張朝寧，李金田，劉永琦，藺興遙，李雪燕，孫少伯，李娟，王萌，陳繼堯

?

歸芪益元膏對重離子輻射旁效應(yīng)損傷大鼠的影響

張朝寧，李金田，劉永琦，藺興遙，李雪燕，孫少伯，李娟，王萌，陳繼堯

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州 730000

目的 觀察歸芪益元膏對重離子輻射旁效應(yīng)損傷大鼠的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 將42只SPF級Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白對照組、單純輻射組和歸芪益元膏組。歸芪益元膏組預(yù)先給予歸芪益元膏灌胃2周，單純輻射組和歸芪益元膏組大鼠右肺予2 Gy12C6＋離子束單次照射，空白對照組不予照射。照射后6、12、24 h處死各組大鼠，檢測外周血象及白細(xì)胞介素（IL）-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、IL-1β含量，HE染色觀察大鼠肺組織病理形態(tài)。結(jié)果 與空白對照組比較，照射后12 h單純輻射組大鼠血清IL-6、TGF-β1、IL-1β含量明顯升高（＜0.01），外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、血紅蛋白明顯下降（＜0.01）；HE染色顯示照射后24 h大鼠肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)有滲出物及炎性細(xì)胞浸潤等病理改變。與單純輻射組12 h比較，歸芪益元膏組12 h大鼠IL-6、TGF-β1、IL-1β含量明顯下降（＜0.01），血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)顯著上升（＜0.01），大鼠肺組織病理損傷有一定的改善。結(jié)論 歸芪益元膏對重離子輻射旁效應(yīng)損傷具有防護(hù)作用。

輻射旁效應(yīng)；重離子；歸芪益元膏；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；白細(xì)胞介素-6；白細(xì)胞介素-1β；大鼠；雄性

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病，放療是治療惡性腫瘤的重要手段之一。重離子因具有高線性傳能密度、高能量沉積峰、相對高的生物學(xué)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，成為理想的腫瘤放療用射線[1-2]，但重離子放療時(shí)也會(huì)對周圍健康組織產(chǎn)生間接損傷，即輻射旁效應(yīng)。輻射旁效應(yīng)的機(jī)制目前尚未完全研究清楚，其防護(hù)是輻射生物學(xué)和臨床放療治癌領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。中藥因高效、低毒、防治結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)成為目前輻射防護(hù)劑的研究熱點(diǎn)[3]。歸芪益元膏源自清?程國彭《醫(yī)學(xué)心悟》黃芪湯，加甘肅道地藥材當(dāng)歸而成，全方具有益氣滋陰、補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血活血的功效。本實(shí)驗(yàn)用歸芪益元膏對重離子輻射旁效應(yīng)損傷大鼠預(yù)先干預(yù)，觀察其對重離子輻射旁效應(yīng)的防護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級健康雄性Wistar大鼠42只，2～3月齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 藥物及制備

歸芪益元膏（黃芪、當(dāng)歸、熟地黃、麥冬、人參、枸杞子、五味子），方中原藥材均由本校甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室魏舒暢教授提供并質(zhì)量鑒定，符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。按處方劑量稱取藥材后，以水作溶劑，提取2次，第1次用水量為總藥材劑量的8倍，第2次為總藥材劑量的6倍，每次提取2 h。合并2次提取的藥液，300目濾布過濾，減壓濃縮，制成膏劑，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 主要試劑與儀器

白細(xì)胞介素（IL）-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、IL-1β試劑盒，北京欣博盛生物科技有限公司，批號R160315-003a、R160315-007a、R160707-107a。全自動(dòng)動(dòng)物血球分析儀（蘭橋醫(yī)學(xué)科技有限公司），低溫高速離心機(jī)（Kendro公司，型號D37520），酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司，型號Infinite F200），石蠟切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟脫水機(jī)（德國Leica公司），普通光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS，型號BX-51）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對照組（6只）、單純輻射組（18只）和歸芪益元膏組（18只）。歸芪益元膏組大鼠每日予歸芪益元膏16.4 g/kg灌胃（相當(dāng)于臨床成人劑量10倍），空白對照組和單純輻射組予等量生理鹽水灌胃。各組給藥體積均為2 mL，連續(xù)2周。

2.2 干預(yù)

