李沐哲， 吳文輝， 吳之平， 任美玲， 陳淑賢， 郭曉玲， 王 平△， 林 麗△

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室/湖北省 老年病研究所/湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 4300652武昌區(qū)水果湖街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，武漢 430071

三七皂苷Rg1改善阿爾茨海默病大鼠空間認(rèn)知能力及海馬tau蛋白磷酸化*

李沐哲1#， 吳文輝1#， 吳之平2， 任美玲1， 陳淑賢1， 郭曉玲1， 王 平1△， 林 麗1△

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室/湖北省 老年病研究所/湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 4300652武昌區(qū)水果湖街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，武漢 430071

目的 研究三七皂苷Rg1對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和磷酸化tau蛋白的作用及機(jī)制。方法 SD大鼠左側(cè)腦室Aβ25-35注射復(fù)制AD模型，分別用低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高劑量(100 mg/kg)的三七皂苷Rg1灌胃，2次/d，4周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測學(xué)習(xí)記憶能力，并通過免疫印跡、免疫組織化學(xué)方法，檢測各組大鼠海馬tau蛋白磷酸化水平及分布的變化。結(jié)果 側(cè)腦室注射Aβ25-35后，模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著低于正常對照大鼠；免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，海馬tau蛋白蘇氨酸231位點(diǎn)磷酸化(PT231)水平明顯增加，非磷酸化水平明顯下降；形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果顯示，模型大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)的PT231水平明顯增加。中劑量的三七皂苷Rg1干預(yù)能顯著改善模型大鼠在Morris水迷宮中學(xué)習(xí)記憶的能力；3種劑量的三七皂苷Rg1均能降低其海馬DG、CA1、CA3區(qū)的tau蛋白PT231水平，且3種劑量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 三七皂苷Rg1能改善Aβ25-35誘導(dǎo)的模型大鼠AD樣空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙及降低海馬tau蛋白磷酸化水平。

三七皂苷Rg1； 阿爾茨海默??； 學(xué)習(xí)記憶； 磷酸化tau蛋白

老年癡呆癥是以衰老為主要病因的神經(jīng)退行性疾病，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年癡呆癥的主要類型，其主要病理表現(xiàn)為腦組織細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集所形成的老年斑、細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化tau蛋白聚集而形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失等[1]。隨著社會(huì)老年化進(jìn)程的加劇，AD患者發(fā)病率亦漸增，目前我國AD患者人數(shù)高達(dá)500萬，占全球患者人數(shù)的25%，其中65歲以上人群AD患病率高達(dá)7.5%[2]。盡管全球各國已花費(fèi)很多時(shí)間、人力和財(cái)力探尋其確切發(fā)病機(jī)制和有效治療手段，但收效甚微。

