劉 俐，穆麗華，劉 屏

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024；2.解放軍總醫(yī)院藥理藥學(xué)研究室，北京 100853）

異葉敗醬提取物對(duì)白血病細(xì)胞體外抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉 俐1,2，穆麗華2，劉 屏2

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024；2.解放軍總醫(yī)院藥理藥學(xué)研究室，北京 100853）

目的：研究異葉敗醬提取物對(duì)白血病細(xì)胞體外增殖的毒性抑制作用。方法：提取異葉敗醬浸膏，通過(guò)硅膠柱分離純化異葉敗醬中的單體化合物，選擇白血病細(xì)胞株HL-60、K562、Jurkat為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，與不同濃度的異葉敗醬提取物及分離得到的單體化合物共同培養(yǎng)，采用CCK-8法檢測(cè)其對(duì)白血病細(xì)胞體外增殖的影響，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)化合物3對(duì)K562細(xì)胞凋亡和周期的影響。結(jié)果：異葉敗醬提取物和單體化合物均對(duì)白血病細(xì)胞有一定的毒性抑制作用，并且抑制作用與藥物濃度有依賴關(guān)系。當(dāng)不同濃度的化合物3作用于K562細(xì)胞后，K562細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，細(xì)胞早期凋亡率明顯上升，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P ＜ 0.01）；細(xì)胞周期G0/G1期所占比率由42.34%增至59.48%和64.72%，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P ＜ 0.01）。結(jié)論：異葉敗醬提取物對(duì)白血病細(xì)胞具有明顯的體外增殖毒性抑制作用，從中分離得到的環(huán)烯醚萜類化合物3能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡，并且將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。異葉敗醬提取物發(fā)揮抗腫瘤藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)很可能與其中的環(huán)烯醚萜類成分有關(guān)。

異葉敗醬；白血??；細(xì)胞凋亡；環(huán)烯醚萜

白血病的發(fā)病是由于造血干細(xì)胞的惡性病變，白血病細(xì)胞在骨髓、造血組織中非正常大量增生，抑制正常造血過(guò)程，白血病的分型主要有慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）、慢性粒細(xì)胞性白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）、急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）[1]。目前白血病的主要治療方法是化療，化學(xué)藥物在治療白血病的同時(shí)，也給患者機(jī)體造成難以逆轉(zhuǎn)的傷害，給患者和患者家庭都帶來(lái)了沉重的身體和精神負(fù)擔(dān)。國(guó)內(nèi)外研究者將目光轉(zhuǎn)移到了中藥上，從前人的智慧中汲取經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)藥通過(guò)扶正祛邪辨證論治，在白血病的治療上取得了確切的療效[2]。異葉敗醬是中藥墓頭回的藥源植物之一[3]，臨床用藥也證實(shí)了墓頭回對(duì)于白血病的控制作用[4]。本研究將異葉敗醬粗提物和其中3個(gè)環(huán)烯醚萜類單體化合物按照不同濃度配比與人早幼粒白血病細(xì)胞（HL-60）、人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（K562）、人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞（Jurkat）共同培養(yǎng)，以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)CCK-8法評(píng)價(jià)異葉敗醬提取物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，并初步探討化合物3對(duì)K562細(xì)胞的凋亡和周期的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人早幼粒白血病細(xì)胞（HL-60）、人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（K562）、人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞（Jurkat），以上三株細(xì)胞均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

異葉敗醬[2014年采于河南省，經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院劉萍主任藥師鑒定為異葉敗醬（Patrinia heterophylla Bunge）全草]；順鉑（齊魯制藥有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

YT-CJ-1ND超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆技術(shù)有限公司）；MCO-15ACCO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；DT5-2離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；酶標(biāo)儀（1420-012）（美國(guó)Perkin Elmer公司）；ECLIPSE TS100顯微鏡（日本Nikon公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.4 主要試劑

石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇等分析純?cè)噭▏?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（FBS，美國(guó)HyClone公司）；二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司）；CCK-8試劑盒（Biosharp生物科技公司）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 墓頭回粗提物和單體化合物的制備

