曹乾超，張雅芬，胡 鵬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，浙江 杭州 310018)

菰黑粉菌菌絲形成相關基因UeSsk2 的克隆及表達分析

曹乾超，張雅芬，胡 鵬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，浙江 杭州 310018)

基于菰黑粉菌全基因組測序結果及其酵母型和菌絲型轉錄組差異化表達數據庫，結合RACE技術克隆獲得一個長度為7 625 bp的基因，其中編碼序列為5 874 bp，無內含子.結構及聚類分析結果表明該基因編碼的MAPKKK蛋白激酶，屬于Hog1信號途徑，與大麥堅黑粉菌中的Ssk2親緣關系最近.表達分析結果顯示：UeSsk2在菌絲誘導形成過程中持續(xù)上調表達，而在生長受到抑制的菌絲細胞中其表達無顯著變化或受到抑制，表明UeSsk2與菌絲形成具有相關性.同時，經生物傳感器進行的蛋白互作檢測結果表明，UeSsk2與前期發(fā)現(xiàn)的UeMkk1不存在蛋白互作關系，表明該蛋白參與其他MAPK途徑來影響菌絲形成及生長.

菰黑粉菌；絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶；UeSsk2基因；二型態(tài)轉換

菰黑粉菌(Ustilagoesculenta)屬擔子菌亞門黑粉菌屬，是典型的二型態(tài)真菌(酵母型和菌絲型)，茭白是其已知的唯一寄主[1].目前研究表明，茭白植株與菰黑粉菌互作使植株莖部膨大形成了可食用的茭白[2]，是我國主要的水生蔬菜之一.菰黑粉菌菌絲的侵染發(fā)生在茭白肉質莖膨大之前，對茭白孕茭至關重要[3]，所以菰黑粉菌二型態(tài)轉換(菌絲的形成及增殖)可能是茭白正常孕茭的關鍵.

真菌二型態(tài)轉換[4-5]是指自然界中某些真菌受到外界環(huán)境中物理、化學、營養(yǎng)等因素的刺激，誘導細胞內cAMP-PKA(Cyclicaden-osinemono phosphate-protein kinase A)、MAPK(Mitogen-activated protein kinase)等信號傳導途徑發(fā)生改變，從而使二型態(tài)真菌發(fā)生單細胞酵母型和多細胞菌絲型間的轉換，被公認是真菌快速適應外界環(huán)境及宿主多變微環(huán)境的生存機制[4-6].其中MAPK信號傳導途徑由絲裂原活化蛋白(MAPK、MAPKK、MAPKKK)三級激酶級聯(lián)組成[7]，在真菌的致病性和二型態(tài)轉換過程中具有重要作用.

迄今在酵母(Saccharomycescerevisiae)中已發(fā)現(xiàn)五條MAPK信號途徑(Hog1、Fus3、Kss1、Slt2和Smk1信號途徑)，分別調控高滲透壓脅迫反應、交配反應、菌絲的形成、細胞完整性和孢子形成等過程[8-10].其中Hog1信號途徑是菌體在高滲環(huán)境中生長所必需的[11-12]，上游存在兩個MAPKKK蛋白調控系統(tǒng)用于激活傳遞，其中一個是由Ssk2和Ssk22共同組成的組氨酸激酶磷酸化Pbs2從而激活Hog1的調控途徑，另一個是由Sho1和Msb2誘導的由Ste11激活Pbs2的途徑[13].近期研究表明，該途徑還響應了其它非滲透壓的脅迫，如低溫、酸性環(huán)境和亞砷酸鹽等[14-16]，研究發(fā)現(xiàn)多數二型態(tài)真菌中該途徑基因的突變會顯著影響菌絲形成，如解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)中編碼Ste11的基因突變后只能產生酵母型細胞[17]，玉米黑粉菌ubc4突變體中菌絲形成也受到影響[18]，白念珠菌(Candidaalbicans)中編碼Hog1的基因突變影響其融合及形態(tài)轉換[19]，表明該途徑還可能參與菌絲的形成.實驗室前期已對MAPK信號途徑基因展開研究，如UeMkk1、UeKss1[20-21]，但都是在MAPK途徑中下游.為了進一步完善菰黑粉菌的MAPK途徑，我們基于酵母型和菌絲型菰黑粉菌中的差異化蛋白測序分析并結合表達譜分析結果，發(fā)現(xiàn)在菌絲型中大量MAPK途徑基因顯著上調表達[22-24].其中一個未知基因在全基因組中未找到完整的開放閱讀框，因此本實驗根據茭白膨大前后菰黑粉菌的轉錄組數據結合RACE技術的要求，設計特異性引物，克隆獲得了該基因全長序列，通過基因結構、同源性及系統(tǒng)進化分析表明，該基因編碼MAPKKK Ssk2的同源蛋白，故命名為UeSsk2.同時我們發(fā)現(xiàn)UeSsk2在菌絲誘導形成過程中持續(xù)上調表達，可能參與調控菌絲形成.通過生物傳感器檢測發(fā)現(xiàn)UeSsk2與UeMkk1不存在蛋白互作關系，表明UeSsk2與UeMkk1可能不屬于同一條MAPK信號途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

