胡晶晶,李開(kāi)學(xué),劉若丹,熊 鷹

(深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳518029)

*通訊作者

微小RNA146b通過(guò)靶向調(diào)節(jié)干擾素調(diào)節(jié)因子5控制M1型巨噬細(xì)胞極化

胡晶晶,李開(kāi)學(xué),劉若丹,熊 鷹*

(深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳518029)

目的 為了證實(shí)miR-146b在小鼠M1/M2型巨噬細(xì)胞分化平衡中的作用和機(jī)制，我們通過(guò)分離小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞，在LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激下促進(jìn)M1型細(xì)胞分化；并結(jié)合李斯特菌感染和內(nèi)毒性休克，共同證實(shí)miR-146b對(duì)M1型巨噬細(xì)胞分化的作用。方法 分離野生型(WT)和IL-10-/-小鼠骨髓細(xì)胞，采用GM-CSF誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞。并在IL-10-/-M1型巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-146b mimic；評(píng)價(jià)miR-146b對(duì)M1型巨噬細(xì)胞分化的影響，以及致炎因子TNF-γ、IL-6和IL-12等表達(dá)；采用miR-146b mimic處理李斯特菌感染和內(nèi)毒性休克動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)miR-146b mimic對(duì)此模型的作用。結(jié)果 相對(duì)于scramble組，miR-146b mimic能明顯抑制IL-10缺失小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞向M1型分化，并降低了TNFα、IL-6和IL-12等表達(dá)。miR-146b mimic也明顯減弱了機(jī)體對(duì)李斯特感染的敏感性，導(dǎo)致肝臟和脾臟菌斑增多；此外，在高劑量LPS刺激下，miR-146b mimic延長(zhǎng)了小鼠生存率，并且降低了致炎因子TNFα、IL-6和IL-12等表達(dá)。而且，IRF5可以作為miR-146b直接靶向因子。結(jié)論 miR-146b在小鼠M1型巨噬細(xì)胞激活過(guò)程作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，起到了抑制炎癥的作用。

微小RNA146b; 干擾素調(diào)節(jié)因子5；巨噬細(xì)胞；骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞

(ChinJLabDiagn,2017,21:1076)

巨噬細(xì)胞是一類(lèi)可以持續(xù)保持激活狀態(tài)的高度異質(zhì)性的細(xì)胞群。根據(jù)對(duì)微生物的信號(hào)和/或細(xì)胞因子刺激因素不同反應(yīng)，巨噬細(xì)胞可以分化成經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages M1)和巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages M 2)[1]。特異的細(xì)胞因子和微環(huán)境可以激活巨噬細(xì)胞，并且通過(guò)改變刺激因素能使不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞相互轉(zhuǎn)化。由T輔助細(xì)胞Th1和自然殺傷細(xì)胞NK產(chǎn)生的干擾素(IFN-γ)能激活M1巨噬細(xì)胞；由中性粒細(xì)胞和其它抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子TNFa以及經(jīng)PAMPs介導(dǎo)的PRRs能通過(guò)激活SOCS3誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化[2-5]。 M1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(IL-12，TNFa，和IL-6)和活性氧(ROS)及一氧化氮等，這些因子促進(jìn)了T輔助細(xì)胞TH1和TH17活化[6,7]。盡管M1巨噬細(xì)胞消滅細(xì)胞內(nèi)感染對(duì)保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是非常重要的，但同時(shí)M1巨噬細(xì)胞自身也產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子參與IBD致病。而且，研究也正表明促進(jìn)M1活性能加重組織損傷和增加宿主癌變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)以及誘發(fā)胰島素抵抗[8-10]。M1巨噬細(xì)胞參與結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展;然而，M1巨噬細(xì)胞如何促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制目前仍不完全清楚。因此，了解M1巨噬細(xì)胞內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制將更深入闡明炎癥性腸疾病的發(fā)病機(jī)制。Curtale等報(bào)道LPS刺激人類(lèi)單核細(xì)胞后通過(guò)分泌IL-10反饋誘導(dǎo)miR-146b表達(dá)，并且靶向抑制TLR4信號(hào)途徑而起到抗炎作用[11]，那么是否miR-146b能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的分化平衡？在此項(xiàng)研究中，我們將對(duì)miR-146b對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分化平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制及靶點(diǎn)展開(kāi)研究。