照射前大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉。單純輻射組和歸芪益元膏組大鼠右肺給予2 Gy12C6+離子束單次照射，鉛皮屏蔽身體其余部位，空白對照組予相同方式麻醉，但不予照射。重離子照射在中國科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子加速器研究裝置（HIRFL-CSR）的淺層腫瘤治療終端上進(jìn)行，束流為12C6+離子束。坪區(qū)照射，能量為165 MeV，LET為20 keV/μm，吸收劑量率為2 Gy/min，用空氣電離室監(jiān)測劑量，照射劑量為2 Gy。于照射后6、12、24 h處死各組大鼠6只，腹主動(dòng)脈取血，部分置于血常規(guī)管行全血細(xì)胞分析，部分離心取上清液行ELISA檢測。取出左肺、右肺，4%多聚甲醛固定。

2.3 指標(biāo)檢測

檢測大鼠外周血白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)，按ELISA試劑盒說明書檢測并計(jì)算大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-1β濃度。4%多聚甲醛固定肺組織，脫水后石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察各組大鼠肺組織形態(tài)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以±表示，采用方差分析，兩兩比較采用法。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 歸芪益元膏對重離子輻射旁效應(yīng)損傷大鼠外周血象的影響

與空白對照組比較，照射后12 h單純輻射組大鼠WBC、RBC、PLT、HGB明顯下降（＜0.01）；與單純輻射組12 h比較，歸芪益元膏組12 h大鼠WBC、RBC、PLT、HGB明顯升高（＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠外周血WBC、RBC、PLT、HGB比較（±s）

注：與空白對照組比較，**＜0.01；與單純輻射組12 h比較，##＜0.01

4.2 歸芪益元膏對重離子輻射旁效應(yīng)損傷大鼠血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1及白細(xì)胞介素-6、1β含量的影響

與空白對照組比較，照射后12 h單純輻射組大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-1β含量升高（＜0.01）；與單純輻射組12 h比較，歸芪益元膏組12 h大鼠TGF-β1、IL-6、IL-1β含量降低（＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-6含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白對照組比較，**＜0.01；與單純輻射組12 h比較，##＜0.01

4.3 歸芪益元膏對重離子照射后24 h損傷大鼠肺組織形態(tài)的影響

左肺：空白對照組肺泡壁無增厚，無炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)無滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管無充血、出血；單純輻射組肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)有少量滲出物，有少量炎性細(xì)胞浸潤；歸芪益元膏組肺泡壁無增厚，肺泡腔內(nèi)無滲出物，未見炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁毛細(xì)血管無充血、出血。右肺：空白對照組同左肺；單純輻射組肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)有滲出物，有炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁毛細(xì)血管充血、出血；歸芪益元膏組肺泡壁無增厚，肺泡腔內(nèi)無滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管無充血、出血，有少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1、圖2。

空白對照組單純輻射組歸芪益元膏組

空白對照組單純輻射組歸芪益元膏組

5 討論

從不斷增加的輻射旁效應(yīng)的相關(guān)報(bào)道來看，細(xì)胞因子在旁效應(yīng)中的作用越來越受到重視。細(xì)胞因子是一種可溶性的多肽，在炎癥的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，輻射可誘導(dǎo)大量的細(xì)胞因子如IL-6、TGF-β1等產(chǎn)生[4]。它們既通過細(xì)胞間通訊以旁分泌的形式產(chǎn)生，對鄰近細(xì)胞造成影響，也能以自分泌模式影響遠(yuǎn)處細(xì)胞。因而，在輻射旁效應(yīng)損傷信號傳遞中發(fā)揮重要作用。這些細(xì)胞因子及其細(xì)胞表面的特殊受體激活相關(guān)通路，這些通路反過來誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)放大，影響靶細(xì)胞功能[5]。

TGF-β1參與了輻射相關(guān)旁效應(yīng)的響應(yīng)，是旁效應(yīng)的重要中介物，能夠提高旁效應(yīng)細(xì)胞中活性氧和微核數(shù)量，TGF-β1的抑制劑能夠降低旁效應(yīng)損傷[6-7]。有研究表明，輻照后非靶組織中TGF-β1及其受體表達(dá)水平明顯升高[8]。TGF-β1還是一種重要的化學(xué)趨化因子，可趨化肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，合成釋放IL-6等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[9]。IL-6是一種多功能的生物活性多肽物質(zhì)，可誘導(dǎo)以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在局部聚集，生成活性氧，誘發(fā)氧化應(yīng)激，造成組織炎癥，活化的中性粒細(xì)胞又可分泌IL-1β、IL-8等炎癥因子，構(gòu)成復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)以TGF-β1、IL-6、IL-1β作為檢測輻射旁效應(yīng)的生物學(xué)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2 Gy12C6+離子束照射大鼠右肺部后12 h，大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β明顯升高，說明局部輻射誘導(dǎo)了TGF-β1、IL-6、IL-1β的高表達(dá)，且其表達(dá)存在著時(shí)間效應(yīng)。由此我們分析，機(jī)體于照射后12 h逐步啟動(dòng)自身修復(fù)功能，對自身損傷進(jìn)行修復(fù)。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11-13]，旁效應(yīng)的時(shí)間效應(yīng)因射線種類、劑量等因素而異。