中醫(yī)認(rèn)為老年癡呆病癥中存在本虛標(biāo)實(shí)的病理特征，腎虛為本、痰阻血瘀為標(biāo)，因此補(bǔ)腎化痰、活血化瘀法在臨床中常用于防治AD。三七是止血、活血化瘀和補(bǔ)血的中藥，符合中醫(yī)活血化瘀法治療老年癡呆病的理論，三七中含有皂苷、黃酮、多糖、三七素和氨基酸等物質(zhì)，其中三七皂苷是三七的主要活性成分。三七總皂苷含多種已經(jīng)分離并鑒別出的單體成分，其中Rg1占栽培三七根莖的20%左右?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，三七具有改善記憶力和認(rèn)知功能、抗自由基的毒性損傷、抑制凋亡調(diào)控基因，對AD有一定的療效[3]。然而究竟是何種成分起作用？涉及哪些具體分子機(jī)制？這些尚需進(jìn)一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 Aβ25-35購自美國Sigma公司，將Aβ25-35多肽溶解于DMSO后加入生理鹽水配成濃度為2.6 μg/μL的溶液，置于37℃恒溫箱避光孵育1周，放置4℃冰箱備用。三七皂苷Rg1購自北京中科儀友化工技術(shù)研究院(標(biāo)準(zhǔn)品98%)。tau1、PT231抗體由美國Chemicon公司生產(chǎn)，分裝后置-20℃冰箱保存，臨用前用抗體稀釋液按1∶1 000稀釋后用于Western blot檢測或1∶200稀釋后用于免疫組化檢測。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4月齡SD雄性大鼠50只(購自湖北省疾病控制中心)，體重(280±20)g。隨機(jī)分為正常組(Con)、模型組(Mod)、低劑量組(L-Rg1)、中劑量組(M-Rg1)、高劑量組(H-Rg1)，每組各10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腦立體定位及給藥 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周并進(jìn)行Morris水迷宮檢測剔除不合格大鼠。大鼠腦立體定位時(shí)先腹腔注射6%的水合氯醛進(jìn)行麻醉(400 mg/kg)，常規(guī)消毒、備皮并固定于大鼠腦立體定位儀上，參考Fanklin和Paxinos編寫的《大鼠腦立體定位圖譜》定位左側(cè)側(cè)腦室。所選部位為大鼠前囟后0.8 mm、左側(cè)旁開3.5 mm處，在該處鉆直徑約1 mm的小孔，用微量注射器吸取2 μL Aβ25-35液于該孔4.0 mm深處即左側(cè)腦室緩慢注入，注射完畢后留針5 min，拔針后以醫(yī)用明膠海綿填塞注射孔并常規(guī)縫合，消毒處理切口處皮膚。正常組注射等量生理鹽水。1周后Morris水迷宮檢測篩選造模成功大鼠。24 h后按照三七皂苷Rg1低、中、高不同劑量(分別為25、50、100 mg/kg)灌胃，正常組和模型組均灌服等量生理鹽水，2次/d、共4周。第4周后利用Morris水迷宮對各組大鼠進(jìn)行空間學(xué)習(xí)記憶檢測后處死，取左側(cè)海馬組織置-80℃或灌流取腦組織備用。

1.2.2 Morris水迷宮檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 各組大鼠在灌胃4周后開始進(jìn)行測試，各組大鼠進(jìn)行為期7 d的水迷宮訓(xùn)練檢測。水迷宮分為圓柱形水池和自動(dòng)錄像分析系統(tǒng)兩部分，水池等分為4個(gè)象限，分別稱為1、2、3、4象限。水深15 cm，水溫控制在(22.0±0.5)℃，在第3象限正中放一圓柱形平臺(tái)(外面包裹黑色膠袋)，水池水面高出平臺(tái)表面1～2 cm，并于水中加入適量墨汁使平臺(tái)不可見，實(shí)驗(yàn)中保持平臺(tái)位置不變。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為60 s，分別將大鼠從1、2、3、4象限面對池壁放入池中，在水池上方有攝像機(jī)同步記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，以大鼠找到平臺(tái)并停留5 s的時(shí)間為潛伏期。若大鼠未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)人員則將其引導(dǎo)到平臺(tái)停留30 s以適應(yīng)熟悉周圍環(huán)境，然后進(jìn)行下一輪實(shí)驗(yàn)。每天訓(xùn)練4次，每個(gè)象限各1次。第7天撤去平臺(tái)從任意象限放入大鼠，檢測其首次穿越平臺(tái)的時(shí)間即為潛伏期，同時(shí)觀察其穿越平臺(tái)的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間每天固定為13：00～20：00。