菰黑粉菌采用組織切片法[25]分離自桐鄉(xiāng)采集的龍茭2號正常茭，-80 ℃保存.

1.2 實驗方法

1.2.1 菰黑粉菌基因組DNA及總RNA的提取

通過體外培養(yǎng)收集菌絲型菰黑粉菌的菌體，并在全自動樣品研磨儀中破碎，采用CTAB法[26]提取其基因組DNA.液氮速凍菰黑粉菌菌體后快速研磨至粉末，按照TRIzol試劑(Invitrogen)說明書提取其總RNA.利用反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，Takara)反轉錄獲得cDNA第一鏈，以擴增較長目的基因序列，而熒光定量PCR中用到的cDNA模板參照試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara)說明書進行反轉錄.

1.2.2 菰黑粉菌UeSsk2基因的克隆及序列分析

根據酵母型和菌絲型菰黑粉菌轉錄組測序結果和全基因組測序結果，對基因保守序列設計特異性引物UeSsk2-F1和UeSsk2-R1(表1)，對反轉錄獲得的cDNA第一鏈進行PCR擴增.根據確認的保守序列以及RACE試劑盒(BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit，Clotech)說明書，分別設計特異性引物(表1)，按操作說明擴增UeSsk2基因的3’端和5’端序列，經測序確認.利用序列拼接軟件(Clone Manager)將所有獲得的序列進行拼接，并在序列兩端設計引物UeSsk2-cF與UeSsk2-cR(表1)擴增UeSsk2 cDNA全長序列. 利用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)判斷UeSsk2可能的編碼框，并設計特異性引物UeSsk2-gF和UeSsk2-gR(表1)擴增該基因在基因組上的序列，再通過Clone Manager軟件比對確認內含子情況.

1.2.3 菰黑粉菌UeSsk2基因的表達分析

參照實驗室曾使用的方法[20-21]，將菌絲型菰黑粉菌經YEPS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600為1.5后涂布，28 ℃倒置培養(yǎng)，每隔兩天取樣，以β-actin基因作為內參基因，進行qRT-PCR分析，引物見表1.反應在StepOneTMReal-Time PCR System(ABI)檢測系統(tǒng)上進行，qRT-PCR反應體系(20 μL)為：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)，0.5 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L)，0.5 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，0.5 μL cDNA模板，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，8.1 μL無菌水.反應程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)，每個反應設置3次重復.最終熒光所得Ct值數據采用2-ΔΔCt法進行計算[27]，并在SPSS軟件中對其進行顯著性差異分析.

1.2.4 UeSsk2蛋白的表達純化

根據UeSsk2 cDNA序列設計特異性引物UeSsk2-pF和UeSsk2-pR(表1)，以菰黑粉菌cDNA為模板，擴增UeSsk2基因的CDS序列.采用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ(Takara)分別酶切獲得的UeSsk2 CDS序列片段和pET-28a(+)載體，T4連接酶(Takara)連接后，轉入大腸桿菌原核表達菌株Rosetta-gami B(DE3)，測序驗證后，將該重組質粒命名為UeSsk2-pET-28a.采用張雅芬等[20-21]的方法誘導表達UeSsk2蛋白，經超聲破碎后將獲得的粗蛋白按照Ni-NTA法[20-21]分別選用50、100、200、300、400 mmol/L的咪唑進行梯度洗脫.采用SDS-PAGE凝膠電泳對梯度洗脫收集到的蛋白進行驗證分析，以便確認最佳的洗脫液濃度.

