許佳玲, 王曉紅, 羅劍文, 龍 釗, 陳云鳳, 張以順

(中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510275)

蔡司LSM 7DUO NLO激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用和管理

許佳玲, 王曉紅, 羅劍文, 龍 釗, 陳云鳳, 張以順

(中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510275)

介紹了蔡司LSM7DUO NLO激光掃描共聚焦顯微鏡三個(gè)組成部分單光子、雙光子和快速掃描的硬件配置和軟件功能以及成像和圖像分析的應(yīng)用，例如單、雙光子圖像疊加，多視野拼接拍攝、三維重構(gòu)等功能在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用。介紹管理該儀器的一些方法和心得，保障儀器為教學(xué)和科研工作提供更好的服務(wù)。

激光共聚焦顯微鏡； 雙光子； 圖象采集

0 引 言

激光共聚焦顯微鏡是一種圖像采集和分析的大型儀器，傳統(tǒng)的單光子激光共聚焦顯微鏡是利用連續(xù)光激光器作為光源對(duì)熒光樣品進(jìn)行激發(fā)后經(jīng)過(guò)一系列光電成像部件進(jìn)行信息采集和信號(hào)放大，由于光路中的共軛聚焦裝置使得焦平面以外的雜散光無(wú)法進(jìn)入探測(cè)器從而得到較高分辨率的圖像[1-3]。雙光子激光共聚焦成像是利用飛秒激光器發(fā)射的脈沖光對(duì)熒光樣品進(jìn)行激發(fā)，只有分布在樣品焦平面的熒光素分子能獲得足夠的光量子發(fā)射出熒光，這就避免了非焦平面熒光的干擾，從而提高成像的亮度和信噪比[4-7]?？焖賿呙璧牟糠质抢镁€掃描的成像模式提高成像速度，可應(yīng)用于鈣火花或者微生物運(yùn)動(dòng)這類(lèi)快速反應(yīng)的拍攝，利于捕捉更多的動(dòng)態(tài)細(xì)節(jié)。

整臺(tái)儀器具備點(diǎn)掃描和線掃描兩種掃描模式，配備由紫外到紅外不同波長(zhǎng)的激光器以及高靈敏度探測(cè)器；另外配備活細(xì)胞工作站可用于長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞的監(jiān)測(cè)，壓電陶瓷Z軸納米級(jí)載物臺(tái)等硬件為實(shí)驗(yàn)解決方案提供了更多的選擇。由于該儀器實(shí)行校內(nèi)外共享服務(wù)，是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心公用儀器平臺(tái)中使用頻率最高的儀器之一，在管理和維護(hù)方面需要達(dá)到更高的標(biāo)準(zhǔn)[8-9]。

1 配置參數(shù)

(1) 光源。整機(jī)配有8根獨(dú)立的激光器，激發(fā)光源覆蓋范圍較廣，能夠滿足多種熒光樣品成像需求。單光子激光器波長(zhǎng)分別是405 nm、458 nm、 488 nm 、514 nm、561 nm、633 nm；雙光子使用的飛秒激光器波長(zhǎng)為 690～1 060 nm；快速掃描部分配備的高功率激光器波長(zhǎng)為405 nm、488 nm和532 nm。

激光器發(fā)出的激光通過(guò)AOTF聲光控制器動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)激光輸出的強(qiáng)度，調(diào)節(jié)范圍為0.1%～100%，從而實(shí)現(xiàn)掃描范圍內(nèi)的激光強(qiáng)度控制。

(2) 檢測(cè)器。點(diǎn)掃描成像檢測(cè)器由2個(gè)PMT通道和32個(gè)高靈敏GaAsP通道組成，成像最大分辨率可達(dá)6 144×6 144，掃描速度最高為8幅/s，可探測(cè)單光子和雙光子信號(hào)。外置的2個(gè)NDD探測(cè)器專(zhuān)用于探測(cè)雙光子熒光信號(hào)，其光路直接由側(cè)向收集避免熒光傳輸在多個(gè)棱鏡和光學(xué)器件中過(guò)多損耗，成像最大分辨率6 144×6 144，掃描速度最高為8幅/s。快速掃描部分的線掃描檢測(cè)器由2個(gè)CDD組成，成像最大分辨率為1 536×1 536，掃描速度最高可達(dá)到120幅/s。

