邵士珺+吳雪卿+萬華+杜若飛+馮怡

[摘要] 目的 建立臨床有效驗方乳癌術后方的HPLC特征圖譜。 方法 使用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；柱溫為25℃；檢測波長270 nm；以上述方法制備乳癌術后方提取液，獲得特征峰，檢測上述制備方法的重復性、精密度、穩(wěn)定性和相似度。 結(jié)果 該方法重復性相對保留時間的RSD分別為0.06%、0.03%、0.02%、0.02%和0.04%，精密度相對保留時間的RSD分別為0.09%、0.02%、0.02%、0.008%、0.05%，穩(wěn)定性相對保留時間的RSD分別為0.08%、0.03%、0.02%、0.02%和0.04%，均良好。采用該方法測定3批次乳癌術后方，均標示出6個共有峰，且相似度均高于95%。 結(jié)論 該研究為乳癌術后方的進一步物質(zhì)基礎研究及質(zhì)量評價奠定了基礎。

[關鍵詞] 乳癌術后方；HPLC；特征圖譜

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0004-05

HPLC specific chromatogram of Ru'ai Shuhou Recipe

SHAO Shijun1 WU Xueqing1 WAN Hua1 DU Ruofei2 FENG Yi2

1.Department of Galactophore， Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200021， China； 2.Engineering Research Center of Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

[Abstract] Objective To establish the specific chromatogram of clinically proved effective Ru'ai Shuhou Recipe. Methods Agilent Extend-C18 cloumn （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was adopted， with acetonitrile and water containing 0.05% phosphoric acid as the mobile phase， and the flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was set at 25℃， and the detection wavelength was 270 nm. This method was used to prepare the extract of Ru'ai Shuhou Recipe， and obtain specific chromatographic peaks. Meanwhile the repeatability， precision， stability and similarity were detect by this method. Results Good repeatability （RSD relative retention time were 0.06%， 0.03%， 0.02%， 0.02%， 0.04%）， precision （RSD relative retention time were 0.09%， 0.02%， 0.02%， 0.008%， 0.05%） and stability （RSD relative retention time were 0.08%， 0.03%， 0.02%， 0.02%， 0.04%） were proved. Three batches of Ru'ai Shuhou Recipe all showed 6 common specific chromatographic peaks with similarities above 0.95. Conclusion The study lays a foundation for the further study of material basis and quality evaluation of Ru'ai Shuhou Recipe.

[Key words] Ru'ai Shuhou Recipe； HPLC； Specific chromatogram

乳癌術后方是上海市名中醫(yī)陸德銘教授經(jīng)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出的經(jīng)驗方，長期運用于乳腺癌患者術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床防治工作中，取得了良好的臨床療效。該方由黃芪、白術、茯苓、淫羊藿、山萸肉、莪術、蜂房組成，7味藥同用益腎健脾、活血解毒，共奏扶正祛邪、標本同治之功。

乳癌術后方已申請專利并獲批[1]，針對該方開展了大量臨床研究，發(fā)現(xiàn)其能夠有效預防乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移，延長患者的生存期[2-4]，同時能夠明顯提高乳腺癌患者的生活質(zhì)量，改善患者的免疫功能[3]。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)乳癌術后方可以通過HER2介導的多途徑調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制因子（TIMPs）的表達，通過加強腫瘤周圍正常組織細胞的防御能力，抵御惡性腫瘤細胞對周圍基質(zhì)的侵蝕而發(fā)揮抗復發(fā)轉(zhuǎn)移作用[5-7]。然而，由于尚未建立該方的HPLC特征圖譜，無法了解該中藥復方的物質(zhì)基礎與發(fā)揮療效的主要化學成分群，為進一步的質(zhì)量控制及制劑開發(fā)帶來了困難。因此，本研究旨在建立乳癌術后方HPLC特征圖譜，為該方的物質(zhì)基礎研究及質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；十萬分之一天平（瑞士MettlerToledo）；萬分之一天平（上海精密科學儀器有限公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）；PTHW電熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司）。乙腈和甲醇為色譜純（上海星可生化有限公司），水為超純水（Milli-Q型純水儀，購自密理博中國有限公司），其他試劑均為分析純。對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201203），淫羊藿苷（批號：110737-200415）均購于中國食品藥品檢定研究院。3批次乳癌術后方復方藥材飲片購自上海康橋藥業(yè)有限公司，所有飲片均符合《中國藥典》2015版一部項下的質(zhì)量要求。分析軟件使用的是中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版（國家藥典委員會）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品10.304 mg，用甲醇配制濃度分別為515.2 μg/mL和5.152 μg/mL毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液。精密稱取淫羊藿苷對照品10.62 mg，用甲醇配制濃度分別為1062 μg/mL和106.2 μg/mL淫羊藿苷對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

