陳魯曼+段旭艷+關(guān)真民

[摘要] 目的 研究谷氨酸鈉誘導(dǎo)的肥胖大鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核區(qū)和腹外側(cè)核區(qū)胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況。方法 2014年11月—2015年6月期間從山東魯抗制藥有限責(zé)任公司購(gòu)買(mǎi)60只剛出生的雄性Wistar大鼠隨機(jī)平分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（各30只），在第2、4、6、8、10天分別皮下注射等量谷氨酸鈉和生理鹽水。大鼠飼養(yǎng)至90 d時(shí)，取下丘腦行免疫組化染色，觀察胃動(dòng)素在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核區(qū)、腹外側(cè)核區(qū)的表達(dá)情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組有29只大鼠呈肥胖狀態(tài)，顯示谷氨酸鈉誘導(dǎo)大鼠有98%因能量失衡呈肥胖狀態(tài)；同時(shí)免疫組化評(píng)分顯示：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腹內(nèi)側(cè)核區(qū)、腹外側(cè)核區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞率和中位數(shù)分別為（2.68±1.61）和2.12、（4.79±2.92）和4.67、（1.52±1.31）和1.44、（2.14±1.13）和1.62，實(shí)驗(yàn)組腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組相比均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組腹外側(cè)核比腹內(nèi)側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組大鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 谷氨酸鈉誘導(dǎo)的肥胖大鼠可以引起下丘腦腹內(nèi)側(cè)核區(qū)、腹外側(cè)核區(qū)胃動(dòng)素的表達(dá)增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 谷氨酸鈉；胃動(dòng)素；下丘腦；肥胖大鼠

[中圖分類號(hào)] R966 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）05（a）-0034-04

[Abstract] Objective To study on expression of motilin in ventromedial and lateral nucleus of hypothalamus of rat obesity？induced by glutamic sodium.Methods In November 2014 to June 2015 from shandong anti-lu pharmaceutical co.， LTD buy 60 newborn male Wistar rats randomly divided into experimental group and control group （30），on day 2，4，6，8，10 respectively were injected with normal saline and sodium glutamate.The 90 day， hypothalamus were performed immunohistochemical staining， observe the expression of motilin in hypothalamus of intra-abdominal， lateral nucleus. Results 29 only the experimental group rats were obese，Monosodium glutamate induced by 98% because of the energy imbalance in obese rats； And Immunohistochemical score shows： the experimental group and control group in the ventromedial nucleus， ventral lateral nucleus positive cell rate and the median was （2.68±1.61） and 2.68， respectively， （4.79±2.92） and 2.92， （1.52±1.31） and 1.31， （1.14±1.13） and 1.13， the ventromedial nucleus and ventrolateral experimental gastric dynamic element positive cells were significantly increased compared with control group， the difference statistically significant （P<0.05）； Experimental ventrolateral nucleus than the ventromedial nucleus gastric positive cells significantly increased， the difference statistically significant （P < 0.05）； Control the ventromedial nucleus in the rat hypothalamus and ventral lateral nucleus gastric dynamic element difference between positive cells has no statistical significance （P>0.05）. Conclusion It suggested that The obese rats induced by sodium glutamate can cause gastric dynamic element expression of hypothalamus.

[Key words] Glutamate；motilin； Hypothalamus； Obese rats

胃動(dòng)素 （motilin，MTL）是由腸嗜鉻細(xì)胞分泌的一種含有22種氨基酸的直鏈多肽，主要功能是促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，同時(shí)刺激胃蛋白酶的分泌[1]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，MTL不但存在于消化系統(tǒng)，還存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，屬于腦-腸肽的范疇。目前，國(guó)內(nèi)探討了胃動(dòng)素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)各腦區(qū)的表達(dá)[2-3]，發(fā)現(xiàn)其受體廣泛分布于腦內(nèi)多個(gè)核團(tuán)，在記億、情緒、食欲、進(jìn)食等方面可能起著廣泛的調(diào)節(jié)作用，谷氨酸鈉肥胖大鼠模型是單純性肥胖的經(jīng)典動(dòng)物模型，但目前對(duì)谷氨酸鈉作用肥胖大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的具體機(jī)制還不十分清楚。該文擬通過(guò)2014年11月—2015年6月期間從山東魯抗制藥有限責(zé)任公司購(gòu)買(mǎi)60只剛出生的雄性Wistar大鼠為研究對(duì)象，研究谷氨酸鈉肥胖大鼠的下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核區(qū)中胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行研究，從而揭示下丘腦型肥胖大鼠胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的分布特點(diǎn)，為谷氨酸鈉誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型的形成機(jī)制提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 肥胖模型制作

