彭燕+楊小青+張翔+戴諄+宋金春

[摘要] 目的 探討蓮子心總生物堿毒性及對(duì)四氯化碳急性肝損傷的保護(hù)作用。 方法 一次性給予給藥組昆明小鼠（10只）口服灌胃量2000 mg/kg蓮子心總堿，對(duì)照組昆明小鼠（10只）給予同等劑量0.3%羧甲基纖維素鈉，密切觀察72 h內(nèi)兩組小鼠的表現(xiàn)中毒癥狀以評(píng)價(jià)其急性毒性。SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別作為空白對(duì)照組，模型組，陽性對(duì)照組（水飛薊素200 mg/kg），蓮子心總生物堿低、中、高劑量（100、200、400 mg/kg）組，以四氯化碳為誘導(dǎo)劑進(jìn)行肝損傷誘導(dǎo)，造模24 h后再禁食16 h，檢測(cè)大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平，肝組織勻漿液中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）活性，同時(shí)測(cè)定肝臟系數(shù)，并觀察肝臟組織病理切片。 結(jié)果 對(duì)于昆明小鼠蓮子心總生物堿安全劑量可高達(dá)2000 mg/（kg·d）。100、200、400 mg/kg蓮子心總生物堿可改善模型組大鼠肝臟系數(shù)，逆轉(zhuǎn)受損大鼠血清中ALT、AST、ALP以及TBIL水平（P < 0.05），恢復(fù)受損肝組織中氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的含量，降低MDA水平（P < 0.05），各指標(biāo)變換趨勢(shì)與劑量呈相關(guān)性。 結(jié)論 蓮子心總生物堿具有較高的安全性以及對(duì)急性肝損傷具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 蓮子心；總生物堿；抗氧化；急性肝損傷

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（a）-0025-05

Toxicity of Lotus plumule and its hepatoprotective for carbon tetrachloride leading acute hepatic damage

PENG Yan YANG Xiaoqing ZHANG Xiang DAI Zhun SONG Jinchun

Department of Pharmacy， Renming Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To discuss toxicity of Lotus plumule and its hepatoprotective for carbon tetrachloride leading acute hepatic damage. Methods Kunming mice （n=10） in drug group received 2000 mg/kg TALP， while Kunming mice in control group （n=10） received 0.3% sodium carboxymethyl cellulose at the same dose， then poisoning symptoms of mice were closely observed in 72 h and acute toxicity was evaluated. SD rats were randomly divided into 6 groups： blank control group， model group， positive control group （silymarin 200 mg/kg）， Lotus root total alkaloids low， medium and high dose group （100， 200， 400 mg/kg）， carbon tetrachloride induced acute liver injury， after molding 24 h and fasted for 16 h， the levels of serum alanine aminotransferase （ALT）， alkaline phosphatase （ALP）， total bilirubin （TBIL） and aspartate aminotrans ferase （AST） in serum，and the content of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione over activity of peroxidase （GSH-PX） and the content of malondialdehyde （MDA） were determined， the liver organ coefficient was also measured and pathological sections of the liver were observed. Results For Kunming mice， Lotus total alkaloid safe dose was as high as 2000 mg/（kg·d）. Liver organs coefficient of rats could be improved with 100， 200 and 400 mg/kg Lotus total alkaloid. The ALT， AST， ALP and TBIL in serum of injured rats were reversed （P < 0.05）， the SOD， CAT， GSH-Px recovered， and MDA contents reduced （P < 0.05）， changes tendency of index was related with dosage. Conclusion Lotus total alkaloid has high safety and protective effect on acute liver injury.