將干燥的異葉敗醬全草粉碎，乙醇加熱50 ℃回流提取。提取液過(guò)濾，減壓濃縮，得到異葉敗醬總提取物浸膏。將上述浸膏懸浮在蒸餾水中，依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。收集有機(jī)相并減壓濃縮，得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位浸膏。將乙酸乙酯萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相，梯度洗脫，得到餾分Y-1 ～ Y-95，合并餾分Y-12 ～ Y-15（氯仿 : 甲醇 = 30 : 1），以石油醚 : 丙酮（3 : 1）等度洗脫得化合物1；合并餾分Y-16 ～ Y-18（氯仿 : 甲醇 = 30 : 1），以石油醚 : 丙酮（3 : 1）等度洗脫得到化合物2和化合物3。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-60、K562、Jurkat三株細(xì)胞均在15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，1 ～ 2 d傳代一次。

2.3 溶液系統(tǒng)的配制

分別稱取異葉敗醬不同部位浸膏，加入DMSO溶液，使浸膏充分溶解，得到濃度為104μg·mL-1的粗提物溶液。加入完全培養(yǎng)基按比例稀釋，在超凈臺(tái)中用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，得到粗提物濃度從低到高依次為10、20、40、80、100 μg·mL-1的溶液。單體化合物溶液的配制同上。

2.4 異葉敗醬對(duì)白血病細(xì)胞體外增殖的作用

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60、K562、Jurkat三株細(xì)胞按照5000個(gè)/孔的數(shù)量分別接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液50 μL。恒溫培養(yǎng)24 h后分別加入濃度為10、20、40、80、100 μg·mL-1的粗提物、單體化合物溶液及順鉑溶液50 μL。每株細(xì)胞均設(shè)置空白對(duì)照，空白對(duì)照組加入50 μL完全培養(yǎng)基，每組濃度梯度設(shè)置5個(gè)平行副孔。給藥后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，輕輕振搖，使CCK-8溶液與細(xì)胞懸液充分混合。1 ～ 2 h（每株細(xì)胞時(shí)間略有差異）后在450 nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算抑制率和IC50。

2.5 化合物3對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照1× 105的細(xì)胞數(shù)量接種于六孔板中，每孔2 mL，保證每孔細(xì)胞數(shù)目均等。分別在六個(gè)孔中加入完全培養(yǎng)液以及“2.3”項(xiàng)下配制好的化合物3溶液，使六孔板中每孔培養(yǎng)液中含有化合物3的的終濃度依次為0、10、20、40 μg·mL-1。將六孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，48 h后終止給藥。

離心收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次后懸浮于500 μL Binding Buffer中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide染色，避光反應(yīng)，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

2.6 化合物3對(duì)K562細(xì)胞周期的影響

按“2.5”項(xiàng)下方法收集細(xì)胞后，制備細(xì)胞濃度為1×106·mL-1的單細(xì)胞懸液，4 ℃條件下用70%乙醇固定8 h，洗去固定液后加入100 μL RNase A溶液，37 ℃水浴30 min后用400 μL PI染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以（x± s ）表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和Dunnett-t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 異葉敗醬對(duì)白血病細(xì)胞的體外抑制作用

3.1.1 異葉敗醬粗提物對(duì)白血病細(xì)胞的抑制作用 給予細(xì)胞不同濃度的粗提物刺激后，不同細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制。氯仿、乙酸乙酯、水三部分對(duì)于HL-60、K562、Jurkat細(xì)胞的抑制作用較為明顯，且這三部分對(duì)于細(xì)胞的抑制率均隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)。細(xì)胞受到的抑制作用以IC50表示，詳見(jiàn)表1。

表1 異葉敗醬不同部位粗提物對(duì)白血病細(xì)胞的IC50. μg·mL-1, n = 5Tab 1 IC50of different extracts from Patrinia heterophylla Bunge. μg·mL-1, n = 5

3.1.2 單體化合物對(duì)白血病細(xì)胞的抑制作用 通過(guò)以上測(cè)試結(jié)果分析，以抗腫瘤藥物順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照，化合物2、3對(duì)HL-60、K562、Jurkat三株細(xì)胞均表現(xiàn)出了明顯的毒性抑制作用，尤其是化合物3對(duì)K562細(xì)胞株的抑制作用優(yōu)于陽(yáng)性藥物順鉑。其它化合物對(duì)三株白血病細(xì)胞表現(xiàn)出不同的抑制作用，其中化合物1對(duì)HL-60細(xì)胞具有一定的抑制作用。同時(shí)，化合物對(duì)白血病細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性。細(xì)胞受到的抑制作用以IC50表示，詳見(jiàn)表2。

