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(1.三明出入境檢驗(yàn)檢疫局,福建三明 365000; 2.寧德出入境檢驗(yàn)檢疫局,福建寧德 352000)

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唐慶強(qiáng)1,陳澤宇1,陳舒奕2,張信仁1,程立軍1,張?jiān)?

(1.三明出入境檢驗(yàn)檢疫局,福建三明 365000; 2.寧德出入境檢驗(yàn)檢疫局,福建寧德 352000)

采用高效液相色譜(HPLC)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)聯(lián)用測(cè)定香菇及香菇培養(yǎng)料中亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)、一甲基砷酸鹽(MMA)、二甲基砷酸鹽(DMA)和砷甜菜堿(AsB)等5種砷元素化合物。樣品經(jīng)70 ℃超聲萃取,陰離子色譜柱分離,ICP-MS檢測(cè),5種不同形態(tài)的砷分離效果良好,線性范圍0～100.0 ng/mL,相關(guān)系數(shù)在0.9999以上,加標(biāo)回收率81.0%～108.9%之間,相對(duì)偏差1.6%～6.3%(n=6)。用實(shí)際樣品檢測(cè),培養(yǎng)料中的砷元素主要以As(V)的形式存在,其含量與栽培時(shí)間關(guān)系不大。鮮香菇和干香菇中則含有較多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,雖然總砷結(jié)果符合國(guó)標(biāo)限量要求,但高毒的無(wú)機(jī)砷占大多數(shù)。

高效液相色譜聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)，香菇，培養(yǎng)料，砷，形態(tài)分析

香菇是一種味道鮮美且富含香菇多糖、香菇嘌呤、核酸、麥角甾醇等生理活性成分的食用菌。研究表明,經(jīng)常食用香菇能夠增加人體免疫力,還具有防癌抗癌、降低血壓和膽固醇的作用[1]。種植香菇的栽培基質(zhì)主要是木屑、棉籽殼、玉米芯、秸桿、麥麩等農(nóng)林副產(chǎn)品,同時(shí)需要加入一定量的石灰、石膏、過(guò)磷酸鈣等添加劑,木本植物對(duì)重金屬有一定的吸收積累、轉(zhuǎn)化作用,使其不能短期釋放到環(huán)境中。有研究表明,香菇在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)化和富集培養(yǎng)基中的重金屬[2]。近年來(lái)關(guān)于香菇中檢出砷元素的報(bào)道不斷增加,如王玥龍[3]測(cè)定了大慶地區(qū)的鮮香菇中的砷,其總砷含量范圍為0.150～0.445 mg/kg,高于黑木耳、干黃蘑和干榛蘑。鄭偉華等[4]測(cè)定了烏魯木齊地區(qū)多種食用菌中的砷,含量范圍為4.6×10-4～0.42 mg/kg,檢出率為100%。胡桂仙等[5]測(cè)定了浙江省香菇中的砷,干制香菇中總砷的含量范圍為0.150～0.950 mg/kg,同時(shí)測(cè)定的黑木耳和銀耳。

砷的化合物形態(tài)主要包括有機(jī)砷和無(wú)機(jī)砷兩大類,無(wú)機(jī)砷包括亞砷酸鹽(As(Ⅲ))和砷酸鹽(As(Ⅴ)),有機(jī)砷包括一甲基砷酸鹽(MMA)、二甲基砷酸鹽(DMA)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿和砷糖等[6]。不同形態(tài)的砷毒性差異很大,砷糖、砷甜菜堿等有機(jī)砷幾乎沒(méi)有毒性,而無(wú)機(jī)砷的毒性卻很高。國(guó)際癌癥研究中心已將無(wú)機(jī)砷及其化合物確認(rèn)為I級(jí)致癌物質(zhì),并將一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)列為潛在的致癌物質(zhì)[7-8]。

目前國(guó)內(nèi)外常采用高效液相色譜(HPLC)聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)[9-10]、原子熒光光譜(AFS)[11-12]等方法分析不同形態(tài)的砷化合物。液相色譜聯(lián)用氫化物發(fā)生-原子熒光法(HPLC-AFS)雖然較為常用,但分析結(jié)果最全面可靠的是液相色譜串聯(lián)有機(jī)質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,探討使用高效液相色譜聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜法,檢測(cè)香菇及其培養(yǎng)料中多種砷形態(tài)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

Altus A-10型高效液相色譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司;NexION 300D型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司;3-18K高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;VERSASTAR型酸度計(jì) 美國(guó)Thermo公司;M S 3D S25型渦旋儀 德國(guó)IKA公司。

1.2液相色譜及ICP-MS條件

色譜柱:Dionex IonPac AS19(250 mm×4.0 mm)陰離子交換柱;Dionex IonPac AS19(50 mm×4.0 mm)陰離子保護(hù)柱;流動(dòng)相:A相(10 mmol/L乙酸鈉,3 mmol/L硝酸鉀,2 mmol/L磷酸二氫鈉,0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鐵鈉(EDTA),用氨水調(diào)節(jié)pH至10.7),B相(無(wú)水乙醇):A+B=99+1。流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:50 μL;ICP-MS功率:1350 W;高純氬氣為載氣;泵速20 r/min;駐留時(shí)間:1000 ms;采集質(zhì)量數(shù)m/z=75;采集模式:標(biāo)準(zhǔn)模式。