(3) 顯微鏡。研究級(jí)電動(dòng)倒置顯微鏡Observe Z1，物鏡10×(NA 0.45)、20×(NA 0.8)；水鏡32×(NA 0.85)、63×(NA 0.85)；油鏡40×(NA 1.3)，100×(NA 1.4)。配置高數(shù)值孔徑的物鏡可為成像帶來(lái)更高的分辨精度。

(4) 壓電陶瓷Z軸納米級(jí)載物臺(tái)和活細(xì)胞工作站。壓電陶瓷Z軸納米級(jí)載物臺(tái)Z-Piezo stage最大掃描范圍250 μm，resolution 5 nm，配合LIVE快速掃描探測(cè)器可實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)和細(xì)致的成像效果。活細(xì)胞工作站incubator PM S1帶有培養(yǎng)皿和6孔恒溫樣品槽，溫度控制范圍為室溫-60 ℃，精度可達(dá)0.1 ℃；加濕加熱模塊、二氧化碳濃度控制在0%～8%和氧氣濃度控制在0%～21%，保證細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境，適合長(zhǎng)時(shí)間觀察。

(5) 軟件。ZEN2011，包含基礎(chǔ)模塊、生理學(xué)模塊、拼圖和多點(diǎn)取圖模塊、FRAP模塊可滿足多種實(shí)驗(yàn)圖像攝取和分析。

2 主要功能特點(diǎn)及在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 單光子、雙光子高精度多通道成像及圖像分析

單光子共聚焦顯微原理是利用短波長(zhǎng)高能量的激發(fā)光激發(fā)樣品發(fā)射出長(zhǎng)波長(zhǎng)較低能量的熒光實(shí)現(xiàn)成像，樣品所發(fā)出的熒光經(jīng)過(guò)針孔過(guò)濾焦平面以外的雜散光使熒光成像更精確，其平面分辨率可達(dá)200 nm，成像質(zhì)量可達(dá)到6 144×6 144；而雙光子激光共聚焦成像則是利用長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外脈沖光進(jìn)行激發(fā)，熒光樣品僅在焦平面能夠得到足夠的光子才能受激發(fā)射出較短波長(zhǎng)的熒光，所以雙光子激光共聚焦無(wú)需針孔就能夠?qū)崿F(xiàn)焦平面成像，其平面分辨率可達(dá)180 nm，圖像的Z軸分辨率較高，其成像質(zhì)量可達(dá)到6 144×6 144。單光子和雙光子熒光圖像以及DIC多通道疊加效果如圖1所示。得到2維圖像可以做熒光半定量、共定位分析，在zen2011軟件中可以在histo和coloc中進(jìn)行相應(yīng)操作，分別如圖2、3所示。

2.2 三維重構(gòu)

樣品在激光共聚焦顯微鏡下可進(jìn)行連續(xù)的光學(xué)切片，在軟件中設(shè)置光切的起始點(diǎn)和結(jié)束點(diǎn)以確定掃描范圍并設(shè)置好光學(xué)切片之間的間隔，需要注意的是如果進(jìn)行多個(gè)熒光通道的層切，在軟件中選擇“matchpinhole”進(jìn)行多通道拍攝厚度的校準(zhǔn)，較厚的樣品可對(duì)不同深度的激發(fā)光和PMT電壓可以進(jìn)行優(yōu)化；針對(duì)小鼠胚胎和器官等超大樣品的三維重構(gòu)，建議先對(duì)樣品進(jìn)行透明化處理[10-11]，再用雙光子部分進(jìn)行光切成像。某些熒光容易淬滅的樣品又需要做三維重構(gòu)時(shí)，我們建議使用Piezo載物臺(tái)并選擇快速掃描模式進(jìn)行成像，盡量減少激光在樣品上停留的時(shí)間，最大程度降低光漂白效應(yīng)；得到的連續(xù)多張光學(xué)切片圖像之后可在軟件中進(jìn)行3維重構(gòu)。重構(gòu)效果可根據(jù)樣品的需求和特性在軟件的3D高級(jí)應(yīng)用模塊中進(jìn)行相應(yīng)的選擇及調(diào)整，最后輸出圖片或視頻，如圖4所示。