表1 實驗相關引物列表

1.2.5 UeSsk2與UeMkk1蛋白的互作分析

實驗室前期已經獲得高純度的UeMkk1蛋白，對其進行封閉以去除組氨酸標簽.蛋白互作檢測在Octet Dip and ReadTM生物傳感器上進行[28]，將傳感器探頭插入已注入10 μL PBS (NaCl 12 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO41.44 g/L，KH2PO40.24 g/L，調pH至7.4)的檢測孔中，然后運行程序設置基線，再注入10 μL純化的UeSsk2蛋白并進行檢測，隨后重新設置基線，最后注入10 μL封閉的UeMkk1蛋白，每次注入不同的樣品前須用PBS對檢測孔進行清洗.

2 結果與分析

2.1 菰黑粉菌UeSsk2基因的克隆及結構分析

根據酵母型和菌絲型菰黑粉菌轉錄組中的差異化表達數據庫以及菰黑粉菌的全基因組測序結果，我們發(fā)現(xiàn)一個MAPK途徑基因，但是未能發(fā)現(xiàn)其完整的開放閱讀框.因此根據預測得到的一段500 bp左右的保守序列，先進行擴增，測序確認該保守序列長538 bp(圖1a).利用此序列設計向外擴增的引物，經3’ RACE的方法擴增得到了247 bp的3’端cDNA序列(圖1b).由于該序列的5’端存在大片段的缺失，因此設計了5’ RACE引物(表1)對cDNA進行分步擴增，并逐一經測序確認，最后采用Clone Manager軟件拼接形成完整的cDNA序列.

通過NCBI的ORF finder功能預測其可能的開放閱讀框區(qū)域，設計兩端引物UeSsk2-gF和UeSsk2-gR(表1)，擴增UeSsk2在菌絲型菰黑粉菌基因組DNA上的序列，經測序確認擴增得到的基因組片段長度為5 874 bp(圖1i)，Clone Manager軟件比對發(fā)現(xiàn)基因中無內含子.綜合以上信息，我們獲得了長度為7 625 bp，包含一個5 874 bp的完整編碼框.其余為非編碼區(qū)，包括1 669 bp的5’端調控區(qū)及82 bp的3’端調控區(qū)，其中3’端非編碼區(qū)中存在poly(A)結構.NCBI比對結果及序列結構分析表明，該基因與其他真菌中的Ssk基因具有較高的序列同源性，因此我們將其命名為UeSsk2(GenBank登錄號KR870331).

a：UeSsk2基因中間保守序列的PCR產物；b：UeSsk2基因3’RACE 的PCR產物；c-h：UeSsk2基因5’RACE的 PCR產物；i：UeSsk2基因的基因組序列PCR產物；以上圖片中左邊為DNA Maker (a-h，DL2000；i，DL10000)；右邊紅色箭頭指示目的片段圖1 RACE法擴增UeSsk2基因片段Figure 1 Amplification of UeSsk2 gene by RACE

2.2 菰黑粉菌UeSsk2的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNAman軟件將UeSsk2蛋白與酵母中已知的MAPK途徑基因編碼的蛋白進行多序列同源性比對，結果表明該蛋白與酵母中的MAPKKK蛋白聚為一類，且與Ssk2蛋白同源性最高(圖2a)，進一步證明該蛋白屬于Hog1途徑的MAPKKK激酶[10].接下來我們采用近鄰法對UeSsk2構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)菰黑粉菌中UeSsk2與賓地瘤黑粉菌(Melanopsichiumpennsylvanicum4)、玉米黑粉菌(U.maydis)、玉米絲黑穗病菌(SporisoriumreilianumSRZ2)、大麥堅黑粉菌(Ustilagohordei)聚為一個分支(圖2b)，且與大麥堅黑粉菌的親緣關系最近.

