周偉強

（沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧沈陽110034）

RTCA實時監(jiān)控SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長狀態(tài)的影響

周偉強

（沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧沈陽110034）

目的：應用實時無標記動態(tài)細胞分析（RTCA）技術研究SAHA抑制乳腺癌MCF-7細胞生長的情況。方法：采用RTCA系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測不同劑量（0、0.5、1、2、5、10、20、50μmol/L）SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長的影響。結果：5、10μmol/L的SAHA孵育48 h后可顯著抑制細胞的生長，為SAHA抑制MCF-7細胞生長的最佳實驗劑量和作用時長；而相關劑量的DMSO無抑制作用。結論：RTCA系統(tǒng)可準確地監(jiān)測SAHA抑制乳腺癌MCF-7細胞生長的情況。

乳腺癌；MCF-7；SAHA；RTCA

xCELLigence RTCA（real-time cell analysis）是應用實時無標記動態(tài)細胞分析技術，實時、動態(tài)、定量跟蹤細胞的生長、遷移及浸潤的動力學檢測。該系統(tǒng)將微電子細胞傳感器芯片整合到特制16孔板內(nèi)（E Plate-16）的微孔膜下層，從而實時并精確地監(jiān)測細胞的各種變化［1-3］。

表觀遺傳學（Epigenetics）又稱“表遺傳學”、“后遺傳學”，是指在沒有細胞核DNA序列改變的情況時，基因功能發(fā)生的可逆、可遺傳的改變。這些改變包括DNA的修飾（如甲基化修飾）和組蛋白的各種修飾等［4-5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌發(fā)生過程中，乳房腺上皮細胞在多種致癌因子作用下發(fā)生了表觀遺傳的改變而致使細胞增殖失控，其中乙酰化和去乙?；鹆撕艽蟮淖饔茫鴮τ诮M蛋白乙?；腿ヒ阴；{(diào)控是由一組蛋白酶完成的，分別為組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）。

SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）作為一種HDAC抑制劑，可抑制組蛋白去乙?；^程，造成癌細胞轉(zhuǎn)錄過程異常，阻滯其細胞周期進程并誘導細胞凋亡的發(fā)生［6-7］。因此其在臨床上有非常良好的應用前景。因此，本文選取乳腺癌MCF-7細胞，利用RTCA技術研究SAHA抑制乳腺癌MCF-7細胞生長的情況。

1 材料與方法

1.1 材料RTCA實時細胞分析系統(tǒng)購自艾森生物（杭州）有限公司；人乳腺癌細胞株MCF-7由本實驗室凍存；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購自美國Thermo公司；SAHA、DMSO及其它的化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 RTCA系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長的影響將1×104/ml乳腺癌MCF-7細胞接種于RTCA系統(tǒng)的E-Plate 16孔板中。無血清同步化處理后，各孔分別加入0、0.5、1、2、5、10、20、50μmol/L不同劑量的SAHA。并以相關劑量DMSO作為對照。設定監(jiān)控時長為72 h，時間間隔為1 h進行實時觀察。隨著時間的推移，通過RTCA系統(tǒng)動力學變化反應曲線反映各孔0～72 h間MCF-7的細胞生長狀況。

2 結果

2.1 SAHA顯著抑制乳腺癌細胞的生長從T1時段（從將培養(yǎng)瓶中的MCF-7細胞消化后接種到RTCA系統(tǒng)的E Plate-16孔后繼續(xù)培養(yǎng)24 h）的各個細胞曲線來看，各孔的細胞生長良好，體現(xiàn)在細胞曲線隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞曲線不斷上升，無明顯停滯和下降的情況發(fā)生。T2時段（無血清培養(yǎng)的細胞同步化階段）內(nèi)細胞的培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的培養(yǎng)液，其目的是抑制細胞周期的進程，而將RTCA各孔的細胞全部停留在G1期，以便下一步的細胞實驗。T2時段的同步化的細胞曲線都有不同程度的下降，而在同步化培養(yǎng)10 h后，細胞曲線趨于平行，細胞增殖受到了抑制，達到了同步化的實驗目的。

