周慧，周偉強

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧沈陽110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室）

實時無標記細胞分析系統(tǒng)與傳統(tǒng)MTT法在測定乳腺癌細胞增殖中的比較

周慧1，周偉強2*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧沈陽110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室）

目的：通過實時無標記細胞分析法與傳統(tǒng)MTT法對乳腺癌細胞增殖進行監(jiān)測以對比確定研究細胞增殖的最佳實驗方法手段。方法：采用MTT法、實時無標記細胞分析法測定瘦素刺激乳腺癌MCF-7細胞增殖的效果。結(jié)果：MTT法和實時無標記細胞分析法結(jié)果均表明瘦素作用濃度為0.625 nmol/L、作用時間為24 h的條件下對乳腺癌MCF-7細胞有誘導(dǎo)生長的效果。但實時無標記細胞分析法能夠?qū)崟r監(jiān)測細胞生長和增殖的動態(tài)生物學(xué)反應(yīng)過程，觀察效果更加直觀、準確。結(jié)論：實時無標記細胞分析法可較好地彌補MTT法的缺點，成為一種新的研究細胞增殖的實驗方法。

乳腺癌；MCF-7；MTT；實時無標記細胞分析法

實時無標記細胞功能分析儀（real time cell analysis，RTCA）S16是一種新型的細胞自動化分析系統(tǒng)［1］，它通過預(yù)置于特制16孔板底部的電極，應(yīng)用電阻抗傳感器原理對細胞進行實時監(jiān)測。由于E-Plate16的底部整合有微金電子傳感器芯片，當(dāng)貼壁生長在微電極表面的細胞引起電極界面阻抗的改變時，該阻抗值的變化直接反映細胞的生物學(xué)狀態(tài)［2］。由此，RTCA S16在細胞生理狀態(tài)下，實時、連續(xù)、定量跟蹤細胞形態(tài)和增殖分化改變，為細胞水平的分析研究提供了一個實時動態(tài)信息獲取的獨特方法。本文結(jié)合RTCA S16系統(tǒng)與傳統(tǒng)MTT法對Leptin誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞增殖情況進行監(jiān)測［3］，通過對比研究細胞增殖的最佳實驗手段。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞株MCF-7由本實驗室凍存；RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清購自美國Thermo公司；人重組Leptin蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒購自美國Promega公司；xCELLigence RTCA S16購自艾森生物（杭州）有限公司；其他的化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司和上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100μg/m l的鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。待細胞鋪滿70%左右時用于實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖將1×104/m l乳腺癌MCF-7細胞接種于96板各孔中，細胞進行無血清同步化處理后加入不同濃度的Leptin（0、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、62.5 nmol/L）與細胞分別孵育24和48 h，應(yīng)用CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒進行MTT測定MCF-7細胞增殖情況。

1.2.3 RTCA法測定細胞增殖將1×104/m l乳腺癌MCF-7細胞接種于RTCA系統(tǒng)的E-Plate 16板各孔中。無血清同步化處理各孔后分別加入不同濃度的Leptin（0、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、62.5 nmol/L）。通過RTCA系統(tǒng)各孔微電阻量的變化動態(tài)監(jiān)測0～48 h MCF-7的細胞生長狀況，通過反映細胞增殖的動力學(xué)變化反應(yīng)曲線（CI曲線）了解Leptin對乳腺癌MCF-7細胞增殖的作用效果，并尋找Leptin最佳作用點和作用時長。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以（x±s）表示，采用單因素方差分析和Student′s t-test方法進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Leptin對乳腺癌MCF-7細胞增殖影響的MTT分析MTT檢測結(jié)果顯示，Leptin作用24 h后對乳腺癌MCF-7細胞的誘導(dǎo)作用很明顯。當(dāng)Leptin濃度為0.625 nmol/L、1.25 nmol/L、2.5 nmol/L時表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)乳腺癌細胞增殖的效果。但這種刺激作用隨著作用時間的延長及培養(yǎng)液養(yǎng)分的消耗，在孵育48 h后僅0.625 nmol/L Leptin還可表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用。對MCF-7細胞來說，Leptin作用濃度為0.625 nmol/L、作用時間為24 h為最佳實驗反應(yīng)條件。見圖1。

圖1 MTT法檢測Leptin對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

2.2 Leptin誘導(dǎo)乳腺癌細胞增殖的實時監(jiān)測RTCA分析系統(tǒng)實時監(jiān)測結(jié)果顯示：在總共100 h的實時監(jiān)測中，低濃度Leptin對MCF-7細胞生長有刺激作用，0.625～6.25 nmol/L的Leptin均表現(xiàn)出較明顯的誘導(dǎo)細胞增殖的效應(yīng)，其中以0.625 nmol/L濃度的Leptin產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用最明顯。但隨著Leptin作用時間的延長，CI曲線在孵育48 h后趨于一致。因此，0.625 nmol/L濃度、24 h為Leptin誘導(dǎo)MCF-7細胞增殖的最適濃度和最適處理時長。另外，在Leptin加入系統(tǒng)的開始時長（＜5 h），細胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)在細胞生長曲線反應(yīng)性升高，但隨著孵育時間的延長，細胞曲線趨于平穩(wěn)，更準確地代表了細胞真實的生長狀態(tài)；與對照組（Leptin0nmol/L）相比，高濃度Leptin（12.5nmol/L和62.5 nmol/L）處理的MCF-7細胞，其CI值明顯降低，這說明高濃度Leptin對MCF-7細胞具有毒性作用，可明顯抑制MCF-7細胞增殖。見圖2。