1.2.3 免疫印跡法 取出備用組織，按1∶9加入組織勻漿液進(jìn)行勻漿。超聲破碎后加入緩沖液(Tris 2.42 g，HCl 1.5 mL，SDS 8.0 g，甘油40.0 mL，定容成400 mL)適量煮沸10 min，然后用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度并計(jì)算上樣量。配制分離膠(下部膠)和濃縮膠(上部膠)，標(biāo)出泳道按一定順序上樣后開始電泳；當(dāng)電泳至膠底部時(shí)取出凝膠再將其轉(zhuǎn)膜到NC膜上，轉(zhuǎn)膜完畢后封閉非特異性的位點(diǎn)，然后孵育一抗(tau1為羊抗鼠、PT231為羊抗兔)、二抗(IgG熒光標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IRDyeTM，800通道)，Odyssey顯色后進(jìn)行灰度值檢測。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法 每組動(dòng)物取4只經(jīng)多聚甲醛灌流及后固定后切片，盡量挑選不同組別中同一截面的腦片于24孔板中，用適量PBS于搖床上緩慢振洗5 min×3次；再加入破膜液(30% H2O2100 μL、Triton-100 50 μL，加1×PBS定容至10 mL)破膜15 min，1×PBS振洗5 min×3次；然后用3% BSA-PBS液200～250 μL封閉30 min后加入一抗于4℃孵育24～48 h，回收一抗，1×PBS液振洗5 min×3次后依次孵育二抗、三抗，DAB顯色；貼片后按常規(guī)脫水、透明、封片，自然晾干后進(jìn)行圖像采集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三七皂苷Rg1對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

SD大鼠側(cè)腦室注射Aβ25-35后用三七皂苷Rg1干預(yù)4周，通過Morris水迷宮對動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠潛伏期在第2、3天時(shí)分別為(55.86±4.31)s、(53.31±3.01)s，均明顯高于其它實(shí)驗(yàn)組(均P<0.05)，提示模型組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降；第7天時(shí)中劑量三七皂苷Rg1組的潛伏期(32.37±3.64)s和穿越平臺(tái)次數(shù)(3.00±1.12)與正常組的潛伏期(26.93±4.12)s及穿越平臺(tái)次數(shù)(4.00±1.46)相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，與模型組的潛伏期(40.71±3.45)s和穿越平臺(tái)次數(shù)(1.00±0.26)相比則差異顯著(均P<0.05)，提示中劑量三七皂苷Rg1可明顯逆轉(zhuǎn)AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受損情況；而低劑量三七皂苷Rg1組的潛伏期(38.75±3.32)s和高劑量三七皂苷Rg1組的潛伏期(37.08±3.06)s改變不明顯，與模型組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，同時(shí)3組間穿越平臺(tái)次數(shù)亦無顯著性差異(P>0.05)，且低劑量和高劑量三七皂苷Rg1組與正常組相比潛伏期與穿越平臺(tái)次數(shù)均有顯著性差異(均P<0.05)。以上結(jié)果提示大鼠側(cè)腦室注射Aβ25-35可誘導(dǎo)出AD樣空間學(xué)習(xí)記憶障礙，中劑量三七皂苷Rg1能有效逆轉(zhuǎn)(實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、在水迷宮中的游泳速度均無組間差異)，具體結(jié)果見圖1。

A：Morris水迷宮檢測各組空間學(xué)習(xí)記憶時(shí)潛伏期結(jié)果；B：各組Morris水迷宮檢測第1、6、7天的軌跡圖；n=8圖1 三七皂苷Rg1對AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響Fig.1 Effects of panax notoginsen gsaponins Rg1 on spatial learning and memory of AD rat model

2.2 三七皂苷Rg1對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD樣模型大鼠海馬tau蛋白水平的影響

神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化tau蛋白聚集而形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD發(fā)病的重要標(biāo)志，且與AD患者的認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。tau1為非磷酸化tau蛋白，Thr231是tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵位點(diǎn)之一，因此本研究中檢測Thr231磷酸化(PT231)水平以觀察三七皂苷Rg1對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD樣模型大鼠海馬磷酸化tau蛋白水平的影響。Western blot檢測結(jié)果提示，模型組的PT231明顯高于正常組(P<0.01)，而tau1明顯低于正常組(P<0.05)；三七皂苷Rg1各劑量組PT231水平均低于模型組(均P<0.05)，但對非磷酸化tau蛋白tau1無明顯影響(均P>0.05)。該結(jié)果提示三七皂苷Rg1能逆轉(zhuǎn)AD樣模型大鼠磷酸化tau蛋白PT231升高的情況。見圖2。