表2 異葉敗醬不同單體化合物對(duì)白血病細(xì)胞的IC50. μg·mL-1, n = 5Tab 2 IC50of different compounds from Patrinia heterophylla Bunge. μg·mL-1, n = 5

3.2 化合物3對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

當(dāng)不同濃度的化合物3作用于K562細(xì)胞48 h后，K562細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，早期凋亡率與化合物3濃度為0 μg·mL-1（對(duì)照組）相比具有顯著性差異（P ＜ 0.01），詳見(jiàn)表3。

表3 K562細(xì)胞在化合物3作用下的凋亡情況Tab 3 Apoptosis of K562 cells in the action of compound 3

3.3 化合物3對(duì)K562細(xì)胞周期的影響

加藥培養(yǎng)48 h后，K562細(xì)胞在不同濃度藥物作用下的G1期比例依次為42.34%、52.48%、59.48%、64.72%，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示化合物3可將K562細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯在G1期，與化合物3濃度為0 μg·mL-1（對(duì)照組）相比，差異具有顯著性（P ＜ 0.01），同時(shí)S期所占比例相應(yīng)降低。詳見(jiàn)表4。

表4 不同濃度化合物3作用下K562的細(xì)胞周期. n = 3Tab 4 Cell cycle of K562 cells in the action of compound 3. n = 3

4 討論

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，有毒中藥可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性等機(jī)制發(fā)揮抗白血病作用[5-6]。異葉敗醬作為墓頭回的藥源植物，在臨床治療白血病方面發(fā)揮了重要的作用。敗醬屬植物中含有環(huán)烯醚萜類成分，環(huán)烯醚萜是一類具有環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)的單萜小分子化合物，廣泛存在于龍膽科、木犀科、茜草科、玄參科等雙子葉植物中，有抗炎、抗腫瘤、抑制DNA合成的生物活性[7-8]。國(guó)內(nèi)外均可見(jiàn)環(huán)烯醚萜類成分抗腫瘤作用的報(bào)道[9-11]。程衛(wèi)東等[12]研究了墓頭回提取液對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響，認(rèn)為墓頭回對(duì)于K562細(xì)胞有顯著的抑制增殖作用，但此抑制作用是否因通過(guò)抑制酪氨酸激酶的活性產(chǎn)生，仍有待進(jìn)一步的研究。楊波等[13]研究了墓頭回中環(huán)烯醚萜酯對(duì)于小鼠S180肉瘤、H22肝癌的體內(nèi)抗腫瘤作用，認(rèn)為環(huán)烯醚萜酯類成分能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤微血管，這很可能是該類成分在體內(nèi)外發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8法研究了異葉敗醬粗提物以及其中3個(gè)環(huán)烯醚萜類化合物對(duì)于白血病細(xì)胞的體外毒性抑制作用，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了K562細(xì)胞在化合物3作用下的周期和凋亡變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異葉敗醬不同部位粗提物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制作用是不同的。除正丁醇部位外，其余部位均對(duì)HL-60細(xì)胞有明顯的抑制作用；乙酸乙酯部位和水部位對(duì)K562細(xì)胞毒性作用明顯；只有氯仿部位對(duì)Jurkat細(xì)胞有較好的毒性抑制作用，其余各部位對(duì)其效果并不顯著。而對(duì)于不同細(xì)胞來(lái)說(shuō)，各個(gè)部位對(duì)于細(xì)胞抑制率的平均值也是不相同的，HL-60細(xì)胞對(duì)異葉敗醬不同部位粗提物的作用比較敏感，受到的抑制作用最為明顯，K562次之，Jurkat細(xì)胞所受的抑制作用最弱。細(xì)胞所受毒性作用與藥物作用濃度表現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性。

單體化合物對(duì)于K562、HL60兩株細(xì)胞的抑制作用更為顯著，而對(duì)于Jurkat細(xì)胞的抑制作用并不理想。其中化合物3對(duì)K562的抑制作用優(yōu)于陽(yáng)性藥順鉑。進(jìn)一步研究表明，化合物3作用后，K562細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡比率都明顯上升，細(xì)胞增殖的進(jìn)程在G1期受到阻滯，體外增殖率降低。實(shí)驗(yàn)證明，一些化合物以及尚未進(jìn)行分離純化的部位具有很好的選擇性腫瘤細(xì)胞毒活性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于植物資源抗腫瘤中藥的研發(fā)具有一定的參考價(jià)值。但是中藥成分復(fù)雜，其藥效作用的發(fā)揮具有多靶點(diǎn)、多向調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，異葉敗醬化學(xué)成分抗腫瘤作用的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1] 肖志堅(jiān)，郝玉書(shū).白血病的診斷與分型現(xiàn)況[J].中華內(nèi)科雜志，2001，40（4）：275-278.