圖2 Histo功能及分析結(jié)果示意圖

圖3 Coloc功能及分析結(jié)果示意圖

圖4 3維重構(gòu)示意圖

對(duì)于一些需要三維重構(gòu)之后進(jìn)行分析的特殊樣品，拍攝之后可在Orth功能下進(jìn)行三維定位分析判斷不同熒光樣品在空間分布的相互關(guān)系，如圖5所示。

2.3 圖像拼接

利用zen2011軟件中tile scan模塊可對(duì)腦片、動(dòng)物胚胎、斑馬魚(yú)、植物組織等生物樣品的顯微圖像拼接進(jìn)而完成整體成像(見(jiàn)圖6)。除了在平面上進(jìn)行拼圖，還可以結(jié)合z-stack進(jìn)行大樣品整體三維重構(gòu)。拍攝圖像時(shí)需要在軟件中設(shè)置小圖之間overlap，保證圖像拼接柔和過(guò)渡，避免拼接痕跡過(guò)于明顯。

圖5 Orth功能下圖像的3D分析圖圖6 拼接拍攝植物根部橫切圖

2.4 長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞培養(yǎng)觀察

使用zen2011軟件中time series可實(shí)現(xiàn)時(shí)間序列的拍攝，在菜單中進(jìn)行時(shí)間序列的設(shè)置除了設(shè)置拍攝數(shù)量和時(shí)間間隔之外還有多重選擇，比如拍攝的起始、停頓等以及加藥可以設(shè)置marker并接通灌流裝置進(jìn)行觸發(fā)等等，使實(shí)驗(yàn)的操作更具人性化。

結(jié)合活細(xì)胞工作站實(shí)現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間觀察細(xì)胞的形態(tài)、記錄細(xì)胞內(nèi)的熒光變化(如鈣離子、PH值的監(jiān)測(cè))，為了避免細(xì)胞多次掃描出現(xiàn)光漂白的情況，建議設(shè)置拍攝條件中使用較低激光強(qiáng)度和較高的PMT電壓進(jìn)行成像。針對(duì)特殊樣品，比如一些反應(yīng)極為迅速或抗淬滅能力較弱的樣品進(jìn)行相關(guān)的圖像采集，建議使用快速掃描模塊進(jìn)行拍攝。

2.5 激發(fā)光譜掃描和發(fā)射光譜掃描

激發(fā)光譜和發(fā)射光譜掃描能夠全面地檢測(cè)樣品的熒光特性，為熒光采集和后期圖像處理提供依據(jù)。雙光子激光共聚焦是基于非線性光學(xué)一種成像模式，熒光素在與生物樣品結(jié)合之后可能會(huì)出現(xiàn)不同程度的藍(lán)移或紅移，可以利用飛秒激光器的連續(xù)可調(diào)的特點(diǎn)，利用excitation fingerprinting功能模塊進(jìn)行激發(fā)光譜的全面掃描，幫助找尋到最高效成像的激發(fā)波長(zhǎng)，這種方法同樣適用于對(duì)未知樣品的檢測(cè)。

發(fā)射光光譜掃描則是對(duì)樣品在特定波長(zhǎng)激光的激發(fā)下所發(fā)射的熒光分布情況，這類(lèi)功能適用于解決激發(fā)光串?dāng)_的熒光樣品，比如解決植物的葉綠體自發(fā)熒光、動(dòng)物切片中的血細(xì)胞自發(fā)熒光對(duì)圖像的干擾[12]。激光共聚焦顯微鏡配備的高靈敏探測(cè)器在lambda mode下能夠?qū)崿F(xiàn)波長(zhǎng)8.9 nm每幅圖像一次成像，提高發(fā)射光譜掃描的準(zhǔn)確性。掃描得到多張不同波長(zhǎng)接收到的圖片后在軟件Unmixing功能下可以得到樣品不同部位的發(fā)射光光譜曲線，如圖7所示。