圖2 UeSsk2的系統(tǒng)發(fā)育分析Figure 2 Phylogenetic analysis of UeSsk2

2.3UeSsk2基因在四種培養(yǎng)基誘導下的表達特征分析

前期實驗發(fā)現(xiàn)，真菌常規(guī)培養(yǎng)基PDA對菰黑粉菌菌絲生長具有抑制作用，而蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基能顯著誘導菌絲生長，結果如圖3：在蔗糖誘導培養(yǎng)2 d后酵母型菰黑粉菌就開始融合并進行菌絲生長；在其它碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d后也未見明顯菌絲出現(xiàn)，但是在形態(tài)上出現(xiàn)細胞伸長或多位點芽殖(圖片未呈現(xiàn))等現(xiàn)象；而在PDA培養(yǎng)基中菰黑粉菌一直維持酵母形態(tài)生長，形態(tài)與對照無明顯差別(圖3).同時，收集這五個時期的菌體，提取其RNA并進行反轉錄，通過實時定量PCR檢測不同樣品中UeSsk2的表達變化情況.結果表明，UeSsk2在不同處理前的表達量沒有顯著差異，表明用于不同處理的實驗材料比較可靠.對培養(yǎng)2、4、6、8 d后UeSsk2的表達量進行比較分析，結果顯示UeSsk2的表達量在蔗糖誘導第二天開始顯著上升且隨著誘導時間延長表達量持續(xù)上升，而在其它培養(yǎng)基中，UeSsk2的表達量在6～8 d后才開始上升，且顯著低于蔗糖培養(yǎng)基中UeSsk2的表達量，約只有其三分之一，而在PDA培養(yǎng)基中，UeSsk2的表達受到明顯抑制(圖4).

圖3 菰黑粉菌在不同誘導培養(yǎng)基中的顯微形態(tài)觀察(2 d)Figure 3 Microscopic observation of U. esculenta under different induced medium(2 d)

圖4 菰黑粉菌UeSsk2的差異表達分析Figure 4 Differential expression analysis of UeSsk2 in U. esculenta

2.4 UeSsk2的原核表達及其與UeMkk1蛋白的互作分析

前期已發(fā)現(xiàn)MAPKK蛋白UeMkk1能作用于二型態(tài)轉換，因此為了進一步證實UeSsk2蛋白是否與UeMkk1蛋白互作，從而參與該MAPK途徑作用于二型態(tài)轉換.本次實驗中我們首先通過原核表達獲得了有活性且?guī)в蠬is標簽的UeSsk2蛋白，經Ni柱進行純化，收集純化過程中的樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)低濃度的咪唑(50 mmol/L)具有較好的洗脫效果(圖5)，因此實驗大量純化UeSsk2蛋白后采用生物傳感器驗證法驗證其與UeMkk1蛋白的互作，先設置基線(圖6第一段)，然后將UeSsk2蛋白注入后觀察可發(fā)現(xiàn)第二段曲線生成，且曲線有所上升，說明已將UeSsk2成功地注入并和傳感器進行結合，此時再重新設置基線(圖6第三段)，然后注入已封閉的UeMkk1蛋白，可觀察到第四段曲線生成(圖6)，但是生成的第四段曲線沒有上升，說明UeSsk2與UeMkk1不存在互作關系.

M—蛋白Marker 250 kDa；1—裂解后上清液；2—流出液；3—第一次漂洗液；4—50 mmol/L咪唑洗脫液；5—100 mmol/L咪唑洗脫液；6—200 mmol/L咪唑洗脫液；7—300 mmol/L咪唑洗脫液；8—400 mmol/L咪唑洗脫液圖5 不同濃度咪唑洗脫下UeSsk2蛋白的純化結果Figure 5 Purification of UeSsk2 under different concentrations of imidazole

圖6 UeSsk2和UeMkk1的蛋白互作檢測Figure 6 Detection results of interaction between UeSsk2 and UeMkk1