2.3 三七皂苷Rg1對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD樣模型大鼠海馬PT231陽性著色分布的影響

以上結(jié)果提示三七皂苷Rg1主要影響tau蛋白的磷酸化水平，而AD的發(fā)生與病情進(jìn)展按照一定的腦區(qū)逐步推進(jìn)并呈現(xiàn)一定的腦區(qū)分布特征，因此接下來應(yīng)用免疫組織化學(xué)觀察三七皂苷Rg1干預(yù)后海馬區(qū)PT231的分布情況。通過對AD大鼠模型組和正常組、三七皂苷Rg1中劑量組(結(jié)合行為學(xué)和Western blot檢測結(jié)果確定)的左側(cè)海馬區(qū)的PT231免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，PT231陽性反應(yīng)物呈棕黃色，在海馬DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)均可見簇狀分布的陽性細(xì)胞，胞體呈圓形或橢圓形著色較深，其胞膜、胞質(zhì)、胞核及樹突、軸突著色均較明顯；在DG區(qū)顆粒細(xì)胞層、始層、分子層亦明顯著色，其中胞體著色更加顯著。模型組大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)增多，胞體增大、著色加深；在DG區(qū)的顆粒細(xì)胞層、始層、分子層陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多、胞膜顏色深染。三七皂苷Rg1中劑量組在海馬DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)的分布特征介于正常情況和模型組之間，與模型組相比，陽性細(xì)胞數(shù)有所減少、著色變淺。見圖3。

A：各組PT231和tau1的Western blot結(jié)果；B：各組Western blot條帶相對灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與正常組比較，*P<0.05 **P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；n=4圖2 三七皂苷Rg1干預(yù)AD大鼠模型后海馬PT231和tau1 Western blot檢測結(jié)果Fig.2 Level of PT231 and tau1 in hippocampus of AD rat model after treatment with panax notoginsen gsaponins Rg1

圖3 三七皂苷Rg1對Aβ25-35誘導(dǎo)的AD樣模型大鼠海馬PT231免疫組織化學(xué)染色的影響(標(biāo)尺= 50 μm)Fig.3 Effect of Panax notoginseng saponins Rg1 on immunohistochemical staining of PT231 in hippocampus of AD rat model induced by Aβ25-35(scale bar= 50 μm)

3 討論

AD是老年癡呆癥的主要類型，是繼腫瘤、心臟病、腦血管病之后引起老年人死亡的第4大病因。其以衰老為主要病因，神經(jīng)元外Aβ沉積所形成的老年斑和神經(jīng)元內(nèi)過度磷酸化tau蛋白聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)為兩大病理表現(xiàn)形式，雖然目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要集中在Aβ假說、tau蛋白假說及慢性炎癥、神經(jīng)元死亡假說等[4]，但確切發(fā)病機(jī)制尚未明了?，F(xiàn)階段基于神經(jīng)保護(hù)和Aβ分泌、沉積途徑研制的藥物多因副反應(yīng)大或效果不明顯而以失敗告終[4-5]。有關(guān)以tau蛋白為主動(dòng)免疫疫苗的臨床研究尚處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，同時(shí)尋找特異性抑制tau蛋白過度磷酸化的制劑為臨床治療AD提供了很好的思路。tau蛋白還可介導(dǎo)Aβ的毒性作用[6-7]，證據(jù)之一是3例AD患者接受Aβ42免疫治療后，其腦部的Aβ被清除了但其神經(jīng)原纖維纏結(jié)的病理變化和臨床癥狀仍呈進(jìn)行性發(fā)展[8]，這提示tau蛋白異常是AD發(fā)病過程中引起認(rèn)知障礙的主要原因，且有研究表明大腦皮質(zhì)中tau蛋白過度磷酸化程度與癡呆患者認(rèn)知功能障礙程度呈正相關(guān)[9]?，F(xiàn)有研究提示三七總皂苷具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗炎穩(wěn)定斑塊及抗氧化等功效從而具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心臟等作用；三七皂苷Rg1能調(diào)節(jié)腦缺血損傷后大鼠腦組織Bcl-2及其與Bax的比值，具有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的腦保護(hù)作用[10-12]。本研究提示三七皂苷Rg1可改善AD樣模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)能降低海馬區(qū)域tau蛋白蘇氨酸231位點(diǎn)的磷酸化(PT231)水平，進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)結(jié)果提示三七皂苷Rg1能減少海馬DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)PT231的陽性著色。海馬是主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的器官，而記憶分為瞬時(shí)記憶、短時(shí)記憶和長期記憶，分別持續(xù)0.25～5 s、5 s～2 min和持續(xù)多年甚至終生。瞬時(shí)記憶和短時(shí)記憶發(fā)生在腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而長時(shí)記憶發(fā)生在顳葉和海馬。因此我們推測三七皂苷Rg1改善AD樣模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與三七皂苷Rg1能降低大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)PT231的水平有關(guān)。

