馬詩瑤++羅沙++王藝凝++岳桐++趙丹

摘要：指出了CdSe量子點(diǎn)作為一種新興的熒光標(biāo)記納米材料，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。提出了一種以亞硒酸鈉為硒源，N-乙酰-L-半胱氨酸為穩(wěn)定劑，采用水熱法一步合成高質(zhì)量水溶性CdSe量子點(diǎn)的新方法。實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)物的投料比及其加入順序?qū)dSe量子點(diǎn)熒光性能的影響，并從中優(yōu)化CdSe量子點(diǎn)的合成條件，用熒光光譜對(duì)CdSe量子點(diǎn)的發(fā)光性能進(jìn)行了表征。選取最佳條件下制備的CdSe量子點(diǎn)標(biāo)記人肝癌細(xì)胞，N-乙酰-L-半胱氨酸修飾的CdSe量子點(diǎn)具有良好的水溶性和生物相容性，能很好地對(duì)人肝癌細(xì)胞進(jìn)行熒光成像。

關(guān)鍵詞：CdSe量子點(diǎn)；水熱法；熒光；細(xì)胞成像

中圖分類號(hào)：R318

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：16749944（2017）10022304

1 引言

量子點(diǎn)（quantum dots），是一種由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的，其中Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族和Ⅳ-Ⅵ族這三個(gè)系列的量子點(diǎn)較為常見， Ⅱ-Ⅵ族量子點(diǎn)由于其制備過程簡(jiǎn)單，熒光性能優(yōu)良、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)而被廣泛用于各領(lǐng)域的科學(xué)研究中。

經(jīng)過多年的研究和改進(jìn)，量子點(diǎn)的合成方法正在不斷地完善。用于生物熒光標(biāo)記的量子點(diǎn)通常采用膠體化學(xué)法來制備，按所用原料不同可分為金屬有機(jī)溶劑熱分解法和水相合成法兩種路線。水相合成法相比于金屬有機(jī)溶劑熱分解法具有試劑無毒、價(jià)格低廉、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，且水相法制備量子點(diǎn)無需結(jié)構(gòu)修飾就具有很好的水溶性和生物相容性，這些特性使量子點(diǎn)能很好應(yīng)用于生物成像的科學(xué)研究中。水熱法是在特制的密閉反應(yīng)器（如高壓反應(yīng)釜等）中，通過恒溫加熱使反應(yīng)體系在高溫高壓的環(huán)境下反應(yīng)生成量子點(diǎn)的方法。水熱法不但繼承和發(fā)展了水相法的優(yōu)點(diǎn)，而且克服了回流法溫度不能超過100℃的缺陷，反應(yīng)溫度的提高極大地縮短了量子點(diǎn)的制備時(shí)間。水熱法還改善了量子點(diǎn)表面缺陷，使量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率得到了顯著的提高。

量子點(diǎn)在經(jīng)過適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾后，能與細(xì)胞表面的分子或肽特異性結(jié)合，進(jìn)而成功地標(biāo)記靶細(xì)胞。1998年Bruchez等人首次成功使用量子點(diǎn)來標(biāo)記固定細(xì)胞，此后經(jīng)過后人的不斷研究，量子點(diǎn)的細(xì)胞成像技術(shù)不斷提高。將量子點(diǎn)引入到活細(xì)胞的方式有電穿孔技術(shù)、顯微注射法，也可以經(jīng)過細(xì)胞自身的內(nèi)吞作用進(jìn)入到靶細(xì)胞中。量子點(diǎn)相比于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料具有許多優(yōu)勢(shì)，它在生物醫(yī)學(xué)研究中能夠解決傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料解決不了的問題，例如量子點(diǎn)的熒光壽命長(zhǎng)，漂白性強(qiáng)，這使得用量子點(diǎn)標(biāo)記的細(xì)胞可以在較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)成像，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的動(dòng)向。量子點(diǎn)具有生物相容性好、低毒等優(yōu)點(diǎn)使其被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像的研究中?？傊?，量子點(diǎn)作為新型的熒光探針為生命醫(yī)學(xué)的細(xì)胞研究工作提供了強(qiáng)而有力的工具。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O，上海展云化工有限公司，分析純AR）；氯化鎘（CdCl2·2.5H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純AR）；硼氫化鈉（NaBH4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度96%）；亞硒酸鈉（Na2SeO3，Xiya Reagent，純度98%）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，C5H9NO3S，上海阿拉丁試劑有限公司，純度99%）；羅丹明-6G（C28H31N2O3Cl，上海阿拉丁試劑有限公司）；人肝癌細(xì)胞（HepG2）（購自上海北諾生物科技有限公司）；DMEM高糖液體培養(yǎng)基（?？寺yClone）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；青霉素鈉（C18H17N2O4SNa，biosharp）；硫酸鏈霉素（C42H84N14O36S3，biosharp）；氯化鈉（NaCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純AR）；氯化鉀（KCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純AR）；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純AR）；磷酸二氫鉀（KH2PO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純AR）；實(shí)驗(yàn)中所用的水均為超純水。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CP214型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；DHG-9030型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LS55型熒光分光光度計(jì)（PerkinElmer珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司）；Lambda35型紫外分光光度計(jì)（PerkinElmer珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司）；高純N2（四川天一科技股份有限公司）；ZF-20C暗箱式自動(dòng)紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；MF53型倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.2.1 CdSe量子點(diǎn)的合成