圖7 雙光子激發(fā)光下樣品不同部位的發(fā)射光光譜圖

2.6 光漂白恢復(fù)、熒光能量共振轉(zhuǎn)移

光漂白恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)用于量化分子流動(dòng)性，可用于測(cè)定細(xì)胞膜蛋白的流動(dòng)性、細(xì)胞之間的縫隙連接通信功能[13]。在軟件中需要設(shè)置漂白的區(qū)域、用于漂白的激光強(qiáng)度、光漂白的次數(shù)、拍攝時(shí)間序列圖片完整呈現(xiàn)光漂白和恢復(fù)的過(guò)程等。雙光子激光器的能量較高，針對(duì)需要對(duì)某些熒光分子較穩(wěn)定難以漂白的樣品進(jìn)行光漂白實(shí)驗(yàn)時(shí)可以選用；若熒光分子的流動(dòng)性極好，漂白后恢復(fù)的時(shí)間非常短，可以用快速掃描模塊進(jìn)行快速圖像采集盡可能捕捉更多的動(dòng)態(tài)細(xì)節(jié)。軟件中有相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析功能，針對(duì)集中較常見(jiàn)的情況也給出了擬合的曲線可供選取。

熒光能量共振轉(zhuǎn)移用于測(cè)量分子之間的相互作用，常用的方法有受體漂白法和受體發(fā)射測(cè)定法；另外雙熒光互補(bǔ)載體系統(tǒng)(BIFC)則更多地被應(yīng)用于植物細(xì)胞的研究中[14-16]。zen2011軟件中配有專(zhuān)門(mén)處理熒光能量共振轉(zhuǎn)移這一類(lèi)實(shí)驗(yàn)的FRET模塊，便于用戶對(duì)采集到的圖像進(jìn)行分析。

3 維護(hù)要點(diǎn)

(1) 規(guī)范操作。日常操作嚴(yán)格按照操作規(guī)程，遵守儀器的開(kāi)關(guān)機(jī)流程，做好物鏡的清潔，使用結(jié)束后保證激光器充分散熱才能關(guān)閉儀器。設(shè)置緩沖間將實(shí)驗(yàn)操作區(qū)域和成像區(qū)域嚴(yán)格分開(kāi)，避免有毒有害藥物試劑污染顯微鏡房。

(2) 儀器室內(nèi)潔凈度。顯微鏡這類(lèi)光學(xué)儀器，對(duì)室內(nèi)潔凈度要求較高，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行除塵和凈化，保持室內(nèi)空氣潔凈；并要求進(jìn)入顯微鏡房的人員必須穿實(shí)驗(yàn)服，更換專(zhuān)用的鞋套或拖鞋。

(3) 溫濕度控制。顯微鏡房?jī)?nèi)為了進(jìn)行溫度控制，安裝了2臺(tái)高功率的冷暖空調(diào)，保證室內(nèi)溫度常年維持在18～22 ℃；南方的天氣比較潮濕，特別是每年的梅雨季節(jié)，為了保護(hù)光學(xué)鏡頭避免霉變，安裝了3臺(tái)大容量抽濕機(jī)輪流工作，將濕度控制在40%～60%之間。

(4) 遮光。熒光樣品必須避光保護(hù)，而雙光子激光共聚焦專(zhuān)用的NDD探測(cè)器極容易受外界光線干擾，所以在儀器的避光方面，準(zhǔn)備了針對(duì)單光子和雙光子成像兩套避光方案，雙光子成像方案利用環(huán)保遮光布在顯微鏡不同工作區(qū)域進(jìn)行避光處理，其避光率達(dá)到98%以上，圖像采集時(shí)盡量減少外界光線干擾。

4 管理模式探討

(1) 通過(guò)公用儀器平臺(tái)的網(wǎng)站進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)預(yù)約。用戶必須經(jīng)過(guò)管理員培訓(xùn)合格之后方能獲得預(yù)約權(quán)限；提前2～7天進(jìn)行網(wǎng)上預(yù)約，用戶嚴(yán)格按照預(yù)約時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，爽約或遲到會(huì)有相應(yīng)處罰，避免用戶超時(shí)預(yù)約，造成機(jī)時(shí)浪費(fèi)。