按照處方比例稱取黃芪10 g，白術6 g，茯苓6 g，淫羊藿10 g，山萸肉6 g，莪術10 g和蜂房10 g，置于1000 mL圓底燒瓶中，分別加水500 mL和250 mL，回流提取2次，每次30 min，提取液合并后過濾，減壓濃縮至約100 mL，即為供試品。

2.3 實驗條件的確定

2.3.1 檢測波長的確定 選擇乳癌術后方中3味藥材黃芪、淫羊藿和白術的指標性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和白術內(nèi)酯Ⅲ的檢測波長270、260、220 nm為供試品特征圖譜的檢測波長，檢測結(jié)果見圖1。比較3個波長下的特征圖譜，270 nm的特征譜分離度更高，基線更為平坦，因此選擇270 nm作為樣品的檢測波長。

2.3.2 流動相的確定 取供試品溶液（批號20141208，下同），參照文獻[8]中毛蕊異黃酮葡萄糖及2015版《中國藥典》[9]中淫羊藿苷測定方法，以乙腈-磷酸溶液作為基礎流動相，考察0.04%、0.05%、0.06%磷酸溶液時的特征圖譜。如圖2所示，三者圖譜差距不大，最終選擇文獻[8]中采用的0.05%磷酸溶液。

2.3.3 流速的確定 取供試品溶液，分別用0.9、1.0和1.1 mL/min的流速進行測定。如圖3所示，當流速為1.1 mL/min時，一些色譜峰的分離效果不佳，且柱壓較高；而流速為0.9 mL/min時，對照其他兩張圖譜可見在60 min時仍有成分未出峰。因此，選擇1.0 mL/min作為測定流速。

2.3.4 梯度條件的確定 采用表1所示梯度程序洗脫法發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離度較好，淫羊藿苷分離度差?？紤]在13 min和32 min減緩梯度變化，保留了15 min前分離毛蕊異黃酮葡萄糖苷的梯度條件，調(diào)整后續(xù)淫羊藿苷的梯度條件見表2。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷分離度均較好，但60 min后仍有成分流出，因此，做進一步梯度調(diào)整，解決出峰不完全的問題，見表3。結(jié)果如圖4所示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷分離度均較好，且已解決60 min出峰不完全的問題。因此，確定該梯度為最終梯度。

2.3.5 檢測色譜條件的確定 乳癌術后方特征圖譜的檢測條件為：使用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.05%磷酸溶液三元梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為270 nm。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷和淫羊藿苷峰計算應不低于2000。

2.3.6 特征峰的確定 供試品特征圖譜中應有6個特征峰，與參照物淫羊藿苷相應的峰為S峰，毛蕊異黃酮葡萄糖苷為峰1，特征圖譜見圖5。

2.4 分析方法驗證

2.4.1 重復性試驗 取同一批乳癌術后方提取液供試品（批號20141208，下同）6份，按上述色譜條件制備供試品溶液，分別測定6個共有峰的相對保留時間，結(jié)果1、2、3、4、6號峰與參照物S峰（5號峰）的相對保留時間RSD分別為0.06%、0.03%、0.02%、0.02%和0.04%，重復性良好。

