蔡 樂，白 林，范金釗，任 韡，黃曉舞

（解放軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100853）

·實(shí)驗(yàn)研究·

HPLC法測(cè)定魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量

蔡 樂，白 林，范金釗，任 韡，黃曉舞

（解放軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100853）

目的：建立HPLC法測(cè)定魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量。方法：采用超聲提取方法處理魚肝油軟膏，用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定。色譜柱為Platisil ODS C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水（98 : 2），流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm，柱溫：30 ℃。結(jié)果：維生素A在0.587 9 ～ 7.348 5 U·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.999 9）；樣品平均回收率為99.78%（RSD = 1.57%）。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量測(cè)定。

魚肝油軟膏；維生素A醋酸酯；高效液相色譜法；含量測(cè)定

魚肝油軟膏為《解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2015年版）中收載的皮膚科外用制劑，由魚肝油和凡士林組成，具有營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)、潤(rùn)滑及促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)等作用，有助于傷口、燒傷及各種潰瘍的愈合。臨床中可用于慢性皮膚結(jié)核、皸裂、魚鱗病、皮膚干燥、外傷、燒燙傷、潰瘍及子宮頸炎等[1]。魚肝油主要含有維生素A類和維生素D類脂溶性維生素[2-3]，維生素A有多種分子形式，人工合成的維生素A主要為維生素A醋酸酯，其中全反式維生素A醋酸酯為活性成分，為控制魚肝油軟膏的質(zhì)量，本研究建立了HPLC方法測(cè)定魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括1200系列在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測(cè)器、色譜工作站，美國(guó)Agilent公司）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）。

魚肝油軟膏（本院自制，規(guī)格1 0%，批號(hào)20161025，20161101，20161108）；維生素A醋酸酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100368-201301，每1 g中含維生素A醋酸酯343 mg，其中含全反式維生素A醋酸酯96.9%）；甲醇為色譜純；乙醇為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Platisil ODS C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（98 : 2）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱定維生素A醋酸酯1.014 1 g，置于100 mL棕色量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液A。精密移取儲(chǔ)備液A 1 mL置于50 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液B。精密移取儲(chǔ)備液B 1.5 mL置于100 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含相當(dāng)于維生素A為2.939 4 U的對(duì)照品溶液（1 U維生素A = 0.344 μg全反式維生素A醋酸酯）。

2.2.2 供試品溶液 避光操作，取供試品適量（約相當(dāng)于含魚肝油0.25 g），精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，加無(wú)水乙醇約30 mL，于50 ℃水浴加熱超聲10 min，放至室溫，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，置于冰浴中冷卻1 h，取出后迅速濾過(guò)，放至室溫，精密量取續(xù)濾液4 mL，置10 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 另按處方比例及制備工藝，配制不含魚肝油的空白制劑，依“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定HPLC圖譜，考察供試品中全反式維生素A醋酸酯和其他組分色譜峰分離情況。在此色譜條件下，全反式維生素A醋酸酯的保留時(shí)間約為10.0 min，全反式維生素A醋酸酯色譜峰峰形對(duì)稱尖銳，基線平穩(wěn)，與其他色譜峰分離良好，陰性樣品無(wú)干擾。具體見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液，加流動(dòng)相配制成含全反式維生素A醋酸酯濃度為0.587 9，1.469 7，2.939 4，4.409 1，5.878 8，7.348 5 U·mL-1的溶液。分別精密吸取各濃度溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得全反式維生素A醋酸酯的回歸方程為Y = 32.104 X + 0.798 2，r = 0.999 9。結(jié)果表明，全反式維生素A醋酸酯在0.587 9 ～ 7.348 5 U·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，計(jì)算全反式維生素A醋酸酯的峰面積RSD（n = 6）為0.35%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)20161101）約2.5 g，共6份，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測(cè)定，計(jì)算含量RSD為2.09%（n = 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

圖1 魚肝油軟膏的HPLC色譜圖A – 對(duì)照品溶液，B – 供試品溶液，C – 陰性對(duì)照溶液；1 – 全反式維生素A醋酸酯Fig 1 HPLC chromatograms of cod liver oil ointmentA – reference solution, B – test solution, C – negative reference solution; 1 – all-trans vitamin A acetate

取同一供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算全反式維生素A醋酸酯的峰面積RSD為1.23%（n = 6），表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下空白制劑9份，分成3組，每組3份，每份約2.5 g。分別精密加入一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按供試品溶液制備方法制成含量約為供試品標(biāo)示量的80%、100%和120%的樣品溶液。依“2.1”色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)20161025、20161101、20161108），每批樣品測(cè)定3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算各個(gè)樣品中全反式維生素A醋酸酯的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 質(zhì)控指標(biāo)的選擇

