李懷志 劉士輝 沈若剛 張中林 黃和喜 王兆龍

摘要[目的] 對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行有效的遺傳多樣性分析，對(duì)于制訂鐵皮石斛的保護(hù)策略具有重要的意義。[方法]使用25對(duì)SRAP引物對(duì)供試的石斛進(jìn)行遺傳多樣性分析。[結(jié)果] 25對(duì)SRAP標(biāo)記共獲得86條多態(tài)性條帶，每對(duì)引物組合可擴(kuò)增出1～6條多態(tài)性條帶，平均3.07條；20份石斛品系間Jaccard相似系數(shù)為0.002～0.821；構(gòu)建了20份石斛品系的SRAP特征指紋圖譜。 [結(jié)論]供試的鐵皮石斛有較為豐富的遺傳變異。

關(guān)鍵詞鐵皮石斛；SRAP；遺傳多樣性；指紋圖譜

中圖分類號(hào)S502.4；R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）14-0126-03

Abstract[Objective]The genetic diversity of Dendrobium officinale was analyzed，which had the vital significance for formulating conservation strategies for D.officinale.[Method] Twentyfive pairs of SRAP primer combinations were used to evaluate genetic diversity of Dendrobium.[Result] These primer combinations produced 86 polymorphic bands.Each primer pair can produce 1-6 bands，an average of 3.07.Jaccard similarity coefficient among 20 Dendrobium ranged from 0.002 to 0.821. Characteristic fingerprint among 20 Dendrobium was constructed.[Conclusion] There had abundant variation in tested D.officinale.

Key wordsDendrobium officinale；Sequencerelated amplified polymorphism （SRAP）；Genetic diversity；Fingerprint

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛蘭屬多年生附生草本植物，主要分布于浙江、云南、福建、貴州、廣東、廣西、湖南、江西等地，其干燥莖是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有降低血糖、提高機(jī)體免疫、抗癌、抗氧化等作用。近年來(lái)，由于過(guò)度采挖，加上其苛刻的生長(zhǎng)環(huán)境，野生的鐵皮石斛資源已日漸枯竭。對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行有效的遺傳多樣性分析，對(duì)于制訂鐵皮石斛的保護(hù)策略具有重要的意義。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequencerelated amplified polymorphism，SRAP）是一種新型的基于PCR 的標(biāo)記系統(tǒng)，最早由Li等[1]提出。由于SRAP標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性較好、多態(tài)性較高、共顯性高等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、圖譜構(gòu)建、指紋分析及圖位克隆等方面[2]。

目前鐵皮石斛栽培技術(shù)基本成熟，影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸是種質(zhì)混亂、品種退化等問(wèn)題。大部分種植基地的鐵皮石斛群體在形態(tài)和顏色上不一致，莖稈顏色有深有淺，有些吃起來(lái)有很多渣子。這主要是由于目前應(yīng)用的種源基本上是野生植株繁殖的，沒(méi)有經(jīng)過(guò)人工選育，而有些野生植株本身是雜合的，如果進(jìn)行自花授粉，其后代是分離的，這只有通過(guò)人工選育才能解決。對(duì)上海孫橋現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園的鐵皮石斛進(jìn)行評(píng)價(jià)有助于理清這些種質(zhì)的親緣關(guān)系，為以后鐵皮石斛間雜交育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料供試石斛種質(zhì)資源來(lái)源于安徽、浙江等石斛主要產(chǎn)區(qū)。SH-1是金釵石斛（D.nobile Lindl.），SH-2和SH-3是霍山石斛（D.huoshanense），SH-20是金釵石斛與鐵皮石斛的雜交種，其余是鐵皮石斛（D.officinale）。該試驗(yàn)所用石斛均是組培苗。

1.2基因組DNA提取取植株嫩葉，采用CTAB法提取基因組[3]，以Lambda DNA作為對(duì)照，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并稀釋至約20 ng/L備用。

1.3PCR擴(kuò)增引物序列參照表2[1]，由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。SRAP-PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL，其中包括MgCl2 2.0 mmol/L、dNTP各為0.2 mmol/L、引物0.50 μmol/L、模板DNA 50 ng、Taq酶1 U，不足部分用無(wú)菌水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序如下：反應(yīng)混合物94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min， 35 ℃復(fù)性1 min， 72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min， 55 ℃復(fù)性1 min， 72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物加3 /4體積的上樣緩沖液， 94 ℃變性5 min。采用4%的變性聚丙烯酰胺凝膠， 0.5 ×TBE緩沖液，60 W恒功率電泳1.5 h，銀染檢測(cè)電泳結(jié)果。

1.4數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)清晰、再現(xiàn)性強(qiáng)的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物按同一位點(diǎn)條帶有或無(wú)分別賦值，有帶記為“1”， 無(wú)帶記為“0”； 采用NTSYS-pc version 2.10軟件計(jì)算Jaccard相似系數(shù)， 按照UPGMA法進(jìn)行聚類。