1 材料與方法

1.1 小鼠 C57BL/6小鼠、IL-10 -/-小鼠、IL-10R2-/-小鼠Rag -/-小鼠和OTII小鼠均購(gòu)于美國(guó)Jackson Lab，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)環(huán)境。

1.2 抗體及試劑成分 IRF8、IRF5、b-actin，anti-Rabbit、anti-mouse、anti-goat二抗均購(gòu)于santa cruz technology; 流式抗體IL-12p40-APC、F4/80-PE、NOS2-PE、CD11b-PE、CD11b-FITC購(gòu)于美國(guó)ebioscience公司；CD4-FITC、CD4-PE購(gòu)于BD公司。CD4分離磁珠購(gòu)于德國(guó)Miltenyi公司。miR-146b 引物(Qiagen)。RAN 免疫共沉淀試劑盒(EMD Millipore)，RIP 試劑盒(EMD Millipore)。組織和細(xì)胞DNA 提取試劑盒(Qiagen),RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life technology)。1640細(xì)胞培養(yǎng)基和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司。

1.3 質(zhì)粒 構(gòu)建質(zhì)粒所需要的內(nèi)切酶和相應(yīng)buffer購(gòu)于New Egnland Biolab公司。熒光素酶報(bào)告載體pmiR-vector report購(gòu)于life technology。IRF5 siRNA購(gòu)于Santa Cruz technology。Leti-IRF5由實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建。感受態(tài)細(xì)胞DH5a購(gòu)于life technology。

1.4 OTII CD4淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)

處死OTII小鼠，取腹股溝和腋下淋巴結(jié)以及脾臟，制成單細(xì)胞懸液，加入30 μl 抗CD4偶聯(lián)磁珠(德國(guó)，Miltenyi)，冰上孵育30 min，1xPBS洗滌2次，并用磁珠自動(dòng)分選儀分選，收集CD4陽(yáng)性的細(xì)胞備用。

1.5 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDMS)培養(yǎng)

取WT和IL-10-/-小鼠骨髓，經(jīng)過(guò)淋巴細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞，1 500 rpm/min 離心5 min，以2*106細(xì)胞/ml培養(yǎng)基(包含10%FBS、10 ng/ml鼠重組GMCSF)，種植于相應(yīng)培養(yǎng)板，每隔3天換更換培養(yǎng)基，共培養(yǎng)7天。

取WT和IL-10-/-小鼠骨髓，經(jīng)過(guò)淋巴細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞，1 500 rpm/min離心5 min，以2*106細(xì)胞/ml培養(yǎng)基(包含10%FBS、10 ng/ml鼠重組GMCSF)，種植于相應(yīng)培養(yǎng)板，每隔3天換更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第5天，轉(zhuǎn)染miR-146b模擬物，終濃度為1 nm，直到第7天，加入新鮮10%FBS的DMED培養(yǎng)基，并加入100 ng/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ刺激24 h。分離來(lái)源于OTII小鼠CD4+T細(xì)胞，按照每孔細(xì)胞與巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)3天。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

檢測(cè)CD4,IL-12/23p40,F4/80,MHC II,IL-17和IFN-γ表達(dá)于上述收集的細(xì)胞，將細(xì)胞均勻分為2管；一管分別加入10 μl的IL-12/23p40-APC、F4/80-PE、MHCII-FITC 4℃，避光孵育1 h；另外一管刺激培養(yǎng)后分別加入10 μl的IL-17-PE、IFN-γ-APC 4℃，避光孵育1 h，1 000 rpm/min，離心5 min，洗去未結(jié)合的抗體；重復(fù)上一步驟；棄上清，0.4%甲醛PBS 200 μl重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀(BD FACS Arail III)檢測(cè)表面分子表達(dá)情況，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 RNA抽提和qPCR

收集細(xì)胞加入1 ml Trizol (invitrogen)溶液，用超聲組織破碎儀勻漿組織室溫靜置5 min；加入200 μl氯仿，劇烈振蕩混勻30 s，室溫靜置3-5 min；4℃下，14 000 g離心15 min，可見(jiàn)分為3層，RNA在上層水相，移至另一個(gè)新的RNase free EP管；沉淀RNA：加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置10 min；4℃下，14 000 g離心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗滌兩次(12 000 g離心5 min)，超凈臺(tái)風(fēng)干；視沉淀量加入適量DEPC水(至少15 μl)溶解沉淀。逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR檢測(cè)：根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 李斯特菌感染實(shí)驗(yàn)