3 討 論

菰黑粉菌與茭白植株互作是茭白孕茭的關鍵，研究發(fā)現(xiàn)菌絲在11月和翌年3月通過母墩上的節(jié)侵染入芽[3]，所以研究菰黑粉菌如何實現(xiàn)特定時期特異組織的侵染和繁殖可能是闡明茭白孕茭機制的一個突破點.菰黑粉菌屬黑粉菌屬，需要在合適條件下由無侵染能力的酵母型轉換成具有侵染能力的菌絲型，從而實現(xiàn)從植物細胞中獲得養(yǎng)分達到增殖的目的[3,29,30].且前期大量研究表明，MAPK信號途徑在二型態(tài)轉換及菌絲生長過程中具有重要作用[7].本文第一次克隆到了菰黑粉菌的一個MAPKKK基因，我們對擴增得到的UeSsk2基因及其蛋白結構進行分析，結果表明，該基因不存在內含子，且具有保守的Ser/Thr結構域及位點，與其它真菌的同源性高達70%，且保守結構域同源性在95%以上，表明該基因在物種間比較保守，可能行使十分重要的功能.在本研究中，我們獲得了長約3 000 bp的5’端未知序列，表明我們的RACE實驗非常成功，該實驗中間產物，即用于后續(xù)特異性擴增的cDNA模板，完整性好，可以用于其它基因全長的擴增，為豐富菰黑粉菌基因庫提供了良好的材料.

另外，我們前期已發(fā)現(xiàn)蔗糖能較好地誘導菰黑粉菌菌絲形成和生長，而PDA、麥芽糖和葡萄糖培養(yǎng)基不利于菌絲形成和生長[20-21](圖3)，所以我們通過實時熒光定量PCR來檢測分析UeSsk2在以上不同碳源培養(yǎng)基誘導下的表達特征，結果表明：UeSsk2在蔗糖誘導菌絲形成過程中顯著上調表達(圖4)，由此可知該基因可能參與調控了菰黑粉菌菌絲的形成和生長.由于前期課題組已經發(fā)現(xiàn)UeMkk1、UeKss1等MAPK途徑蛋白參與調控菰黑粉菌菌絲形成及生長[20-21]，為了進一步闡明UeSsk2是否作用于蛋白UeMkk1的上游，我們進行了生物感應器的實驗驗證，結果表明兩者并不存在互作，即UeSsk2并不參與調控UeMkk1所在的Slt2信號途徑[20].鑒于同源比對結果及系統(tǒng)進化分析，我們推測UeSsk2作用于Hog1信號途徑.

對酵母Hog1信號途徑研究發(fā)現(xiàn)其主要調控高滲透壓脅迫反應[8-10]，而Ssk2是該途徑其中一條調控路徑中的MAPKKK.另外，該途徑還響應了其它非滲透壓的脅迫，如低溫、酸性環(huán)境和亞砷酸鹽等[14-16].我們的研究結果表明，UeSsk2屬于MAPKKK蛋白，且與Ssk2同源性較高(圖2a)，而且該基因可能參與菰黑粉菌對碳源代謝利用的響應，調控菰黑粉菌菌絲的形成及生長，預示著Hog1信號途徑可能還參與碳源利用、菌絲形成及生長等過程，與近期在白念珠菌中發(fā)現(xiàn)的功能類似[19].因此，UeSsk2基因的成功克隆及在不同碳源誘導下的表達特征分析對以后研究該基因在菰黑粉菌二型態(tài)轉換中的作用以及Hog1信號途徑在二型態(tài)轉換及菌絲生長中的作用奠定了非常重要的基礎.同時，實驗室已成功建立了基于原生質體轉化的菰黑粉菌遺傳轉化體系[31]，能夠對UeSsk2基因進行敲除及相關互補，有利于對其功能作進一步的驗證分析.

[1] CHUNG K R, TZENG D D. Nutritional requirements of the edible gall-producing fungusUstilagoesculenta[J]. Journal of Biological Sciences,2004,4(2):246-252.

[2] CHAN Y S, THROWER L B. The host-parasite relationship betweenZizaniacaducifloraTurcz. andUstilagoesculentaP. Henn. III. carbohydrate metabolism ofU.esculentaand the host-parasite combination[J]. New Phytologist,1980,85(2):217-224.

[3] ZHANG J Z, CHU F Q, GUO D P, et al. Cytology and ultrastructure of interactions betweenUstilagoesculentaandZizanialatifolia[J]. Mycological Progress,2012,11(2):499-508.