[Key words] Lotus plumule； Total alkaloids； Antioxidation； Acute liver injury

肝損傷是由多因素多環(huán)節(jié)所造成的肝細(xì)胞代謝狀態(tài)、生理功能以及組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為肝組織壞死、脂肪花、纖維化等，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝癌[1-3]。目前臨床上采用治療肝損傷的藥物以化學(xué)藥物為主，但化學(xué)藥物存在單一用藥效果不好，聯(lián)合用藥增加肝臟代謝負(fù)荷的矛盾[4-5]，使其應(yīng)用受限。因此，從天然產(chǎn)物中提取有效成分，挖掘治療肝損傷的新藥物已成為目前研究保護(hù)肝損傷藥物的熱點(diǎn)之一。

蓮子心（Lotus plumule）為睡蓮科蓮成熟種仁中的綠色胚芽，其主要成分之一為總生物堿（total alkaloids extracted from lotus plumule，TALP）。研究表明TALP具有廣泛的藥理學(xué)活性：如降壓，抑菌，降血脂、抑制肥胖，抗血栓作用，抗心律失常效應(yīng)等[6-10]。同時(shí)，已有研究者指出甲基蓮心堿可逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐受性[11]。但目前關(guān)于TALP的體內(nèi)肝保護(hù)研究較少。因此，本研究采用大鼠模型，研究TALP對(duì)體內(nèi)肝損傷是否具有保護(hù)作用，以期為找出適宜的肝保護(hù)制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

蓮子心總生物堿（TALP），本實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC檢測(cè)含量甲基蓮心堿（76.88±2.31）%，蓮心堿含量為（8.37±1.21）%，異蓮心堿含量為（11.24±1.45）%，0.5%二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；四氯化碳，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。水飛薊素對(duì)照品（批號(hào)：100281-200903，中國藥品生物制品檢定所），余下試劑均為分析純級(jí)別（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Bayer ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀（德國西門子），倒置熒光顯微鏡（Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康）；成像系統(tǒng)（Nikon DS-U3，日本尼康）。其他一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明（KM）小鼠（18±2）g，20只，雌雄各半。Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（200±20）g，60只。均從武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買（合格證：00003839、SCXK （鄂）2014-0013）。

1.4 方法

1.4.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

KM小鼠根據(jù)性別以及重量自然分組分為對(duì)照組與給藥組，10只/組。給藥組一次性灌胃給予TALP最大劑量為2000 mg/kg，對(duì)照組以同樣容積0.3% CMC-Na灌胃給藥，給藥后小鼠，72 h內(nèi)密切觀察自由正常飲食KM小鼠死亡率、日常行為、精力狀況以及飲食情況。

1.4.2 大鼠急性肝損傷試驗(yàn)

適應(yīng)環(huán)境后，將SD大鼠隨機(jī)分為6組，10只/組，分別為空白組、模型組、陽性對(duì)照組，蓮子心總生物堿低、中、高劑量組。其中，空白組、模型組大鼠口服灌胃給予0.3% CMC-Na劑量為1 mL/kg，大鼠口服灌胃給予200 mg/kg水飛薊素（0.3% CMC-Na溶解）；蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予100、200、400 mg/kg TALP（0.3% CMC-Na溶解），6組大鼠分別持續(xù)灌胃11 d，1次/d。第11天，繼各組大鼠灌胃給藥1 h后，模型組、陽性對(duì)照組、蓮子心總生物堿低、中、高劑量組分別腹腔注射50%橄欖油-四氯化碳溶液（注射劑量為2 mL/kg），同時(shí)，空白組大鼠腹腔注射同等劑量橄欖油（2 mL/kg）。試驗(yàn)期間，每天記錄大鼠體重，密切觀察大鼠飲食量。繼腹腔注射50%四氯化碳 24 h后，將所有實(shí)驗(yàn)大鼠禁食16 h后，心臟采血，血樣于3500 r/min，4℃，離心15 min，取上清液用于生化指標(biāo)的檢測(cè)。分離全部肝臟，制成10%勻漿液，并于4000 r/min，4℃，離心10 min，取上清作為肝臟勻漿液于-20℃冰箱中保存待用。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.3.1 臟器系數(shù)測(cè)定 待肝臟于紗布上濾干后，迅速采用分析天平稱重，計(jì)算肝臟的臟器系數(shù)。臟器系數(shù)（%）=臟器體重（g）/大鼠體重（g）×100%。