1.3樣品處理

稱取4.0 g香菇或香菇培養(yǎng)料,加入38 mL純水,渦旋混勻后,在70 ℃水浴中超聲提取40 min,加入2 mL 3%乙酸溶液沉淀蛋白,于冰箱中4 ℃靜置10 min,于4 ℃高速離心機(jī)中以18000 r/min離心5 min,取上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.4數(shù)據(jù)處理

用Empower3軟件處理檢測(cè)結(jié)果和數(shù)據(jù),外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1流動(dòng)相選擇

文獻(xiàn)中有使用碳酸銨[14]、磷酸氫二銨+硝酸銨[15]、碳酸鈉+乙酸鈉[16]等作為流動(dòng)相,考慮到砷的化合物多是以離子形式存在,并且常用磷酸鹽作為陰離子淋洗液,故選用磷酸二氫鈉作為流動(dòng)相,乙酸鈉能改善AsB、DMA和As(Ⅲ)的分離度,并加入EDTA保護(hù)陰離子色譜柱。香菇培養(yǎng)料主要包括雜木、石膏等物質(zhì),含有較高的氯化物,加入硝酸鉀能改變氯離子的出峰時(shí)間,避免對(duì)As造成干擾。同時(shí),有文獻(xiàn)記載[17]加入乙醇后測(cè)試的靈敏度可增高,因此在流動(dòng)相中加入1%的乙醇,并調(diào)節(jié)pH改變各種形態(tài)砷在陰離子柱上的保留時(shí)間來(lái)達(dá)到良好的分離效果。通過(guò)對(duì)以上影響因素的分析并參考相關(guān)文獻(xiàn)[18-19],選取2 mmol/L磷酸二氫鈉+0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鐵鈉+10 mmol/L乙酸鈉+3 mmol/L硝酸鉀+1%乙醇為流動(dòng)相,調(diào)節(jié)pH=10.7。圖1為選用該流動(dòng)相的5種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)品(2.5 μg/L)的色譜圖,從圖1中可見(jiàn),5種形態(tài)砷的分離度均大于1.5,保留時(shí)間在11 min之內(nèi)。

圖1 5種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of five arsenic species

2.2提取條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)中對(duì)形態(tài)砷的提取有采用酸、水、甲醇-水和其他溶劑的,提取方式則包括濕法消解法、微波消解法、水浴提取法和超聲萃取法等[6-14],研究表明,單獨(dú)進(jìn)行無(wú)機(jī)砷測(cè)定時(shí)常使用濃硝酸等強(qiáng)酸消化富集,要測(cè)定更多不同形態(tài)砷化合物時(shí)大多采用甲醇-水作為提取液,但甲醇雖然對(duì)有機(jī)砷的提取有益,但也會(huì)抑制無(wú)機(jī)砷的萃取效率。陳晞[15]等對(duì)比了鹽酸提取、沸水提取和超聲提取3種處理方式,劉崴[19]等研究了60、70、95和150 ℃下的不同提取條件,結(jié)果表明,酸提取會(huì)造成基線漂移和極寬的干擾峰,沸水提取回收率較低,60～70 ℃為較理想的提取溫度,因此,本實(shí)驗(yàn)使用70 ℃條件下超聲萃取的提取方式,采用加標(biāo)回收測(cè)試的結(jié)果表明,該提取條件下方法回收率在81.0%～108.9%,提取效果較為理想。

2.3 ICP-MS條件優(yōu)化

檢測(cè)前,使用1.0 mg/L的Be、Mg、In、U、Ce混合調(diào)諧液對(duì)ICP-MS進(jìn)行調(diào)諧,調(diào)整載氣流速、采樣深度、炬管位置、透鏡參數(shù)等至最佳狀態(tài),使調(diào)諧后的儀器靈敏度達(dá)到中質(zhì)量數(shù)(In114.904)≥40000,同時(shí)氧化物CeO/Ce<3%,雙電荷產(chǎn)率Ce2+/Ce+<3%。

2.4線性范圍和檢出限

對(duì)濃度分別為0.0、2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL的5種形態(tài)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,以峰面積對(duì)濃度計(jì)算線性回歸。結(jié)果表明,在該濃度范圍內(nèi),5種形態(tài)砷線性范圍良好,線性相關(guān)系數(shù)r>0.9999。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋,以信噪比(S/N)為10∶1時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度及樣品前處理最大稀釋倍數(shù)計(jì)算定量檢測(cè)限,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種形態(tài)砷的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 arsenic species