10只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組5只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物：70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，10只小鼠均通過(guò)尾靜脈注射5*104U李斯特菌。觀察48 h后處死小鼠，抽取外周血，留取肝臟和脾臟，一部分用于提取RNA；另一部分分別支撐細(xì)胞懸液，按照1/10倍連續(xù)稀釋原液，每一個(gè)濃度取100 μl均勻涂抹到瓊脂糖培養(yǎng)板，37℃過(guò)夜孵育，次日觀察菌落及計(jì)數(shù)；并檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.9 內(nèi)毒素休克實(shí)驗(yàn)

12只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組6只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物：70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只LPS，觀察小鼠生存率。另外，6只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組3只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物：70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射200 ng/只 LPS，4 h后，處死小鼠，留取外周血以及脾臟。并檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同組間表達(dá)的差異用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn),生存分析采用Kaplan-Meier分析。所有的統(tǒng)計(jì)結(jié)果選取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-146b在WT和IL-10-/-小鼠BMDM中表達(dá)結(jié)腸組織中的表達(dá)情況

miR-146b在WT小鼠BMDM中表達(dá)隨著刺激時(shí)間增加而增高；但是在IL-10-/-小鼠BMDM中，表達(dá)低于WT小鼠BMDM，并不隨刺激時(shí)間增加而改變。熒光原位雜交結(jié)果顯示miR-146b在巨噬細(xì)胞核表達(dá)，同時(shí)miR-146b在IL-10-/-小鼠BMDMs明顯下降。這些結(jié)果提示IL-10調(diào)節(jié)miR-146b的表達(dá)，可能參與巨噬細(xì)胞分化(圖1)。

取來(lái)源于WT和IL-10-/-骨髓巨噬細(xì)胞，采用LSP 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬細(xì)胞，采用qPCR(A)和熒光原位雜交(B)檢測(cè)miR-146b的表達(dá)，U6作為內(nèi)參照。

圖1 miR-146b在M1型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 miR-146b mimic能抑制IL-10-/-M1型巨噬細(xì)胞分化

在IL-10-/-巨噬細(xì)胞培養(yǎng)到第五天時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-146b mimic，繼續(xù)培養(yǎng)2天后用LPS和IFN-r刺激，是否miR-146b能調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞分化？我們將WT和IL-10-/-骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染mir-146 b模擬物(mimic)。轉(zhuǎn)染2天后,細(xì)胞在LPS (100 ng/ml)和IFNg(20 ng/ml)聯(lián)合刺激下24 h。通過(guò)流式細(xì)胞儀和ELISA分析結(jié)果表明,IL-12 p40+細(xì)胞比例在miR-146b模擬物處理組明顯減少(圖2)。同樣,在miR-146b模擬物處理組中，細(xì)胞上清中IL-12 p40、TNFa和IL6分泌均顯著下降(圖3)。這些結(jié)果表明miR-146 b可以負(fù)性調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞分化。

2.3 IRF5可以作為miR-146b的靶基因

生物信息學(xué)分析認(rèn)為，人IRF5可以作為miR-146b預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，而人和小鼠miR-146b成熟序列具有高度同源性，我們采用序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在小鼠IRF5也存在與人類(lèi)似的miR-146b結(jié)合位點(diǎn)(圖3)，因此，我們推測(cè)，在小鼠IRF5也可以作為miR-146b的一個(gè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，我們構(gòu)建了IRF5 3′UTR端包含miR-146b預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體及結(jié)合位點(diǎn)突變載體 ，將IRF5 3′UTR載體或突變載體與pre-miR-146b共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，結(jié)果顯示IRF5 3′UTR質(zhì)粒與pre-miR-146b共轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度明顯低于IRF5 3′UTR突變質(zhì)粒與pre-miR146b共轉(zhuǎn)染組(圖3)。進(jìn)一步采用RNA染色體免疫共沉淀技術(shù)(RIP)分析認(rèn)為miR-146b與IRF5mRNA共存于miRISC轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中。此外，在IL-10-/-骨髓來(lái)源M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR146b模擬物48 h后，繼而LPS/IFN-γ刺激48 h，兩組細(xì)胞中IRF5表達(dá)均明顯下降，同時(shí)IL-12 p40+細(xì)胞比例和細(xì)胞上清IL-12 p40、TNFa和IL6分泌均顯著下降；并且在miR-146b模擬物轉(zhuǎn)染組同時(shí)轉(zhuǎn)染IRF5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒能使IL-12 p40+細(xì)胞比例和細(xì)胞上清IL-12p40、TNFα和IL-6分泌顯著上調(diào)(圖3)。這些結(jié)果提示了IRF5可以作為miR-146b的靶基因，參與了miR-146b調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞分化的信號(hào)途徑。