1.4.3.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）4個(gè)指標(biāo)。

1.4.3.3 肝組織勻漿液中氧化指標(biāo)檢測(cè) 分別按照試劑盒說明方法測(cè)定肝臟勻漿液中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA活性。

1.4.3.4 肝臟組織病理切片觀察 取一小塊，采用4%多聚甲醛固定肝臟，送檢測(cè)部門制作病理切片，蘇木精-伊紅染色（HE染色），于光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

給藥組小鼠均未表現(xiàn)出中毒死亡跡象。與對(duì)照組相比，給藥組小鼠72 h內(nèi)精神狀態(tài)明顯下降，日?；顒?dòng)量顯著減少，表現(xiàn)為嗜睡、閉眼、食欲減少、弓背。72 h后觀察，給藥組小鼠逐步恢復(fù)正常生活，飲食正常，活動(dòng)量增加，可推斷72 h后蓮子心總生物堿對(duì)小鼠正常生活無影響。

2.2 四氯化碳致大鼠急性肝損傷

2.2.1 臟器系數(shù)

TALP對(duì)大鼠肝臟系數(shù)的影響結(jié)果詳見表1。與空白組大鼠比較，模型組，陽性對(duì)照組，蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠，肝臟器系數(shù)均顯著性增加（P < 0.05）。與模型組組大鼠比較，空白組以及陽性對(duì)照組，蓮子心總生物堿中、高劑量組大鼠肝臟系數(shù)顯著性下降（P < 0.05）。

2.2.2 蓮子心總生物堿對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)影響

與空白組組大鼠比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL含量均明顯地上升（P < 0.05）；與模型組大鼠比較，陽性對(duì)照組以及蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL含量均明顯下降（P < 0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；口服中、高劑量蓮子心總生物堿大鼠血清中AST、ALP、TBIL水平與空白組大鼠比較，三項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；陽性對(duì)照組以及低劑量蓮子心總生物堿大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平均顯著性高于空白組大鼠（P < 0.05）。見圖1。

與空白組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P< 0.05；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALP：堿性磷酸酶；TBIL：總膽紅素；GroupⅠ：空白組；GroupⅡ：模型組；GroupⅢ：陽性對(duì)照組；GroupⅣ：蓮子心總生物堿低劑量組；GroupⅤ：蓮子心總生物堿中劑量組；GroupⅥ：蓮子心總生物堿高劑組

圖1 蓮子心總生物堿對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)影響

2.2.3 蓮子心總生物堿對(duì)大鼠肝組織勻漿液中氧化指標(biāo)的影響

與空白組大鼠比較，模型組大鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px含量均顯著性降低（P < 0.05），而MDA含量顯著性升高（P < 0.05）。與模型組大鼠比較，經(jīng)給藥后，陽性對(duì)照組，蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA水平均出現(xiàn)顯著性逆轉(zhuǎn)情況（P < 0.05）。與空白組大鼠比較，蓮子心總生物堿低、中、高劑量組大鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px含量均升高、MDA含量降低（P < 0.05）；蓮子心總生物堿低、中、高劑量組比較，肝組織中SOD、CAT、GSH-Px以及MDA水平變化均表現(xiàn)出顯著性的劑量依賴性（P < 0.05）。

與空白組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；GroupⅠ：空白組；GroupⅡ：模型組；GroupⅢ：陽性對(duì)照組；GroupⅣ：蓮子心總生物堿低劑量組；GroupⅤ：蓮子心總生物堿中劑量組；GroupⅥ：蓮子心總生物堿高劑組；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化酶；MDA：丙二醛

2.2.4 蓮子心總生物堿對(duì)大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織發(fā)生顯著性病變，口服灌胃給予水飛薊素、蓮子心總生物堿大鼠肝臟組織形態(tài)與模型組比較，均出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。且隨總生物堿劑量增大，細(xì)胞核邊緣可見，細(xì)胞間隙也更加清晰。見圖3。