從總時段的41 h開始，細胞重新?lián)Q上含胎牛血清培養(yǎng)液，并加入不同濃度的SAHA和DMSO與MCF-7細胞進行培養(yǎng)。當加入SAHA和DMSO開始的5 h時段內(nèi)，細胞形態(tài)由于新培養(yǎng)液的加入發(fā)生了一定的變化，這直接體現(xiàn)在以細胞形態(tài)為主要采集目標的RTCA細胞曲線的變化上。各孔細胞曲線都發(fā)生了急劇的變化，細胞曲線發(fā)生大幅度上升。但隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞狀態(tài)趨于平穩(wěn)，細胞曲線反映了細胞真實的狀態(tài)。

從SAHA的藥效方面，小劑量SAHA對MCF-7細胞影響不大，0.5、1μmol/L SAHA在培養(yǎng)接近60 h后對MCF-7的抑制作用非常有限；而大劑量SAHA則明顯顯示出抑制細胞生長的特性，20、50 μmol/L SAHA在培養(yǎng)不到20 h就明顯抑制了細胞的生長；而中劑量（5、10μmol/L）SAHA則在培養(yǎng)30～40 h明顯顯現(xiàn)出抑制MCF-7細胞生長的效果。見圖1A。

2.2 實驗劑量的DMSO對乳腺癌MCF-7細胞的生長無抑制作用對于DMSO來說，無論小劑量還是大劑量的DMSO對MCF-7細胞的影響均不十分顯著。在各種實驗劑量DMSO的作用下，MCF-7細胞仍能隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷生長，RTCA曲線表現(xiàn)為持續(xù)延長并在培養(yǎng)40 h后到達生長平臺期。但同時也可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分的不斷喪失，細胞在孵育65 h后開始出現(xiàn)死亡，表現(xiàn)在RTCA曲線下降。見圖1B。

3 討論

RTCA系統(tǒng)通過新穎的電子傳感芯片設計，可連續(xù)監(jiān)測生物反應的全過程，并且其監(jiān)測是無標記、無創(chuàng)傷型的數(shù)據(jù)獲取和分析平臺，這種高準確度、高精確度的定量衡量細胞生長方法，可最大限度地模仿細胞自然狀態(tài)下的生長發(fā)育情況，對于腫瘤藥敏實驗是十分適合的［8-9］。本實驗就是利用了RTCA系統(tǒng)實時觀察了SAHA對乳腺癌細胞系MCF-7生長狀態(tài)的影響。

SAHA具有誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期和促進細胞分化的作用［6］，且具有抗腫瘤廣譜性，具有潛在的臨床應用前景［10-13］。本實驗發(fā)現(xiàn)高劑量SAHA（20、50μmol/L）對MCF-7細胞抑制作用明顯，可在孵育開始后即發(fā)揮明顯地抑制腫瘤生長的效果，沒有留給細胞一個生長與抑制并存的環(huán)境，其毒性作用過強，不利用其它細胞實驗的實施。而低劑量SAHA對MCF-7細胞基本沒有體現(xiàn)出抑制生長的作用。因此通過RTCA系統(tǒng)可以很直觀地篩查出中劑量SAHA，尤其是5、10μmol/LSAHA孵育48 h可顯著抑制細胞的生長，是SAHA抑制MCF-7細胞生長的最佳實驗劑量和作用時長。

本文通過RTCA實時觀察了不同劑量的SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長產(chǎn)生的作用效果，并非常直觀地篩查出SAHA作用MCF-7細胞的最佳實驗劑量和作用時長，對于傳統(tǒng)增殖實驗篩查有著不可比擬的技術優(yōu)勢，是一個很好的替代手段。

［1］Ma H，Yang S，Lu H，etal.Bioassay-guided separation ofantitumor components from Euphorbia kansui by means of twodimensional preparative high performance liquid chromatography and real-time cellanalysis［J］.Anal Sci，2016，32（5）：581-586.