[4] GAUTHIER G M. Dimorphism in fungal pathogens of mammals, plants, and insects[J]. PLoS Pathogens,2015,11(2):e1004608.

[5] NADAL M, GARCíA-PEDRAJAS M D, GOLD S E. Dimorphism in fungal plant pathogens[J]. FEMS Microbiology Letters,2008,284(2):127-134.

[6] STURME M H J, PUCCIA R, GOLDMAN G H, et al. Molecular biology of the dimorphic fungiParacoccidioidesspp[J]. Fungal Biology Reviews,2011,25(2):89-97.

[7] SCHAEFFER H J, WEBER M J. Mitogen-activated protein kinases: specific messages from ubiquitous messengers[J]. Molecular and Cellular Biology,1999,19(4):2435-2444.

[8] ZHAO X H, MEHRABI R, XU J R. Mitogen-activated protein kinase pathways and fungal pathogenesis[J]. Eukaryotic Cell,2007,6(10):1701-1714.

[9] HERSKOWITZ I. MAP kinase pathways in yeast: for mating and more[J]. Cell,1995,80(2):187-197.

[10] CHEN R E, THORNER J. Function and regulation in MAPK signaling pathways: lessons learned from the yeastSaccharomycescerevisiae[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research,2007,1773(8):1311-1340.

[11] HOHMANN S. Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2002,66(2):300-372.

[12] SAITO H, TATEBAYASHI K. Regulation of the osmoregulatory HOG MAPK cascade in yeast[J]. Journal of Biochemistry,2004,136(3):267-272.

[13] O’ROURKE S M, HERSKOWITZ I. A third osmosensing branch inSaccharomycescerevisiaerequires the Msb2 protein and functions in parallel with the Sho1 branch[J]. Molecular and Cellular Biology,2002,22(13):4739-4749.

[14] PANADERO J, PALLOTTI C, RODRíGUEZ-VARGAS S, et al. A downshift in temperature activates the high osmolarity glycerol (HOG) pathway, which determines freeze tolerance inSaccharomycescerevisiae[J]. Journal of Biological Chemistry,2006,281(8):4638-4645.

[16] MOLLAPOUR M, PIPER P W. Hog1p mitogen-activated protein kinase determines acetic acid resistance inSaccharomycescerevisiae[J]. FEMS Yeast Research,2006,6(8):1274-1280.

[17] CERVANTES-CHAVEZ J A, RUIZ-HERRERA J. STE11 disruption reveals the central role of a MAPK pathway in dimorphism and mating inYarrowialipolytica[J]. FEMS Yeast Research,2006,6(5):801-815.

[18] ANDREWS D L, EGAN J D, MAYORGA M E, et al. TheUstilagomaydisubc4 andubc5 genes encode members of a MAP kinase cascade required for filamentous growth[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions,2000,13 (7):781-786.

[19] LIANG S H, CHENG J H, DENG F S, et al. A novel function for Hog1 stress-activated protein kinase in controlling white-opaque switching and mating inCandidaalbicans[J]. Eukaryotic Cell,2014,13(12):1557-1566.

[20] 胡鵬,張雅芬,崔海峰,等.菰黑粉菌MAPKK同源基因UeMkk1的全長克隆及表達[J].農業(yè)生物技術學報,2016,24(3):406-415. HU P, ZHANG Y F, CUI H F, et al. Full length cloning and expression of mitogen-activated protein kinase kinase homolog geneUeMkk1 inUstilagoesculenta[J]. Journal of Agricultural Biotechnology,2016,24(3):406-415.

[21] 張雅芬,胡鵬,崔海峰,等.菰黑粉菌MAPK同源基因UeKss1的克隆及表達[J].植物病理學報,2016,46(5):634-644. ZHANG Y F, HU P, CUI H F, et al. Cloning and expression of mitogen-activated protein kinase homolog geneUeKss1 inUstilagoesculenta[J]. ACTA Phytopathologica Sinica,2016,46(5):634-644.

[22] 金曄,崔海峰,安欣欣,等.龍茭2號耐冷相關差異表達蛋白鑒定及分析[J].農業(yè)生物技術學報,2015,23(4):502-512. JIN Y, CUI H F, AN X X, et al. Identification and analysis of differential expression proteins realated to chilling tolerance in Longjiao 2 (Zizanialatifolia) [J]. Journal of Agricultural Biotechnology,2015,23(4):502-512.