采用LSP 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-146b mimic和Scramble到巨噬細(xì)胞中，48 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b+IL-12p40+細(xì)胞比例(A,B);并采用ELISA檢測(cè)IL-12 p40、IL-6和TNFa的表達(dá)(C),重復(fù)3次。

圖2 miR-146b mimic抑制腸道M1型巨噬細(xì)胞激活

A,生物信息學(xué)分析認(rèn)為miR-146b與IRF5基因3′UTR區(qū)域部分核苷酸匹配。B,構(gòu)建IFR5基因3′UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，與miR-146b共同轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞，并檢測(cè)熒光。C,采用RIP技術(shù)檢測(cè)miR-146b與IRF5在抗Ago2抗體復(fù)合物中的表達(dá)。D,用western blot檢測(cè)IRF5表達(dá)。F,取來(lái)源于WT的IL-10-/-骨髓的巨噬細(xì)胞，采用LPS 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-146b mimic和Scramble到巨噬細(xì)胞中，6 h后，采用CHIP檢測(cè).E,48 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b+IL-12p40+細(xì)胞比例重復(fù)3次

圖3 IRF5是miR-146b的靶基因

2.4 miR-146b mimic 降低了小鼠對(duì)李斯特菌的易感性

經(jīng)尾靜脈注射5*104U李斯特菌感染小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-146b mimic 的小鼠減弱了對(duì)李斯特菌的抵抗性；miR-146b mimic轉(zhuǎn)染組中小鼠肝臟和脾臟表面菌斑明顯多于對(duì)照組；但是炎癥相關(guān)因子IL12B、TNFa和IL6的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。這說(shuō)明了miR-146b可能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的活性，從而減少炎癥因子釋放，導(dǎo)致對(duì)李斯特菌感染的抵抗性減弱(圖4)。

A.10只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組6只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物:70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble:70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只 LPS,A,計(jì)算脾臟和肝臟表面的菌落；B,采用ELISA檢測(cè)IL-6和TNFa的水平；C,采用熒光免疫組織化學(xué)檢測(cè)INOS+F4/80+細(xì)胞比例。

圖4 miR-146b mimic 阻止李斯特菌感染

2.5 miR-146b mimic 降低了小鼠對(duì)內(nèi)毒素休克的抵抗性

結(jié)果顯示miR-146b mimic延長(zhǎng)了小鼠在大劑量LPS刺激下的生存時(shí)間，并且減少小鼠外周血中IL12B、TNFa和IL6釋放，采用qPCR發(fā)現(xiàn)脾臟中IL12B、TNFa和IL6 mRNA表達(dá)在miR-146b mimic處理組下降。這說(shuō)明了miR-146b mimic可能通過(guò)巨噬細(xì)胞的活性減弱LPS的敏感性(圖5)。

A.12只IL-10-/-小鼠分成兩組，每組6只，一組均注射7 nmol miR-146b模擬物：70 μl vivofectimine混合物，另一組注射7 nmol miR-scramble:70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只 LPS,采用Kaplan-Meier分析小鼠生存率。B，C,qPCR和ELISA分別檢測(cè)TNFa、IL-6和IL-12的表達(dá)

圖5 miR-146b mimic阻止內(nèi)毒性休克

3 討論

微小RNA(microRNA)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)(22-24 nt)組成的非編碼小RNA序列，廣泛存在生物體內(nèi)，在細(xì)胞生命進(jìn)程如進(jìn)化、細(xì)胞增殖以及凋亡等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。microRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)方式綁定其靶基因3′UTRs，抑制靶基因mRNA降解或者阻礙其翻譯，從而降低了靶基因的蛋白表達(dá)[12-15]。它們被順序地從由核糖核酸酶III(RNA酶III)Drosa酶和Dicer的轉(zhuǎn)錄處理，并且它們發(fā)揮它們的功能，通過(guò)Argonaute(AGO)蛋白組建miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(miRISC)，引導(dǎo)microRNA與其靶基因至同一復(fù)合體中，miRISC降解或者阻礙靶基因mRNA翻譯成蛋白質(zhì)[16,17]。越來(lái)越多的研究也表明microRNA在機(jī)體免疫反應(yīng)中也起到重要作用，特別是在調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLRs)介導(dǎo)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和時(shí)間的作用及機(jī)制方面正吸引著大量科學(xué)家的研究興趣[18]。已有研究表明IL-10能抑制TLR誘導(dǎo)的miR-155的表達(dá)從而促進(jìn)抗炎基因的表達(dá)[19,20]。