魚肝油是從無(wú)毒海魚肝臟中提取出并經(jīng)適當(dāng)工藝制成的一種脂肪油制劑，主要含有維生素A和維生素D。維生素A是調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞分化生長(zhǎng)的輔助因子，可催化黏多糖的合成以及維持上皮組織結(jié)構(gòu)的完整性。維生素D也對(duì)維持上皮細(xì)胞功能具有一定的作用[4]。本研究曾考慮將維生素A和維生素D均作為魚肝油軟膏的質(zhì)量控制指標(biāo)，但經(jīng)查閱文獻(xiàn)[5]和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該制劑中維生素D含量較低（15 U·g-1），采用該方法測(cè)定時(shí)不可檢出，故只選用維生素A作為魚肝油軟膏的質(zhì)控指標(biāo)?！吨袊?guó)藥典》2015年版中維生素A的含量以單位（U）表示，因此本研究將反式維生素A醋酸酯的含量折算為單位標(biāo)示。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test. n = 9

表2 魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯的含量. n = 3Tab 2 Determination of contents of all-trans vitamin A acetate in cod liver oil ointment. n = 3

3.2 樣品處理方法的優(yōu)化

本研究對(duì)樣品的提取溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醇的提取率明顯高于流動(dòng)相。為減小供試品溶液對(duì)色譜柱的損害，本研究在樣品提取后，先在冰浴條件下使部分輔料沉淀，濾過(guò)后再加入流動(dòng)相進(jìn)一步使輔料沉淀，最后用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后進(jìn)樣[6]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，50 ℃水浴時(shí)充分振搖可完全提取樣品，因50 ℃超聲提取方法相對(duì)簡(jiǎn)便且重現(xiàn)性更好，為此采用50 ℃下超聲處理作為提取方法。

3.3 含量范圍的確定

參考《中國(guó)藥典》2015年版，每1 g魚肝油應(yīng)含維生素A 1350 ～ 1800 U（標(biāo)示量的90.0% ～ 120.0%），設(shè)定魚肝油軟膏允許的投料范圍為90.0% ～ 110.0%，每1 g 10%魚肝油軟膏應(yīng)含維生素A 121.5 ～ 198 U，即標(biāo)示量的81% ～ 132%。為提高自制制劑的標(biāo)準(zhǔn)，本研究將自制制劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為標(biāo)示量的85% ～ 125%。

結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，可作為魚肝油軟膏中全反式維生素A醋酸酯含量測(cè)定的方法。

[1] 中央軍委后勤保障部衛(wèi)生局.中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范（第一冊(cè)）[S].2015年版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2016：191-192. [2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：686.

[3] 牛劍釗，黃海偉，張啟明.《中國(guó)藥典》2010年版魚肝油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題的探討和建議[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2013，15（3）：163-164. [4] 廖二元.維生素D制劑的藥理機(jī)制與臨床應(yīng)用[J].中南藥學(xué)，2003，1（2）：98-102.

[5] 馮國(guó).反相高效液相色譜法測(cè)定維D2磷酸氫鈣片中維生素D2的含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2013，22（12）：91-92.

[6] 蔡樂，白林，徐風(fēng)華，等.HPLC法測(cè)定薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2014，11（2）：82-84.

Determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment by HPLC

CAI Le, BAI Lin, FAN Jin-zhao, REN Wei, HUANG Xiao-wu(Pharmaceutical Department of PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective: To establish the HPLC method for determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment. Methods: The Vitamin A acetate in ointment was extracted by ultrasonic method, and the content of all-trans Vitamin A acetate was determinated by HPLC method. HPLC was carried out on a column of Platisil ODS C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with mobile phase consisting of methanol-water (98 : 2). The fl ow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 328 nm. The column temperature was 30 ℃. Results: Vitamin A showed a good linear relationship in the range of 0.587 9 – 7.348 5 U·mL-1(r = 0.999 9). The average recovery was 99.78% (RSD = 1.57%). Conclusion: The method is simple, accurate and repeatable, which is suitable for the content determination of all-trans Vitamin A acetate in cod liver oil ointment.

Cod liver oil ointment; Vitamin A acetate; HPLC; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)03 – 0143 – 03

2016-11-22

2017-03-13）

解放軍總醫(yī)院臨床扶持基金（2012FC-CXYY-4008）

黃曉舞，女，副主任藥師，研究方向：藥物制劑與藥品質(zhì)量控制。E-mail：huangxw301@163.com

蔡樂，男，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、藥物分析。E-mail：caile15009@163.com