2.4.2 精密度試驗 取供試品溶液，按上述色譜條件，重復進樣6次，測定6個共有峰的相對保留時間，結(jié)果1、2、3、4、6號峰與參照物S峰（5號峰）的相對保留時間RSD分別為0.09%、0.02%、0.02%、0.008%、0.05%，進樣精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品，自制備后，按上述擬定色譜條件方法操作，分別在0、1、2、4、8、12 h進樣，測定6個共有峰的相對保留時間，結(jié)果1、2、3、4、6號峰與參照物S峰（5號峰）的相對保留時間RSD分別為0.08%、0.03%、0.02%、0.02%和0.04%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定[10]。

2.4.4 三批乳癌術后方提取液特征圖譜的測定 取三批乳癌術后方提取液（批號分別為20141208、20150302-1、20150302-2）按擬定特征圖譜測定方法操作，測定結(jié)果見表4、圖6。由表4可知，三批圖譜與對照圖譜的相似度均高于95%。

3 討論

為臨床有效的經(jīng)驗方建立質(zhì)量控制標準是對臨床療效進行科學驗證的必經(jīng)之路，也是進一步開發(fā)中藥新藥的關鍵環(huán)節(jié)[11]。中藥藥效物質(zhì)基礎可以是單體化合物、有效部位以及中藥復方提取物[12-14]。筆者認為采用水提工藝制備制劑原料，可以使其有效成分盡可能與臨床用藥接近，是重現(xiàn)原方療效的有效途徑。然而，該條件下制備的中藥制劑原料主要為多成分的混合物，這給質(zhì)控標準的制訂提出了更高的要求。目前，建立復方中藥制劑質(zhì)量標準的方法主要有指標成分檢測、特征圖譜等[15-16]。指標成分檢測可以很好地對某味藥物或化合物建立定性、定量的標準來開展質(zhì)量監(jiān)控，但中藥制劑尤其是復方制劑具有多成分、多靶點整合作用的特點，進行單指標成分質(zhì)量控制顯然不具備代表性，多指標成分分析可以解決代表性不足的問題，但在有效成分無法明確的情況下應用就會受限[17]。相比之下，建立特征圖譜可以較為全面地反映中藥制劑中所含化學成分的種類與數(shù)量，尤其是在復方制劑中有效成分大部分未明確的情況下，能較全面地反映中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量[18-21]。因此，本研究選擇建立特征圖譜的方法以期更加全面準確地反映乳癌術后方復發(fā)制劑的主要原料成分。

在選擇指紋圖譜指標成分時，筆者查閱了藥典及相關文獻。乳癌術后方由黃芪、茯苓、淫羊藿、肉蓯蓉、莪術、蜂房、石見穿7味藥物組成，其中，石見穿未被藥典收載，白術、茯苓、莪術三味藥材在藥典中無明確的指標成分含量檢測要求。在進一步查閱文獻后，初步將黃芪的指標成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷，白術的指標性成分白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，淫羊藿的指標成分淫羊藿苷，肉蓯蓉的指標成分松果菊苷、毛蕊花糖苷作為指紋圖譜備選指標成分。其中，黃芪甲苷需要使用HPLC的ESLD檢測器檢測，其他指標成分均使用紫外檢測器，因此首先被排除。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的檢測波長為270 nm，白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的檢測波長為220 nm，淫羊藿苷的檢測波長為260 nm，松果菊苷、毛蕊花糖苷的檢測波長為330 nm。因此，最終選擇檢測波長相近的毛睿異黃酮葡萄糖苷和淫羊藿苷作為指紋圖譜的指標性成分。

乳癌術后方特征圖譜的建立為進一步物質(zhì)基礎研究提供了理論依據(jù)。但是，目前所建立的特征圖譜中運用的樣品數(shù)量較少，尚無法作為乳癌術后方的質(zhì)量標準。在后續(xù)研究中將進一步擴大樣本數(shù)量，建立指紋圖譜，從而為該復方制劑的藥物研發(fā)及臨床推廣應用提供切實可行的質(zhì)量控制標準。

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（收稿日期：2017-01-09 本文編輯：程 銘）