（1）溶液的配制。Na2SeO3溶液的配制：稱取Na2SeO3固體0.0413 g，加5 mL超純水，所配溶液濃度為0.04 mol/L；檸檬酸鈉溶液的配制：稱取檸檬酸鈉固體0.8000 g，加8 mL超純水，配制成濃度為10%檸檬酸鈉溶液；稱取NAC固體30 mg和NaBH4固體80 mg，分別用少量超純水（<1 mL）溶解。

（2）注射法制備CdSe量子點(diǎn)。稱取一定量的CdCl2于50 mL的圓底燒瓶中，加入上述配置的2 mL檸檬酸鈉溶液和37 mL超純水使其混合均勻，在N2的保護(hù)下劇烈攪拌30 min。然后用微量注射器分別吸取上述配制好的全部的NaBH4、NAC和0.8 mL Na2SeO3溶液，，并將這三種溶液快速的注射到圓底燒瓶中，繼續(xù)攪拌5 min，然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，200℃反應(yīng)40 min，即可得高熒光水溶性的CdSe量子點(diǎn)（Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩爾比為1∶0.1∶0.57∶6.61，[Cd2+]=8mmol/L）。

2.2.2 CdSe量子點(diǎn)的細(xì)胞成像

將HepG2細(xì)胞在6孔顯微板中進(jìn)行人工培養(yǎng)，其播種密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基為DMEM液體培養(yǎng)基，內(nèi)含10%FBS和100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素。經(jīng)過48 h的培育后，將培養(yǎng)基倒掉并用pH值為7.4的磷酸緩沖液（PBS）洗1次，然后每孔加入1 mL的固定液（醋酸∶甲醇的體積比為1∶3），5 min后將固定液的倒掉，并用PBS洗2～3次。將少量提純的CdSe量子點(diǎn)用PBS稀釋，并加入到6孔顯微板中。將6孔顯微板置于熒光倒置顯微鏡上，采用λ=405 nm的光激發(fā)，觀察CdSe量子點(diǎn)對(duì)HepG2細(xì)胞的標(biāo)記情況，并拍攝熒光成像照片。

2.2.3 CdSe量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率測(cè)定

CdSe量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率采用參比法測(cè)定，以羅丹明-6G為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，乙醇為溶劑，根據(jù)下面的式子計(jì)算：

3 結(jié)果與討論

量子點(diǎn)具有很高的比表面積，量子點(diǎn)的質(zhì)量主要是由量子點(diǎn)的表面性質(zhì)決定。其合成條件的改變，如反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑的比例、穩(wěn)定劑的類型等都會(huì)影響所制備的量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。為了得到高質(zhì)量的產(chǎn)物，必須嚴(yán)格控制制備過程的反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)使用熒光分光光度計(jì)來表征CdSe量子點(diǎn)的發(fā)光性能。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，控制實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度為200℃，反應(yīng)時(shí)間為40 min不變，主要研究反應(yīng)物投料比以及反應(yīng)物的加入順序?qū)α孔狱c(diǎn)發(fā)光性能的影響。

3.1 亞硒酸鈉的影響

實(shí)驗(yàn)固定反應(yīng)溫度200℃，反應(yīng)時(shí)間40 min不變，不改變其他反應(yīng)物的投入量，僅改變Na2SeO3的用量，探討了Cd∶Se摩爾比為1∶0.24、1∶0.15、1∶0.10、1∶0.07（[Cd2+]=8 mmol/L）對(duì)合成CdSe量子點(diǎn)的影響。當(dāng)Cd∶Se的摩爾比為1∶0.24時(shí)，合成的CdSe量子點(diǎn)無熒光且有沉淀生成，推測(cè)可能是由于Se含量相對(duì)較多時(shí)，量子點(diǎn)表面形成了更多的Se懸鍵，懸鍵由于自身的熱力學(xué)不穩(wěn)定性容易造成激子的非輻射復(fù)合而不利于量子點(diǎn)的發(fā)光，因此應(yīng)減少Na2SeO3的投入量。如圖1所示，當(dāng)Na2SeO3的摩爾比減小到0.15時(shí)，CdSe量子點(diǎn)開始出現(xiàn)微弱的熒光，進(jìn)一步減小到0.10時(shí)，CdSe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度顯著上升，這是因?yàn)楫?dāng)Se含量減少后，Cd2+-NAC復(fù)合物逐漸占據(jù)Se位點(diǎn)，這對(duì)量子點(diǎn)起到表面態(tài)鈍化作用，有利于提高CdSe量子點(diǎn)發(fā)光效率。但當(dāng)減小至0.07時(shí)，CdSe量子點(diǎn)的熒光降低了，這是由于Se2 的投入量過少，進(jìn)而造成Cd2+過量，過量的Cd2+會(huì)與OH-在溶液中形成CdO·nH2O沉淀，過多的沉淀吸附到量子點(diǎn)表面會(huì)不利于光激發(fā)。因此，本文將選取Cd∶Se的摩爾比為1∶0.10進(jìn)行后續(xù)的研究。