[23] LIU Q, YOU W Y, YU X P, et al. A preliminary study on proteome variations associated with gall formation inZizanialatifoliaTrucs[J]. Plant Molecular Biology Reporter,2010,29(2):360-368.

[24] YOU W Y, LIU Q, ZOU K Q, et al. Morphological and molecular differences in two strains ofUstilagoesculenta[J]. Current Microbiology,2011,62(1):44-54.

[25] 曹乾超,張雅芬,崔海峰,等.菰黑粉菌分離方法的研究[J].長江蔬菜,2015,22:195-197. CAO Q C, ZHANG Y F, CUI H F, et al. Research on methods of isolatingUstilagoeschlenta[J]. Journal of Changjiang Vegetables,2015,22:195-197.

[26] POREBSKI S, BAILEY L G, BAUM B R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components[J]. Plant Molecular Biology Reporter,1997,15(1):8-15.

[27] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

[28] 應榮.茭白黑粉菌cAMP及MAPK途徑關鍵基因的克隆及表達分析[D].杭州:中國計量大學,2014. YING R. Cloning and expression analysis of key genes of cAMP pathway and MAPK pathway inUstilagoesculenta[D]. Hangzhou: China Jiliang University,2014.

[29] 李志蘭,尤文雨,鄒克琴,等.菰黑粉菌孢子萌發(fā)過程形態(tài)學觀察及系統(tǒng)發(fā)育研究[J].中國計量學院學報,2010,21 (2):58-63. LI Z L，YOU W Y，ZOU K Q，et al. Morphological observation and phylogenetic analysis ofUstilagoesculenta[J]. Journal of China University of Metrology,2010,21(2):58-63.

[30] TERRELL E E, BATRA L R.ZizanialatifoliaandUstilagoesculenta, a grass-fungus association[J]. Economic Botany,1982,36(3):274-285.

[31] YU J J, ZHANG Y F, CUI H F, et al. An efficient genetic manipulation protocol forUstilagoesculenta[J]. FEMS Microbiology Letters,2015,362(12):1-7.

Cloning and expression analysis of hyphal formation-related geneUeSsk2 inUstilagoesculenta

CAO Qianchao, ZHANG Yafen, HU Peng, CUI Haifeng, YU Xiaoping, YE Zihong

(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology, Inspection and Quarantine, College of Life Sciences,China Jiliang University, Hangzhou 310018, China)

Based on the whole genome sequencing database ofUstilagoesculentaand its different expression of transcriptome sequencing data from yeast and mycelial form, a gene of 7 625 bp was cloned by RACE (rapid-amplification of cDNA ends) technique. The gene contains 5 874 bp coding sequence without introns. Structure and cluster analysis showed that the protein encoded byUeSsk2 was a kind of mitogen activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK), belonging to the Hog1 signal pathway, with the closest relation with Ssk2 inUstilagohordei. Expression analysis showed thatUeSsk2 was continuously up-regulated in the hyphal growth process, but the expression was not obviously changed or inhibited when the hyphal growth was inhibited, indicating the involvement ofUeSsk2 in hyphal formation. Moreover, the detection results of interaction between proteins by biosensor showed that protein UeSsk1 could not interact with UeMkk1 discovered early, indicating thatUeSsk2 regulated the hyphal formation and growth ofU.esculentain another MAPK pathway.

Ustilagoesculenta; mitogen-activated protein kinase kinase kinase;UeSsk2 gene; dimorphism

2096-2835(2017)02-0252-09

10.3969/j.issn.2096-2835.2017.02.019

2017-03-16 《中國計量大學學報》網址：zgjl.cbpt.cnki.net

國家自然科學基金資助項目(No.31470785)，浙江省自然科學基金資助項目(No.LQ15C140003).

曹乾超(1990-)，女，山東省臨沂人，碩士研究生，主要研究方向為植物與微生物互作.E-mail:575872976@qq.com 通信聯(lián)系人：葉子弘，女，教授.E-mail:zhye@cjlu.edu.cn

Q751

A