散點圖中集中分布區(qū)域左下側(cè)圈門來確定微粒的大小，結(jié)合血小板微粒相應(yīng)的表面抗原來對樣品管中落在該門內(nèi)的微粒計數(shù)以定量PMPs；以同型對照管中微粒在單參數(shù)或雙參數(shù)圖中的分布劃定線性門，并根據(jù)同型抗體來確定PMPs的百分率，在雙參數(shù)時并進(jìn)行相應(yīng)的熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)。PMPs被定義為CD31+/42b+。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量數(shù)據(jù)是正態(tài)分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗法；不是正太分布的數(shù)據(jù)采用百分位法表示，并通過LG轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗及非參數(shù)分析中的Mann-Whitney U檢驗法。計數(shù)資料采用卡方檢驗。血小板微粒和臨床各參數(shù)之間的相關(guān)性采用多元線性回歸分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 高血壓組及高血壓伴肥胖組臨床參數(shù)比較

如表1所示，高血壓不伴肥胖組的患者年齡及高密度脂蛋白(HDL)明顯高于高血壓伴肥胖組，而TG/HDL顯著低于高血壓伴肥胖組；其他臨床參數(shù)無顯著差異。高血壓伴肥胖和高血壓不伴肥胖患者血漿中PMP的流式分析見圖1所示。

表1 患者臨床數(shù)據(jù)

圖1 高血壓伴肥胖和高血壓不伴肥胖患者血漿中PMP的流式分析

2.2 高血壓患者伴與不伴肥胖癥患者外周血中血小板微粒水平比較

統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，CD31+/42b+PMPs在高血壓并有肥胖癥患者的外周血中的數(shù)量明顯高于單純高血壓患者(P=0.003)，結(jié)果見表1。

2.3 血小板微粒和臨床參數(shù)的相關(guān)性分析

用多元線性回歸模型來分析患者的年齡及性別與CD31+/42b+PMPs之間的相關(guān)性。分析結(jié)果顯示，血小板微粒的數(shù)量與患者年齡、性別和其他臨床參數(shù)包括BMI、收縮壓/舒張壓、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)和血小板(PLT)水平無顯著相關(guān)性，與高密度脂蛋白(HDL)和血脂指數(shù)包括TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C、log(TG/HDL-C)顯著相關(guān)，如表2所示。

表2 血小板微粒與各臨床參數(shù)之間的相關(guān)性

3 討論

PMPs是在血小板激活過程中產(chǎn)生的一種微泡狀結(jié)構(gòu)，在外周血細(xì)胞微?？偭恐兴急壤蛇_(dá)70%-90%[5]，是外周血中存在的主要的細(xì)胞微粒。肥胖癥與血小板激活相關(guān)，在肥胖癥患者中瘦素、vWF(von Willebrand factor)以及尿酸等與血小板活化相關(guān)[6]。本研究首次探索了外周血血小板微粒與高血壓伴肥胖癥之間的關(guān)系。研究中我們發(fā)現(xiàn)在高血壓伴肥胖患者外周血中血小板微粒水平明顯高于高血壓不伴肥胖患者。

本研究補充并延伸了Csongradi等人的研究結(jié)果[7]。Csongradi等人的研究發(fā)現(xiàn)PMPs在有危險因素(高血壓和/或2型糖尿病和/或血脂異常)人群中數(shù)量更高，但這并沒有直接說明PMPs在高血壓伴肥胖患者中的數(shù)量情況。本文的研究結(jié)果顯示PMPs在高血壓伴肥胖中顯著增高。

PMPs在血栓形成和炎癥過程中也發(fā)揮著重要的作用，從而進(jìn)一步影響冠心病的發(fā)生發(fā)展[8]。研究[9，10]發(fā)現(xiàn)肥胖癥與集體脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，尤其是HDL-C的降低及血脂指數(shù)(TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C)的升高，這些血脂指數(shù)，特別是TG/HDL-C，與冠心病(CAD)風(fēng)險密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在高血壓伴肥胖患者血漿中的HDL-C水平顯著低于高血壓不伴肥胖患者，而血脂指數(shù)則有升高，特別是TG/HDL-C則顯著高于高血壓不伴肥胖患者。同時，PMPs水平與HDL-C水平及血脂指數(shù)呈顯著的相關(guān)性。因此，本研究結(jié)果能夠進(jìn)一步說明肥胖是CAD的危險因子之一。

另有研究[11]顯示，PMPs可以降低內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(NO)的生物利用度，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。因此，本結(jié)果也提示肥胖可能進(jìn)一步加速高血壓的發(fā)生和發(fā)展，肥胖和高血壓更加增加了CAD的風(fēng)險。綜上所述，PMPs是一個高血壓伴肥胖的血漿標(biāo)記物，也是可用來預(yù)測CAD風(fēng)險的標(biāo)記物，為臨床診斷和治療肥胖癥及高血壓提供新的診治思路。

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Study of CD31+/ CD42b+PMPs in hypertension with obesity

LIQian-hao,ZHANGHong-gang,ZHANGQiu-ju,etal.

(InstituteofMicrocirculation,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China;KeyLabofMicrocirculation,NationalHealthandFamilyPlanningCommission,China)

Objective Aim to assess the level of plasma CD42b+PMPs in hypertension patients with obesity to find a platelet biomarker that links obesity and hypertension.Methods 29 hypertension patients,including 19 hypertension patients without obesity and 10 hypertension patients with obesity.Step by step centrifugation was used to prepare PMPs,and flow cytometry was used to analysis PMPs .Using SPSS17.0 statistical software,measuring data is to use mean + standard deviation of the normal distribution,data comparison between the two groups using independent sample t test; Not fall,according to data by percentile method and by LG is converted to a normal distribution,data comparison between the two groups using independent sample t test and the parameter analysis of the Mann - Whitney U test.Count data by chi-square test.Multiple linear regression was applied to evaluate between CD31+/CD42b+PMP and clinical variables.Results Number of CD31+/CD42b+PMPs in hypertension patients with obesity was significantly higher than hypertension patients without obesity(P=0.003).Mean HDL-C in hypertension with obesity was significantly lower than in hypertension without obesity.CD31+/CD42b+PMPs was significantly correlation with HDL-C level (P<0.05) and lipid indices including TC/HDL-C ,LDL-C/HDL-C,and Log (TG/HDL-C) (P<0.05,respectively).And CD31+/CD42b+PMPs was no significantly correlation with age,gender,BMI,SBP,DBP,TC,LDL-C,LogTG and PLT levels.Plasma HDL-C was significantly lower in hypertension with obesity than hypertension without obesity; and lipid indices were elevated in hypertension with obesity,especially TG/HDL-C was significantly higher.Conclusion Level of CD31+/CD42b+PMPs was significantly correlation with HDL-C levels and with the lipid indices including TC/HDL-C,LDL-C/HDL-c,and Log(TG/HDL-C),and it is a potential markers for hypertension with obesity,and also can be used to predict the risk of CAD.It provides a new target for clinical diagnosis and treatment of obesity and hypertension.

hypertension;obesity;platelet activation;platelet microparticles;coronary artery disease

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康創(chuàng)新項目(2016-12M-3006);中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目，No.2016ZX310046;國家自然基金資助項目，No.11274046和協(xié)和青年基金項目，No.3332015033

*通訊作者

1007-4287(2017)06-0935-04

R541.3

A

李乾豪(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：高血壓病理生理。

2016-12-10)