新生Wistar大鼠60只，雄性，體重（48.14 ±6.70）g，合格證號(hào)：scxk（魯）2014-0006。按照隨機(jī)平均原則分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各30只。在第2、4、6、8、10天分別給實(shí)驗(yàn)組大鼠皮下注射谷氨酸鈉，對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水，3 mg/g體重，共5次。飼養(yǎng)至滿月后進(jìn)行斷奶，飼養(yǎng)期間兩組均給予常規(guī)飼料和水，一直持續(xù)8周時(shí)間，每天測(cè)量所有Wistar大鼠的體重及體長(zhǎng)，并做好實(shí)驗(yàn)記錄。然后根據(jù)Lee指數(shù)進(jìn)行篩選計(jì)算，挑選出符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的Wistar大鼠。實(shí)驗(yàn)組肥胖大鼠和對(duì)照組正常大鼠各26只。

1.2 動(dòng)物取材

所有合格大鼠均于出生后90 d時(shí)，斷頭取材。用10%的水合氯醛（國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673）3 mL/kg行腹腔注射麻醉后，打開(kāi)暴露大鼠的胸腔， 經(jīng)左心室穿刺至主動(dòng)脈，先用500 mL生理鹽水沖洗，再用500 mL多聚甲醛（40 g/L）經(jīng)升主動(dòng)脈緩慢灌注，大約2 h。選擇兩組中灌注相對(duì)較好的實(shí)驗(yàn)大鼠各22只，采用斷頭開(kāi)顱取下丘腦組織，取出后先用生理鹽水進(jìn)行沖洗，之后再用多聚甲醛（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090250）40 g/L固定8 h后，在20%蔗糖溶液中進(jìn)行脫水，包埋。

1.3 ABC法免疫組化染色

利用Koning等的大鼠腦定位圖譜，從大鼠下丘腦的腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核隆起所在的平面進(jìn)行切片。該實(shí)驗(yàn)采用恒冷箱切片，間隔取片，切片厚約20 μm，每例共取5張。染色中所用抗體濃度MTL（1∶500）。染色具體步驟：冰凍切片用PBS漂洗約2 min，共3次；3%H2O2室溫約10 min，再用PBS漂洗約2 min，共3次； 加15mL/ L封閉血清，室溫孵育約30 min ，棄去血清不清洗，再加入MTL-R抗體（1∶500），在4℃進(jìn)行孵育約24 h；取出之后室溫放置2 h后，再用PBS漂洗3次；免疫組化染色陰性對(duì)照組用PBS代替第2抗體，其余步驟不變。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察

免疫組化染色MTL-R陽(yáng)性細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)不著色，細(xì)胞膜著黃色或棕黃色的細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)時(shí)每1張染色切片高倍鏡選取5個(gè)視野，采用二級(jí)計(jì)分的方法，按染色深淺評(píng)分：無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色或棕褐色計(jì)2分；再按照陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞者計(jì)0分，25%陽(yáng)性細(xì)胞者計(jì)1分，26%～50%陽(yáng)性細(xì)胞者計(jì)2分，51%以上者計(jì)3分。最后將二者得分相加，就是綜合免疫組化的最終評(píng)分：0定為陰性（-），1～2分為陽(yáng)性（+），3～5分為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果行應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，先行單因素方差分析，方差齊性檢驗(yàn)后行配對(duì)LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組谷氨酸鈉肥胖大鼠和對(duì)照組下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、腹外側(cè)核胃動(dòng)素的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示：神經(jīng)元細(xì)胞陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)不著色，細(xì)胞膜著黃色或棕黃色的細(xì)胞；部分神經(jīng)纖維也呈陽(yáng)性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核區(qū)均有陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，并且同區(qū)實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞均比對(duì)照組的陽(yáng)性細(xì)胞有明顯增多；陰性對(duì)照片結(jié)果陰性。見(jiàn)圖1。

2.2 實(shí)驗(yàn)組谷氨酸鈉肥胖大鼠和對(duì)照組下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、腹外側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞率的比較