［2］BozkurtE，AtmacaH，Kisim A，etal.EffectsofThymusserpyllum extract on cell proliferation，apoptosis and epigenetic events in human breast cancer cells［J］.Nutr Cancer，2012，64（8）：1245-1250.

圖1 RTCA實時監(jiān)控不同劑量SAHA和DMSO對乳腺癌MCF-7細胞生長的影響（μm為μmol/L）

［3］Lee YJ，Won AJ，Lee J，et al.Molecularmechanism of SAHA on regulation ofautophagic celldeath in tamoxifen-resistantMCF-7 breast cancer cells［J］.Int JMed Sci，2012，9（10）：881-893.

［4］GuiCY，Ngo L，XuWS，etal.Histone deacetylase（HDAC）inhibitor activation of p21WAF1 involves changes in promoterassociated proteins，including HDAC1［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2004，101（5）：1241-1246.

［5］Zhou W，Liang IC，Yee NS.Histone deacetylase 1 is required for exocrine pancreatic epithelial proliferation in development and cancer［J］.Cancer Biol Ther，2011，11（7）：659-670.

［6］Chun SG，Zhou W，Yee NS.Combined targeting of histone deacetylases and hedgehog signaling enhances cytoxicity in pancreatic cancer［J］.Cancer Biol Ther，2009，8（14）：1328-1339.

［7］Mendoza-Sanchez R，Cotnoir-White D，Kulpa J，etal.Design，synthesis and evaluation of antiestrogen and histone deacetylase inhibitor molecular hybrids［J］.Bioorg Med Chem，2015，23（24）：7597-7606.

［8］Tang C，LiC，Zhang S，etal.Novelbioactive hybrid compound dual targeting estrogen receptor and histone deacetylase for the treatment of breast cancer［J］.JMed Chem，2015，58（11）：4550-4572.

［9］Huang L，Pardee AB.Suberoylanilide hydroxamic acid as a potential therapeutic agent for human breast cancer treatment［J］.MolMed，2000，6（10）：849-866.

［10］Yee NS，Zhou W，Chun SG，et al.Targeting developmental regulators of zebrafish exocrine pancreas as a therapeutic approach in human pancreatic cancer［J］.Biol Open，2012，1（4）：295-307.

［11］Glaser KB.HDAC inhibitors：clinical update and mechanismbased potential［J］.Biochem Pharmacol，2007，74（5）：659-671.

［12］Gryder BE，SodjiQH，Oyelere AK.Targeted cancer therapy：giving histone deacetylase inhibitors all they need to succeed［J］.FutureMed Chem，2012，4（4）：505-524.

［13］Huong TT，Dung do TM，Oanh DT，et al.5-aryl-1，3，4-thiadiazole-based hydroxamic acidsashistonedeacetylase inhibitors and antitumor agents：synthesis，bioevaluation and docking study［J］.Med Chem，2015，11（3）：296-304.

RTCAM onitorsthe Inhibitory Effecton Proliferation of BreastCancer MCF-7Cellsw ith SAHA Treatment

ZHOUWeiqiang
（Shenyang MedicalCollege，Key Laboratory of EnvironmentalPollution and M icroecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

Objective：To observe the inhibitory effect on proliferation of breast cancer MCF-7 cellswith SAHA treatment by real-time cell analysis（RTCA）system.Method：RTCA was used tomonitor the proliferation ofbreast cancerMCF-7 cells treated with different doses of SAHA（0，0.5，1，2，5，10，20，50μmol/L）.Results：With 5，10μmol/L dose for 48 h treatment，SAHA significantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells，while no dose-dependent effect in the same doses for the DMSO.Conclusion：RTCA system accurately monitors the inhibitory effect on proliferation of breast cancer MCF-7 cells with SAHA treatment.

breastcancer；MCF-7；SAHA；RTCA

R394.3

A

1008-2344（2017）03-0193-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.002

2017-03-06

（文敏編輯）

國家自然科學基金項目（No.81172509）

周偉強（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com