3.2 穩(wěn)定劑NAC用量的影響

穩(wěn)定劑的作用在于鈍化量子點(diǎn)的表面缺陷，減少非輻射重組，因而其濃度是影響量子點(diǎn)發(fā)光性能的重要因素。固定其余條件不變，只改變NAC的量，實(shí)驗(yàn)研究了Cd∶NAC的摩爾比為1∶0.48、1∶0.57、1∶0.67（[Cd2+]=8 mmol/L）時(shí)對(duì)CdSe量子點(diǎn)的影響。由圖2所示，隨著穩(wěn)定劑NAC用量的增加，CdSe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出先增后降的變化趨勢(shì)，當(dāng)Cd∶NAC的摩爾比為1∶0.57時(shí)合成的CdSe量子點(diǎn)的熒光最強(qiáng)。本文推測(cè)當(dāng)Cd∶NAC的摩爾比為1∶0.48時(shí)，由于沒有足夠的NAC來包裹CdSe量子點(diǎn)而造成大量的表面缺陷，致使CdSe量子點(diǎn)的發(fā)光效率降低，但當(dāng)Cd∶NAC的摩爾比增加大1∶0.67時(shí)，由于穩(wěn)定劑NAC過多，NAC與Cd2+之間會(huì)形成更穩(wěn)定的二硫配合物，游離的Cd2+減少，而未反應(yīng)的Se2-濃度增大，并導(dǎo)致更多的表面缺陷以致于CdSe量子點(diǎn)的熒光下降。

3.3 硼氫化鈉的影響

在其他條件最佳的情況下，只改變的NaBH4投入量，分別考察了Cd∶NaBH4的摩爾比為1∶5.78、1∶6.61、1∶8.26（[Cd2+]=8 mmol/L）對(duì)CdSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響。由圖3所示，隨著NaBH4用量的增加，CdSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度先增加后減小，當(dāng)Cd∶NaBH4的摩爾比為1∶6.61時(shí)，CdSe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。NaBH4作為還原劑，其作用在于將亞硒酸鈉中的Se4+還原成Se2-，所以反應(yīng)前體Se2-的濃度與NaBH4的用量有關(guān)。硼氫化鈉只有在合理的用量下，才能將亞硒酸鈉中的Se4+充分還原成Se2-，提高量子點(diǎn)的質(zhì)量。

3.4 氯化鎘加入的先后順序的影響

經(jīng)過前面的研究，篩選出反應(yīng)物最佳的投料比為Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩爾比為1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L），固定該投料比不變，僅改變CdCl2的加入順序來研究其對(duì)合成CdSe量子點(diǎn)的影響。由圖4看出，CdCl2的加入順序?qū)铣蒀dSe量子點(diǎn)的影響很大，CdSe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度以及發(fā)射波長(zhǎng)均發(fā)生了顯著地改變。因而，可以通過改變反應(yīng)物的加入順序來獲得不同顏色的CdSe量子點(diǎn)。

3.5 最佳條件下的CdSe量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率

以羅丹明-6G為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，乙醇為溶劑，采用參比法測(cè)得CdSe量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率為39%。CdSe量子點(diǎn)在545 nm處產(chǎn)生了明顯的熒光發(fā)射峰，峰型窄且對(duì)稱，說明在投料比為Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩爾比為1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L）的條件下，合成的CdSe量子點(diǎn)粒徑分布較均勻，在365 nm紫外光的激發(fā)下，量子點(diǎn)發(fā)出明亮的綠色。

3.6 CdSe量子點(diǎn)標(biāo)記HepG2細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)采用對(duì)生物體無毒性的生物小分子NAC替代毒性較大的巰基乙酸或巰基丙酸作為量子點(diǎn)的穩(wěn)定劑包覆在量子點(diǎn)的表面，使其能夠順利地侵染HepG2細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞成像研究。如圖5所示，被CdSe量子點(diǎn)標(biāo)記的HepG2細(xì)胞呈明亮的綠色熒光，細(xì)胞輪廓清晰可見，說明CdSe量子點(diǎn)是一種很好的生物熒光成像探針。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)主要對(duì)CdSe量子點(diǎn)的合成進(jìn)行研究并將其應(yīng)用于細(xì)胞成像。在量子點(diǎn)的合成部分，以在空氣中穩(wěn)定的Na2SeO3作為硒源，NAC作為穩(wěn)定劑，采用水熱法一步合成CdSe量子點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單易行。通過改變反應(yīng)物的投料比以及反應(yīng)物的加入順序，優(yōu)化了CdSe量子點(diǎn)的合成條件。投料比為Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩爾比為1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L），200℃下反應(yīng)40 min制備得的CdSe量子點(diǎn)光學(xué)特性優(yōu)良、粒徑分布均勻、生物相容性好。同時(shí)本文成功地將CdSe量子點(diǎn)應(yīng)用于HepG2細(xì)胞成像，為后續(xù)的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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