圖2 RTCA監(jiān)測Leptin對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

3 討論

RTCA S16分析儀是艾森生物（ACEA Biosciences）自主研發(fā)的一款結(jié)構(gòu)緊湊的新型細胞自動化分析系統(tǒng)，其能夠?qū)崟r監(jiān)測細胞的生長、增殖、毒性、黏附及形態(tài)變化等動態(tài)生物學(xué)反應(yīng)過程。實驗時，細胞分析儀置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，裝有RTCA S16軟件的iPad通過無線模式操控整個系統(tǒng)的運行并可進行數(shù)據(jù)分析。它可實時獲取全程動態(tài)信息，在細胞的正常培養(yǎng)狀態(tài)下無標記、無創(chuàng)傷、最接近生理狀態(tài)下獲得檢測結(jié)果［4］。

從本實驗中可以發(fā)現(xiàn)，RTCA系統(tǒng)可更準確描述Leptin對乳腺癌MCF-7細胞的誘導(dǎo)生長過程。傳統(tǒng)的MTT僅從各時間點進行監(jiān)測，存在一定的實驗限制性，尤其是篩選和確定藥物最佳濃度及最佳作用時間等藥敏實驗時有著先天的缺陷［5-12］。如果單從MTT結(jié)果來說，Leptin作用濃度為0.625 nmol/L、作用時長為24 h為實驗最佳條件，這與從RTCA監(jiān)測圖中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相同，但RTCA系統(tǒng)能夠?qū)崟r監(jiān)測細胞生長和增殖的動態(tài)生物學(xué)反應(yīng)過程，觀察效果更加直觀、準確。因此RTCA系統(tǒng)較好地彌補了MTT實驗的缺點，其在追求更準確、更可控的前提下可成為一種新的細胞生物學(xué)研究領(lǐng)域的良好實驗手段。

［1］Ebersohn K，Coetzee P，Venter EH.An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay［J］.J Virol Methods，2014，199：25-28.

［2］Kaschula CH，Hunter R，Stellenboom N，et al.Structureactivity studieson theanti-proliferation activityofajoeneanalogues in WHCO1 oesophageal cancer cells［J］.Eur J Med Chem，2012，50：236-254.

［3］王春勝，周偉強.Leptin促進乳腺癌發(fā)生的機制研究［J］.沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，15（4）：234-237.

［4］Hunsawong T，Singsuksawat E，In-chon N，et al.Estrogen is increased in male cholangiocarcinoma patients'serum and stimulates invasion in cholangiocarcinoma cell lines in vitro［J］.J Cancer ResClin Oncol，2012，138（8）：1311-1320.

［5］夏想厚，谷俊朝，杜松濤，等.乳腺癌組織瘦素與凋亡調(diào)節(jié)因子表達相關(guān)性的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18（20）：1598-1602.

［6］范杰，劉冰，高衛(wèi)國，等.血清抵抗素、脂聯(lián)素和瘦素水平與乳腺癌的相關(guān)性研究［J］.實用腫瘤雜志，2010，25（6）：656-660.

［7］張志寧，趙亞恒，鄭麗華，等.瘦素及瘦素受體與乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究［J］.中國腫瘤外科雜志，2014，6（6）：378-381.

［8］AlshakerH，KrellJ，F(xiàn)ramptonAE，etal.Leptininducesupregulation of sphingosine kinase 1 in oestrogen receptor-negative breast cancer via Src family kinase-mediated，janus kinase 2-independent pathway［J］.Breast Cancer Res，2014，16（5）：426.

［9］Alshaker H，Wang Q，F(xiàn)ramptonAE，etal.Sphingosine kinase 1 contributes to leptin-induced STAT3 phosphorylation through IL-6/gp130 transactivation inoestrogen receptor-negativebreastcancer［J］.BreastCancerRes，2015，149（1）：59-67.

［10］DuboisV，Jarde T，Delort L，etal.Leptin inducesaproliferative response in breast cancer cells but not in normal breast cells［J］.NutrCancer，2014，66（4）：645-655.

［11］Khanal T，Kim HG，Do MT，et al.Leptin induces CYP1B1 expression in MCF-7 cells through ligand-independentactivation of the ERαpathway［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2014，277（1）：39-48.

［12］Nejati-Koshki K，Akbarzadeh A，Pourhasan-Moghaddam M，et al.Inhibition of leptin and leptin receptor gene expression by silibinin-curcumin combination［J］.Asian Pac JCancer Prev，2014，14（11）：6595-6599.

Com parison between RTCA and M TT for Detecting the Proliferation of Breast Cancer Cell

ZHOUHui1，ZHOUWeiqiang2*
（1.Depatementof Histology and Embryology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Shenyang Medical College，Key Laboratory of EnvironmentalPollution and Microecology of Liaoning Province）

Objective：To detect the proliferation ofbreastcancerMCF-7 cellby real time cellanalysis（RTCA）and traditional MTTmethod to identify the bettermethods.Method ethod：MTT and RTCAmethodswere used tomonitor the proliferation ofbreast cancer cellMCF-7 induced by different concentrationsof Leptin（0-62.5 nmol/L）.Results sults：MTTand RTCA all showed that Leptinwith the concentration of 0.625 nmol/L and 24 h of the incubation could get the optimal effect for MCF-7 cell proliferation.But the result of RTCA wasmore intuitive and accurate.Conclusion usion：RTCAmay be a betterway to offset the shortcomings of the MTT assay，and it willbecomean appliedmeans for cellproliferation.

breastcancer；MCF-7；MTT；real time cellanalysis

R394.3

A

1008-2344（2017）03-0198-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.004

2017-02-09

（文敏編輯）

國家自然科學(xué)基金項目（No.81172509）；沈陽醫(yī)學(xué)院科技基金項目（No.20143056）

周慧（1982—），女（漢），講師.研究方向：腫瘤學(xué).E-mail：zhouhui8013@163.com

周偉強（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com