HE染色結(jié)果表明，碳離子束照射后24 h，大鼠右肺、左肺病理改變以急性肺泡炎癥為主，提示右肺局部照射后旁組織左肺產(chǎn)生類似的病理損傷，可能是照射后血清中旁效應(yīng)信號因子TGF-β1、IL-6、IL-1β表達(dá)升高，經(jīng)由血液循環(huán)系統(tǒng)引起左肺出現(xiàn)病理改變。

機(jī)體的造血系統(tǒng)對輻射最敏感，骨髓是主要的造血組織，電離輻射可以嚴(yán)重?fù)p傷骨髓的造血功能，導(dǎo)致造血細(xì)胞的有絲分裂停止，細(xì)胞更新中斷，還可抑制造血免疫功能，發(fā)生出血綜合征和感染并發(fā)癥。骨髓造血功能受損在外周血象中的反映是各類血細(xì)胞數(shù)量下降。因此，通過檢測外周血中血細(xì)胞的數(shù)量可以了解骨髓的造血功能，造血系統(tǒng)的恢復(fù)也是輻射損傷防護(hù)的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠右肺部受2 Gy12C6+離子束照射后12 h，外周血WBC、RBC、PLT、HGB明顯下降，表明局部照射也抑制了骨髓造血細(xì)胞的功能。

中醫(yī)學(xué)雖無輻射及輻射旁效應(yīng)的相關(guān)記載，但射線的致病特點(diǎn)如高能、快速、穿透力強(qiáng)等與中醫(yī)毒邪的致病特點(diǎn)極為相似，故中醫(yī)學(xué)將輻射旁效應(yīng)急性損傷歸于“毒邪致病”的范疇。毒邪性質(zhì)酷烈，致病易直中臟腑，敗壞形體，極易耗傷機(jī)體氣血陰陽，使機(jī)體出現(xiàn)氣血陰陽虧虛的現(xiàn)象[17]。毒邪襲肺，耗氣傷陰血，肺臟氣陰兩虛，肺腎母子相及，病理上相互影響，累及腎中精氣，致腎精不足，氣陰兩虛。腎精為臟腑之氣的根本，腎陰為一身陰氣之本，最終導(dǎo)致機(jī)體氣陰兩虛。氣虛無力推動(dòng)血行，瘀血阻滯，故輻射旁效應(yīng)損傷的中醫(yī)病機(jī)以氣陰兩虛為主，兼血虛血瘀。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，預(yù)先灌胃歸芪益元膏，碳離子照射大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β含量較單純輻射12 h大鼠明顯下降，外周血WBC、RBC、PLT、HGB升高，對病理損害有一定的改善作用。表明歸芪益元膏能降低輻射后大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β的表達(dá)，推測歸芪益元膏通過抑制TGF-β1的合成，進(jìn)而減少IL-6、IL-1β的合成釋放，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)外周血象，從而起到防護(hù)輻射旁效應(yīng)損傷的作用。

綜上所述，歸芪益元膏具有減輕輻射旁效應(yīng)損傷的作用，其作用機(jī)制可能與抑制旁效應(yīng)信號因子TGF-β1的合成，進(jìn)而減少IL-6、IL-1β的合成釋放，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)外周血象有關(guān)，但是否通過調(diào)控其他靶點(diǎn)而發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步研究。

[1] 趙邱越,王振華,謝漪,等.姜黃素對重離子輻射損傷小鼠睪丸組織的防護(hù)作用研究[J].原子核物理評論,2012,31(1)：102-104.

[2] 肖鳳君,楊月峰,王華.重離子輻射對人外周血T淋巴細(xì)胞生物學(xué)性能的影響[J].軍事醫(yī)學(xué),2014,38(8)：630-634.

[3] 楊利丹,楊云霜,杜磊,等.補(bǔ)腎解毒方對輻射損傷小鼠胸腺、脾臟的影響[J].中醫(yī)雜志,2016,57(1)：67-71.

[4] SPRUNG C N, IVASHKEVICH A, FORRESTER H B, et al. Oxidative DNA damage caused by inflammation may link to stress-induced non-targeted effects[J]. Cancer Letters,2015,356：72-81.