3 討論

3.1 TALP對(duì)小鼠急性毒性作用研究

本研究采用最大量法研究72 h內(nèi)TALP對(duì)KM小鼠的影響。一次性給藥后72 h內(nèi)給藥組小鼠尤其在服藥2 h內(nèi)活動(dòng)量顯著減少，推測(cè)其可能原因在于過多劑量的藥物對(duì)小鼠消化產(chǎn)生一定負(fù)擔(dān)，而且蓮子心總生物堿味苦，在服藥初期會(huì)對(duì)小鼠精神以及生理活動(dòng)造成一定影響。72 h后，給藥組小鼠活動(dòng)與對(duì)照組小鼠一致，說明TALP對(duì)小鼠無毒性作用，口服安全劑量可高達(dá)2000 mg/（kg·d），為TALP的后期應(yīng)用提供安全性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)。

3.2 TALP對(duì)四氯化碳致肝損傷的保護(hù)作用

四氯化碳用于大鼠急性肝損傷造模是現(xiàn)在應(yīng)用較為廣泛的一種模式去探討肝臟受損的原理以及篩選安全有效的治療藥物。研究報(bào)道四氯化碳致肝毒性是由于肝毒性代謝物以及自由基引起，其機(jī)理與誘發(fā)人多種肝損傷機(jī)制類似。本研究采用50% 四氯化碳（橄欖油溶解，V/V）一次性腹腔注射具有操作簡(jiǎn)單，周期短，無實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡的優(yōu)點(diǎn)[12-13]。

根據(jù)TALP對(duì)受損大鼠肝臟系數(shù)的影響結(jié)果，結(jié)果表明TALP與水飛薊素具有減輕肝組織肥大、降低臟器系數(shù)的作用。ALT、AST、ALP以及TBIL水平是臨床上常用于評(píng)價(jià)急性肝臟疾病的生化指標(biāo)。模型組大鼠血清中上述4項(xiàng)指標(biāo)[14-17]與空白組相比，顯著性升高（P < 0.05），提示肝細(xì)胞受到損害，細(xì)胞膜通透性增加，結(jié)合圖3可證實(shí)亦示本研究中四氯化碳致急性肝損傷模型成功。與模型組大鼠相比，給予山飛薊素和蓮子心總生物堿的大鼠血清中上述4指標(biāo)均顯著降低（P < 0.05），說明TALP對(duì)生化指標(biāo)的影響具有與水飛薊素相似的趨勢(shì)，可初步證實(shí)亦示TALP具有保護(hù)肝臟的作用。TALP對(duì)受損大鼠體內(nèi)上述四種酶變化的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，提示總生物堿可通過提高SOD、CAT、GSH-Px水平，同時(shí)降低MDA活性，清除自由基，抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，以降低肝細(xì)胞的損傷程度。

臨床上常通過病理切片觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化來直觀判斷肝組織損傷情況[18]。根據(jù)圖3A、B對(duì)比可發(fā)現(xiàn)本研究采用腹腔注射50%四氯化碳造模成功致大鼠產(chǎn)生急性脂肪肝。通過對(duì)比圖3C、D、E、F，發(fā)現(xiàn)給藥后，肝組織中脂肪病變部位明顯得到改善，TALP與水飛薊素具有相同的護(hù)肝作用。說明TALP具有抑制組織過氧化的作用，此結(jié)論與前期所做的工作測(cè)定氧化酶活性變化一致[19-20]。

本研究首次將TALP作用于急性肝損傷大鼠模型中，以考察TALP體內(nèi)肝保護(hù)作用。結(jié)果表明，TALP具有廣泛的安全性，安全劑量可高達(dá)2000 mg/（kg·d）。同時(shí)，100、200、400 mg/kg TALP可通過恢復(fù)受損肝組織中氧化酶的活性，清除自由基，抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化達(dá)到有保護(hù)肝臟的作用，且400 mg/kg TALP對(duì)急性肝損傷的大鼠修復(fù)作用最強(qiáng)，為后期進(jìn)一步作為護(hù)肝藥物的遴選提供理論依據(jù)。

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