那么，在影響M1巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-146b是如何作用于M1巨噬細(xì)胞相關(guān)基因？已有文獻(xiàn)和我們研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子5(IRF5)被明確認(rèn)為是M1巨噬細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。我們檢測(cè)是否IRF5表達(dá)能影響IL-10-/-M1巨噬細(xì)胞分化？結(jié)果顯示W(wǎng)T和IL10-/-骨髓來(lái)源M1巨噬細(xì)胞LPS (100 ng/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)聯(lián)合刺激下，IRF5表達(dá)在WT中隨著時(shí)間變化而降低，但是在IL10-/-M1巨噬細(xì)胞中則保持相對(duì)穩(wěn)定；在IL-10-/-骨髓來(lái)源M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染IRF5 siRNA 48小時(shí)后，繼而LPS/IFNg刺激48 h，細(xì)胞中IRF5表達(dá)均明顯下降，同時(shí)IL-12 p40+細(xì)胞比例和細(xì)胞上清IL-12 p40、TNFa和IL-6分泌均顯著下降。這說(shuō)明了IRF5在IL-10-/-骨髓來(lái)源M1巨噬細(xì)胞分化過(guò)程起到了重要作用。我們也通過(guò)RNA免疫共沉淀分析了IRF5和miR-146b在轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中的共表達(dá)，以及熒光素酶報(bào)告基因確認(rèn)了miR-146b能綁定IRF5的3′UTR靶向序列。這些結(jié)果均證實(shí)了IRF5可以作為miR-146b調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化平衡的一個(gè)重要靶向基因。

我們通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-146b在M1型巨噬細(xì)胞分化中的影響，通過(guò)分離骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞，在體內(nèi)證明了miR-146b可以抑制M1型巨噬細(xì)胞分化，減少致炎因子TNFa、IL-6、NO等。并進(jìn)一步通過(guò)建立李斯特菌感染模型和內(nèi)毒素休克模型，證實(shí)了miR-146b可以作為調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞分化的一個(gè)重要因素。

因此，我們認(rèn)為在巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，IL-10誘導(dǎo)miR-146b表達(dá)，并通過(guò)靶向調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞關(guān)鍵因子IRF5，從而調(diào)控M1/M2型巨噬細(xì)胞分化平衡，控制致炎因子TNF、IL-6、NO等產(chǎn)生，以避免M1型巨噬細(xì)胞過(guò)度激活而釋放炎癥因子對(duì)機(jī)體的損傷。

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miR-146b controlled the polarization of M1 type macrophage via targeting IRF5

HUJing-jing,LIKai-xue,LIURuo-dan,etal.

(TheSecondPeople'sHospitalofShenzhen,Shenzhen518029,China)

Objective To investigate the function of miR-146b in the balance of M1/M2 type macrophage differentiation,we isolated the BMDMs and was stimulated by LPS and IFN-g，and confirmed the M1 type macrophage together with Lister infection and endoxin shock model.Methods BMDMs were isolated and stimulated by GM-CSF from WT and Il-10-/-mice.miR-146b mimic or scramble was transfected in IL-10-/-macrophage.The level of TNF-γ,IL-6 and IL-12 were accessed respectively by qPCR,ELISA or Flow cytometry analysis.miR-146b mimic also was used to treat the Lister infection and endoxin shock model.Results the results showed that miR-146b mimic could obviously inhibit the differentiation of M1 type macrophage,accompany with the decrease of TNFa,IL-6 and IL-12 expression.miR-146b mimic also could enhance the Lister infection by repressing the expression TNFa,IL-6,etc.but could prolong the survival of endoxin shock murine model compared to scramble group.Further,IRF5 was verified to sever as the target gene of miR-146b.Conclusion miR-146b negatively regulated the inflammatory cytokine and inhibited the inflammation.

miR-146b; IRF5;macrophage;BMDMs

1007-4287(2017)06-1076-07

R392

A

2016-12-19)