[5] WANG H Z, YU K N, HOU J. Radiation-induced bystander effect：Early process and rapid assessment[J]. Cancer Letters,2015,356：137-144.

[6] TONG L, YU K N, BAO L. Low concentration of exogenous carbon monoxide protects mammalian cells against proliferation induced by radiation-induced by stander effect[J]. Mutation Research, 2014,759(2)：9-15.

[7] IYER R, LEHNERT B E, SVENSSON R. Factors underlying the cell growth-related bystander responses to alpha particles[J]. Cancer Res,2000,60(5)：1290-1298.

[8] CALAF G M, ZHOU H, GHANDHI S A, et al. Radiation induced COX-2 expression and mutagenesis at non-targeted lung tissues of gpt delta transgenic mice[J]. Br J Cancer,2013,108：91-98.

[9] 夏德洪,奚蕾,沈偉生,等.黃芪對放射性肺損傷干預(yù)作用及對TGF-β1, IL-1表達(dá)影響的研究[J].中國中藥雜志,2010,35(8)：1079-1082.

[10] 王強(qiáng),王慶勝,魯鵬程,等.香砂六君子湯對脾胃虛弱型萎縮性胃炎大鼠胃竇黏膜組織白細(xì)胞介素-6、10及熱休克蛋白70表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2016,23(11)：62-66.

[11] TOMITA M, MATSUMOTO H, FUNAYAMA T. Nitricoxide-mediated by stander signal transduction induced by heavy-ion microbeam irradiation[J]. Life Sci Space Res (Amst),2015,5(6)：36-43.

[12] YANG S, XU J, SHAO W, et al. Radiation-induced by stander effects in A549 cells exposed to 6 MV X-rays[J]. Cell Biochemical and Biophysics,2015,72(3)：877-882.

[13] 楊劍,韓玲,高嫻.PTEN在電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)細(xì)胞中的表達(dá)變化[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(2)：137-142.

[14] 劉樹錚.醫(yī)學(xué)放射生物學(xué)(修訂版)[M].北京：原子能出版社,2010： 169-199．

[15] 李辰,邵帥,涂序珉.四君子湯對受照小鼠體重及外周血象的影響[J].輻射防護(hù),2015,35(6)：345-352.

[16] 周湘潔,張麗芬,鐘悅,等.番紅花培養(yǎng)細(xì)胞對輻射小鼠外周血細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國藥業(yè),2016,25(4)：42-47.

[17] 王玉璽,王松巖.毒邪理論與治療方法[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2010,9(2)：127-130.

Study on Protective Effects ofOintment on Rats Damaged Caused by Heavy Ion Radiation Induced Bystander Effects

ZHANG Chao-ning, LI Jin-tian, LIU Yong-qi, LIN Xing-yao, LIXue-yan, SUN Shao-bo, LI Juan, WANGMeng, CHENJi-yao

Objective To discuss the protective effects ofOintment on damages caused by heavy ion radiation induced bystander effects; To explore the possible mechanism. Methods Totally 42 Wistar male rats were randomly divided into blank control group, pure radiation group andOintment group. TheOintment group was givenOintment by gavage for two weeks in advance. Later the right lungs of the rats in the pure radiation group andOintment group were radiated once by 2 Gy12C6+, while the blank control group received no radiation. 6, 12, 24 h after radiation all groups of rats were executed. Peripheral hemogram and the levels of IL-6, TGF-β1 and IL-1β in serum of the rats were examined. The changes of lung tissue pathology morphology in the rats were observed by HE staining. Results Compared with the blank control group, the contents of IL-6, TGF-β1 and IL-1β in serum of the pure radiation group increased obviously at 12 h after radiation (<0.01), and the amount of leukocyte, erythrocyte, blood platelet and hemoglobin distinctly declined at 12 h after radiation (<0.01); HE staining showed that the alveolar wall was thickened at 24 h after radiation, and there were exudate and inflammatory cell infiltration in the alveolar cavity. Compare with the pure radiation group at 12 h after radiation, the levels of IL-6, TGF-β1 and IL-1β inOintment group decreased significantly at 12 h after radiation (<0.01). Indexes of blood routine significantly increased (<0.01), and the pathological changes of lung tissue in rats improved (<0.01).ConclusionOintment can protect damages caused by heavy ion radiation induced bystander effects.

radiation induced bystander effects; heavy ion;Ointment; TGF-β1; IL-6; IL-1β; rats; male

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.011

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0045-04

國家自然科學(xué)基金（81460695）

李金田，E-mail：1754648867@qq.com

（2016-11-22）

（2016-12-22；編輯：華強(qiáng)）