目前，關(guān)于中醫(yī)藥防治老年癡呆的研究還處于初步探索階段，尤其是機(jī)制方面涉足尚淺。本研究提示三七皂苷Rg1能通過降低AD樣大鼠模型海馬DG區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)磷酸化tau蛋白的水平，繼而提升AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，為中醫(yī)藥防治老年癡呆提供了有力的依據(jù)并開拓了思路。

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(2016-12-23 收稿)

Panax Notoginseng Saponins Rg1 Improves Spatial Cognitive Ability and Decreases Phosphorylation Level of Tau Protein in Alzheimer’s Disease Rat Model

Li Muzhe1#，Wu Wenhui1#，Wu Zhiping2etal

1CellBiologyLaboratory，CollegeofBasicMedicine，HubeiUniversityofChineseMedicine，HubeiResearchInstituteofGeriatrics，GeriatricsofTCMNewProductsCollaborativeInnovationCenterinHubeiProvince，Wuhan430065，China2Fruit-lakeStreetCommunityHealthServiceCentersofWuchangDistrict，Wuhan430071，China

Objective To study the effects of panax notoginsen gsaponins Rg1 on the model of Alzheimer’s Disease(AD)and related mechanism.Methods AD model was established by injection of Aβ25-35in the left lateral ventricles of SD rats.These rats were treated with low(25 mg/kg)，medium(50 mg/kg)and high(100 mg/kg)dose of panax notoginsen gsaponins Rg1，twice a day.Then the Morris water maze was used to detect the ability of learning and memory，Western blotting was adopted to detect hyperphosphorylation tau protein，and immunohistochemical methods to analyze its distribution in the left hippocampus 4 weeks after the treatment.Results The learning and memory ability of AD rat model was inferior to the normal rats with the phosphorylation level of tau protein at Thr231 site(PT231)increased and the nonphosphorylation level of tauprotein decreased.PT231 level of AD rat model increased markedly in region of DG，CA1 and CA3 of the hippocampus in morphology.Middle dose of panax notoginseng saponins Rg1 could effectively improve the ability of learning and memory.The three doses of panax notoginsen gsaponins Rg1 could decrease the level of PT231 and there was no significant difference among them.Conclusion Prescription of panax notoginsen gsaponins Rg1 can improve the ability of learning and memory and decrease the hyperphosphorylation of tau protein of AD rat model induced by Aβ25-35.

panax notoginsen gsaponins Rg1； Alzheimer’s disease； learning and memory； phosphorylated tau protein

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81673856，No.81573865)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2016 M592319)；湖北中醫(yī)藥大學(xué)青苗計(jì)劃資助項(xiàng)目(中醫(yī)校字2015[182]號(hào))；湖北中醫(yī)藥大學(xué)博士科研項(xiàng)目啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(中醫(yī)黨字[2014]25號(hào))

R749.16

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.002

#共同第一作者

李沐哲，男，1996年生，在讀本科生，E-mail：1258264775@qq.com

吳文輝，男，1995年生，在讀本科生，E-mail：694421835@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：pwang54@aliyun.com(王平)，bluebagbear@163.com(林麗)