[2] 楊小娜，郭建美，姚海英，等.中醫(yī)藥治療白血病的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25（10）：1134-1137.

[3] 劉云召，石晉麗.墓頭回的本草考證[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39（2）：120-122.

[4] 張覃沐.國(guó)內(nèi)治療白血病藥物研究概況[J].新醫(yī)學(xué)，1978，9（2）：81-85.

[5] 賴蕓，陳子珺.有毒中藥抗白血病的作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中成藥，2016，38（4）：875-879.

[6] 梁宇光，蘇佳，董瑞華，等.苞葉香茶菜庚素誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系HL-60凋亡的分子機(jī)制研究[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2010，7（1）：12-16.

[7] 周長(zhǎng)波.環(huán)烯醚萜類化學(xué)成分的藥理研究綜述[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2016，16（64）：38.

[8] 賈詡.獨(dú)一味環(huán)烯醚萜苷對(duì)大鼠炎癥性腸病的治療作用及其機(jī)制研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2015.

[9] Abdullah FO, Hussain FH, Clericuzio M, et al. A new iridoid dimer and other constituents from the traditional kurdish plant Pterocephalus nestorianus Nábělek.[J]. Chem Biodivers, 2017, 14(3): e1600281-e1600288.

[10] 林玉.蜘蛛香環(huán)烯醚萜類抗肝癌作用及其機(jī)制初步研究[D].成都：西南交通大學(xué)，2015.

[11] 張寧寧，丁廣治.蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜類成分及其生物活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（10）：1893-1897.

[12] 程衛(wèi)東，李立.墓頭回提取物誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（1）：51-53.

[13] 楊波，王一奇，程汝濱，等.墓頭回環(huán)烯醚萜酯提取部位抗腫瘤作用及機(jī)制研究[J].中草藥，2013，44（20）：2884-2888.

Study on the inhibitory effect of extracts from Patrinia heterophylla Bunge on leukemic cells in vitro

LIU Li1,2, MU Li-hua2, LIU Ping2
(1. Shanxi University of Chinese Traditional Medicine, Taiyuan 030024, China; 2. Department of Clinical Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective: To study the inhibitory effect of extract from Patrinia heterophylla Bunge on the proliferation of leukemic cells in vitro. Methods: Isolated compounds were obtained from the whole plant Patrinia heterophylla Bunge through the means of chromatographic separation. The leukemic cells HL-60, K562 and Jurkat were cultured with different concentrations of extract from Patrinia extracts and compounds. CCK-8 assay was used to detect the inhibition of those extracts and compounds on human leukemic cell HL-60, K562 and Jurkat. And the effect of compound 3 on K562 cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. Results: Both extracts and monomeric compounds had a certain dosedependent inhibitory effect on the proliferation of leukemic cells. Different concentration of compound 3 could induce different degree of apoptosis of K562 cells. The early apoptosis rate was signif i cantly higher than that of the control group (P ＜ 0.01). The percentage of cells in G0/G1phase increased from 42.34% to 59.48% and 64.72%, which was signif i cantly different from that of the control group (P ＜ 0.01). Conclusion: The Patrinia heterophylla Bunge has obvious inhibitory effect on the proliferation of leukemic cells in vitro. Compound 3 can induce the apoptosis of K562 cells and block the cell cycle in G0/G1phase. The basis of antitumor pharmacological effects is likely to be related to the iridoid components.

Patrinia heterophylla Bunge; Leukaemia; Cell apoptosis; Iridoid

R96

A

1672 – 8157(2017)03 – 0150 – 04

2017-01-15

2017-03-17）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31000153）

劉屏，女，研究員，研究方向：中藥化學(xué)與中藥藥理。E-mail：liuping301@126.com

劉俐，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥活性成分篩選。E-mail：zliuli0227@126.com