2結(jié)果與分析

2.1品種遺傳多樣性分析 從154對(duì)SRAP引物組合中篩選出37對(duì)帶型清晰、多態(tài)性好的引物組合用于遺傳多樣性研究，選出其中25對(duì)引物，擴(kuò)增出的可重演性的差異條帶為86條，擴(kuò)增片段大小從140～680 bp不等。平均每個(gè)引物組合擴(kuò)增出3.07條多態(tài)性條帶，其中引物ME8-EM14擴(kuò)增的多態(tài)性條帶最多，為6條。品種間Jaccard相似系數(shù)為0.002～0.821。20份石斛品系中相似系數(shù)最大為0.821（SH-8與SH-12），相似系數(shù)最小為0.002（SH-1與SH-4）。

2.2品種聚類分析以0.260為閾值，把20份石斛品系分成4個(gè)類群（圖1）。第Ⅰ類群為金釵石斛SH-1，第Ⅱ類群為霍山石斛，包含SH-2和SH-3，第Ⅲ類群為金釵石斛與鐵皮石斛的雜交種SH-20，第Ⅳ類群為鐵皮石斛。從圖1中看出金釵石斛與鐵皮石斛的雜交種SH-20與霍山石斛聚在一起，與鐵皮石斛的親緣關(guān)系較近，與金釵石斛的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。金釵石斛與鐵皮石斛雜交種繼承了金釵石斛的高產(chǎn)量，因此市場(chǎng)上經(jīng)常出現(xiàn)以雜交種冒充鐵皮石斛坑害消費(fèi)者的現(xiàn)象。

2.3品種指紋圖譜構(gòu)建根據(jù)每個(gè)品種DNA 擴(kuò)增圖譜中SRAP 標(biāo)記位點(diǎn)條帶的有（1）或無(wú)（0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果由0和1排列形成字符串，構(gòu)成一個(gè)品種的數(shù)字指紋圖譜。表3 列出了20份石斛品系的數(shù)字指紋圖譜。從擴(kuò)增出的86條特征條帶中選擇11條譜帶把供試20份石斛品系完全區(qū)分開，這11條帶是由ME8-EM14、ME9-EM3、ME1-EM7、ME1-EM14、ME3-EM3及ME3-EM5這6對(duì)引物擴(kuò)增的。

3結(jié)論與討論

研究表明SRAP技術(shù)是研究作物遺傳多樣性的有效工具。通過(guò)對(duì)孫橋農(nóng)業(yè)園鐵皮石斛遺傳多樣性分析，理清了石斛間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為防止品種間混雜，并為鐵皮石斛間雜交選育提供依據(jù)。

丁鴿等[4]利用RAPD標(biāo)記對(duì)不同居群鐵皮石斛的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究表明鐵皮石斛種內(nèi)多態(tài)性水平較高，可達(dá)91.35%，用SRAP標(biāo)記評(píng)價(jià)不同居群種內(nèi)多態(tài)性水平可達(dá)88.01%。包英華等[5]、肖正杭[6]采用SRAP 標(biāo)記技術(shù)擴(kuò)增8個(gè)居群鐵皮石斛DNA條帶，結(jié)果表明從64對(duì)SRAP引物組合中篩選出7 對(duì)有效引物組合，共擴(kuò)增出396條清晰譜帶，其中多態(tài)性條帶占382個(gè)，總多態(tài)性條帶比率 99.46%，其鐵皮石斛遺傳多樣性水平比該研究中遺傳多樣性水平高的原因在于該研究只統(tǒng)計(jì)了具有重演性的差異DNA譜帶主帶。

在鐵皮石斛親緣關(guān)系分析上，SSR和SRAP標(biāo)記對(duì)親緣關(guān)系的分類相同，說(shuō)明SRAP標(biāo)記在遺傳親緣關(guān)系分析上和SSR標(biāo)記一樣有很高的可靠性。

總之，利用SRAP技術(shù)對(duì)鐵皮石斛親緣關(guān)系分析可以揭示石斛不同品系之間的關(guān)系遠(yuǎn)近，并為品種鑒定及育種提供更準(zhǔn)確的信息。

參考文獻(xiàn)

[1] LI G，QUIROS C F.Sequencerelated amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet，2001，103（2/3）： 455-461.

[2] 柳李旺，龔義勤，黃浩，等.新型分子標(biāo)記：SRAP與TRAP及其應(yīng)用[J].遺傳，2004，26（5）： 777-781.

[3] MUTLU N，BOYACI F H，GCMEN M，et al.Development of SRAP，SRAPRGA，RAPD and SCAR markers linked with a Fusarium wilt resistance gene in eggplant[J].Theoretical and applied genetics，2008，117（8）：1303-1312.

[4] 丁鴿，丁小余，沈潔，等.鐵皮石斛野生居群遺傳多樣性的RAPD分析與鑒別[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（11）：1028-1032.

[5] 包英華，潘超美，白音，等.鐵皮石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（5）：349-353.

[6] 肖正杭.鐵皮石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性及HPLC指紋圖譜分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2013.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（14）：129-131