2.5回收率與精密度

在干香菇、鮮香菇樣品和香菇培養(yǎng)料樣品上進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),根據(jù)稱樣量分別加入相當(dāng)于10.0、20.0和30.0 μg/kg質(zhì)量濃度的形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按本文方法測(cè)定,重復(fù)進(jìn)樣6次,扣除樣品空白后計(jì)算回收率和精密度,結(jié)果見(jiàn)表2。方法的回收率在81.0%～108.9%,精密度在1.6%～6.3%之間。

2.6實(shí)際樣品檢測(cè)

圖2 培養(yǎng)料樣品(a)、鮮香菇樣品(b)和干香菇樣品(c)的HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.2 HPLC-ICP-MS chromatograms of the culture medium sample(a),fresh Lentinus edodes sample(b) and dried Lentinus edodes sample(c)

從香菇種植基地選取接種2、60、99 d的香菇培養(yǎng)料和從市場(chǎng)上購(gòu)買的3批鮮香菇、5批干香菇樣品,按所建立的檢測(cè)方法考察其中的形態(tài)砷分布情況,分析結(jié)果的色譜圖如圖2所示。在干香菇和鮮香菇中均檢出了5種形態(tài)砷化合物,但MMA含量較低,在香菇培養(yǎng)料中檢出As(Ⅴ),并檢出少量As(Ⅲ)和AsB,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明,培養(yǎng)料中的砷元素主要以As(Ⅴ)的形式存在,鮮香菇和干香菇中則含有較多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,而無(wú)論在培養(yǎng)料還是香菇中,MMA檢出率都最低,表明香菇及培養(yǎng)料中的MMA不穩(wěn)定或易被分解。從砷元素的分布情況來(lái)看,培養(yǎng)料中只檢出As(Ⅴ),而接種后栽培時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)其含量影響不大。干香菇中含量最高的砷化合物是As(Ⅲ),其次是AsB,分別占到全部形態(tài)砷元素的42.0%～57.0%和15.5%～26.8%。鮮香菇中含量最高的分別是As(Ⅲ)和As(Ⅴ),占比達(dá)到全部形態(tài)砷元素的32.0%～38.2%和25.4%～37.2%。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,雖然干香菇和鮮香菇樣品中的砷元素檢測(cè)結(jié)果滿足GB 2762-2012[20]標(biāo)準(zhǔn)中總砷小于0.5 mg/kg(食用菌及其制品)和GB 7096-2003[21]中干食用菌總砷小于1.0 mg/kg，鮮食用菌總砷小于0.5 mg/kg的限量要求,但高毒無(wú)機(jī)砷的含量整體高于低毒的有機(jī)砷,在食品安全上也應(yīng)引起關(guān)注。

表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果(μg/kg)Table 3 Analytical results of samples(μg/kg)

注:LOQ:定量檢測(cè)限。

3 結(jié)論

香菇及香菇培養(yǎng)料經(jīng)熱水結(jié)合超聲波提取后,采取液相色譜分離,并利用電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定5種形態(tài)砷元素的含量。結(jié)果表明,該方法準(zhǔn)確高效,準(zhǔn)確度和精度均滿足檢測(cè)需要。實(shí)際樣品中,培養(yǎng)料中的砷元素主要以As(V)的形式存在,其含量與栽培時(shí)間關(guān)系不大。鮮香菇和干香菇中則含有較多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,雖然總砷結(jié)果符合國(guó)標(biāo)限量要求,但高毒的無(wú)機(jī)砷占大多數(shù)。

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SpeciesanalysisofarsenicinLentinusedodesandculturemediumbyHPLC-ICP-MS

TANGQing-qiang1,CHENZe-yu1,CHENShu-yi2,ZHANGXin-ren1,CHENGLi-jun1,ZHANGYun1

(1.Sanming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Sanming 365000,China; 2.Ningde Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Ningde 352000,China)

The method for determination of arsenite(As(Ⅲ)),arsenate(As(Ⅴ)),methylarsonic acid(MMA),dimethylarsinic acid(DMA),and arsenic betaine(AsB)arsenic species inLentinusedodesand culture medium by HPLC-ICP-MS has been developed.Samples were extracted with ultrasonic instrument in 70 ℃,then separated by HPLC on an anion chromatography and quantification by ICP-MS. Good linearities of 5 arsenic species were observed with correlation coefficients above 0.9999,the linear range was 0～100.0 ng/mL.Recoveries were between 81.0% and 108.9% and the relative standard deviation were within 1.6%～6.3%(n=6).With the actual samples tested the As(V)was the main species in culture medium.The content had little relation with its cultivation time.It had more content As(Ⅲ),As(Ⅴ)and AsB inLentinusedodes. Although the total arsenic results conform to the requirements of the national standards,but high toxic inorganic arsenic are majority.

HPLC-ICP-MS;Lentinusedodes;culture medium;arsenic;species analysis

2016-11-30

唐慶強(qiáng)(1981-)，男，碩士，工程師，研究方向：食品檢測(cè)技術(shù)與應(yīng)用，E-mail:tqqls@163.com。

福建出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃(FK2013-27)。

TS207.3

:A

:1002-0306(2017)12-0017-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.003