(2) 培訓(xùn)方式。用戶首次使用儀器時(shí)，由管理人員陪同拍攝圖像直至用戶能夠自行操作，管理人員也提供相應(yīng)的前期樣品處理和后期數(shù)據(jù)分析指導(dǎo)并在網(wǎng)絡(luò)上提供了相關(guān)操作指南和軟件操作視頻。用戶按照操作規(guī)程正規(guī)使用儀器和軟件，能夠避免人為錯(cuò)誤操作造成儀器和人身?yè)p害，例如使用結(jié)束之后必須讓激光器徹底散熱之后才能關(guān)機(jī)，保證激光器的正常使用壽命；使用雙光子成像時(shí)，更換樣品必須切換到肉眼觀察模式，避免灼傷。

根據(jù)使用情況，每學(xué)期開(kāi)展顯微成像技術(shù)相關(guān)講座，對(duì)用戶遇到的各種問(wèn)題進(jìn)行分析和探討，增進(jìn)管理人員和用戶之間的交流。

(3) 后期數(shù)據(jù)分析。提供zen2011離線軟件可自行安裝使用，針對(duì)一些較大圖像，提供臺(tái)式工作站級(jí)別電腦供給用戶進(jìn)行高級(jí)數(shù)據(jù)分析，安裝Imaris 3D圖像分析軟件可進(jìn)一步描繪和計(jì)算。

(4) 為校內(nèi)外提供測(cè)試服務(wù)。本儀器已被納入廣州地區(qū)大型科學(xué)儀器協(xié)作網(wǎng)為校外單位提供測(cè)試服務(wù)，每年對(duì)外提供服務(wù)的機(jī)時(shí)約為50～100 h。

(5) 定期整理儀器使用情況。定期整理用戶使用的情況，包括用戶所拍攝的樣品和激光器的使用等情況，制定相應(yīng)的儀器保養(yǎng)計(jì)劃，并對(duì)激光器的壽命進(jìn)行預(yù)估，及時(shí)做好激光器的更新申報(bào)。及時(shí)收集用戶使用的反饋情況，包括使用出現(xiàn)的疑問(wèn)和應(yīng)用發(fā)面的需求以及文章發(fā)表情況。

5 結(jié) 語(yǔ)

激光共聚焦顯微鏡廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、材料學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，LSM7DUO NLO 由點(diǎn)掃描共聚焦780LSM與雙光子共聚焦NLO和線掃描共聚焦live三部分組成，搭載這3種不同類(lèi)型檢測(cè)器為用戶提供更多的圖像采集方式；激發(fā)光范圍覆蓋紫外到紅外之間，能為更多的熒光樣品提供匹配的激發(fā)光；圖像拼接和三維層切等多種拍圖模式性能互補(bǔ)使其在相關(guān)研究應(yīng)用中更加靈活。如此龐大的顯微成像儀器，如何做好維護(hù)和管理并且更好地開(kāi)發(fā)利用是儀器管理人員需要繼續(xù)研究和深入的問(wèn)題。

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Application and Administration of Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss LSM 7DUO NLO

XUJialing，WANGXiaohong，LUOJianwen，LONGZhao，CHENYunfeng，ZHANGYishun

(School of Life Science， Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510275， China)

This paper introduces the components and biological applications of the confocal laser scanning microscopy Zeiss LSM 7DUO NLO. Because of three difference kinds of scanning pattern, we have the flexibility of choice in using the microcopy. For example, they are multichannel fluorescence image acquisition overlays with one photon and two-photon images, Multiple view mosaic scanning with huge sample,3D reconstruction, and so on. This paper also introduces the administration and maintenance of the confocal laser scanning microscopy Zeiss LSM 7DUO NLO.

laser scanning microscopy; two-photon; image acquisition

2016-10-15

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313376)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201510010270)；中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究(改革)項(xiàng)目(201650，201658)

許佳玲(1986-)，女，廣東潮州人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事激光掃描共聚焦顯微鏡等大型光學(xué)儀器的應(yīng)用和管理。

Tel.：020-84113685； E-mail：jasxu@foxmail.com

張以順(1966-)，男，貴州畢節(jié)人，博士，正高級(jí)工程師，實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心副主任，主要從事本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)建設(shè)與管理、大型設(shè)備共享平臺(tái)建設(shè)與管理工作。

Tel.：020-84110797； E-mail：lsszys@sysu.edu.cn

Q 334

A

1006-7167(2017)06-0281-05