實(shí)驗(yàn)組谷氨酸鈉肥胖大鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組相比均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組谷氨酸鈉肥胖大鼠下丘腦腹外側(cè)核比腹內(nèi)側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組大鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，人們的生活和醫(yī)療條件也在不斷改善，老齡化程度也在進(jìn)一步加重，更多的老年性疾病患者出現(xiàn)，其中最突出的老年性疾病是肥胖，研究發(fā)現(xiàn)肥胖癥兒童發(fā)病率逐年增加是造成青少年無(wú)癥狀轉(zhuǎn)氨酶增高的主要原因，部分可以轉(zhuǎn)化為肝纖維化和肝硬化，甚至終末期肝病肝纖維化為病程發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[4]，肥胖已經(jīng)演變?yōu)楝F(xiàn)代社會(huì)生活的一種流行病。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)的肥胖發(fā)病率已經(jīng)從2002年的7.1%逐步上升到了11.9%[5]，肥胖已經(jīng)成為一種嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。肥胖癥（adiposity）是一組由于攝食和能量調(diào)節(jié)紊亂引起的慢性代謝性疾病癥候群[6]，因肥胖癥引起的糖尿病、高血壓病、惡性腫瘤、不孕不育等正呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)。因此，肥胖已經(jīng)成為影響人類健康的最主要的危險(xiǎn)因素之一。但是對(duì)肥胖及其相關(guān)性疾病的產(chǎn)生機(jī)制以及防治措施的研究還處于初級(jí)階段。尤其對(duì)于肥胖癥患者的食欲中樞調(diào)節(jié)機(jī)理成為目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，目前比較成熟的動(dòng)物模型是谷氨酸鈉肥胖大鼠模型，谷氨酸鈉肥胖大鼠的產(chǎn)生機(jī)制可能是與下丘腦弓狀核神經(jīng)肽Y的表達(dá)活性增強(qiáng)有關(guān)，神經(jīng)肽Y活性超表達(dá)可以積極促進(jìn)大鼠機(jī)體脂肪組織的生成增加，從而引起下丘腦神經(jīng)細(xì)胞分泌瘦素顯著增加[3]。近幾年研究證明很多肽類激素都已經(jīng)被歸屬為肥胖相關(guān)肽，但MTL對(duì)攝食及體重的影響目前還沒(méi)有公認(rèn)的研究結(jié)論。

MTL作為一種腦-腸肽，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能和作用的研究已經(jīng)取得了一些成果：王洪忠等[7]研究發(fā)現(xiàn)胃動(dòng)素可通過(guò)抑制大鼠下丘腦 PVN 神經(jīng)元細(xì)胞電壓依賴性鉀電流，發(fā)揮其增強(qiáng)胃腸運(yùn)動(dòng)的作用。胃動(dòng)素受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，尤其是與攝食、記憶、學(xué)習(xí)等功能研究有關(guān)。張梅等[8]研究發(fā)現(xiàn)阿奇霉素促進(jìn)胃排空的機(jī)制可能為小劑量下僅為胃動(dòng)素樣作用；中劑量、大劑量時(shí)除胃動(dòng)素樣作用外，有內(nèi)源性胃動(dòng)素參與。因而研究谷氨酸鈉肥胖大鼠的中樞調(diào)節(jié)機(jī)制和胃動(dòng)素表達(dá)意義重大。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組有29只大鼠呈肥胖狀態(tài)，顯示谷氨酸鈉誘導(dǎo)大鼠有98%因能量失衡呈肥胖狀態(tài)，與之前劉銘瑤等[9]研究的谷氨酸鈉造模大鼠的體重、Lees指數(shù)（（體重/g）1/3×103/體長(zhǎng)/cm）、腹部脂肪質(zhì)量顯著高于同期正常對(duì)照組（P<0.01），提示大鼠造模成功的結(jié)果相一致。并且免疫組化的結(jié)果也證實(shí)實(shí)驗(yàn)組的肥胖大鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核區(qū)胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腹內(nèi)側(cè)核區(qū)、腹外側(cè)核區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞率和中位數(shù)分別為（2.68±1.61）和2.12、（4.79±2.92）和4.67、（1.52±1.31）和1.44、（2.14±1.13）和1.62，實(shí)驗(yàn)組腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組相比均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組腹外側(cè)核比腹內(nèi)側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組大鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都說(shuō)明胃動(dòng)素受體被激活以后，可能直接作用于攝食相關(guān)中樞，使大鼠增加攝食； 胃動(dòng)素還有可能作為一種神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)機(jī)制，增加胃腸動(dòng)力，縮短胃腸排空時(shí)間，增加其饑餓感，使攝食增多。這與劉梅等[10]對(duì)動(dòng)物的側(cè)腦室注射胃動(dòng)素后使其進(jìn)食量大量增加，可能與這些動(dòng)物神經(jīng)中樞的胃動(dòng)素受體有關(guān)的結(jié)論相一致。

綜上所述，這些結(jié)果提示谷氨酸鈉誘導(dǎo)大鼠肥胖的原因可能跟下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、腹外側(cè)區(qū)胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增加有密切關(guān)系。谷氨酸鈉可以誘導(dǎo)大鼠的這兩個(gè)區(qū)域的胃動(dòng)素受體數(shù)量增加，胃動(dòng)素受體一旦被激活，大鼠食欲就會(huì)加大，體重隨之增加。但對(duì)于下丘腦的其它核區(qū)是否還有胃動(dòng)素陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的改變，還需要進(jìn)一步研究，為肥胖癥的治療和藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-02-04）