陳素紅 鄒璞 廖景平

摘要 [目的]探討藍(lán)豬耳花粉管的最佳培養(yǎng)條件，為建立植物離體受精體系奠定基礎(chǔ)。[方法]采用離體培養(yǎng)技術(shù)，研究了藍(lán)豬耳花粉離體萌發(fā)和花粉管體外生長(zhǎng)的主要影響因素。[結(jié)果]藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基為：5.00%（V/V）蔗糖、0.01%（V/V）氯化鈣、0.01%（V/V）硼酸和0.01%（V/V）磷酸二氫鉀，其培養(yǎng)基的滲透壓主要靠蔗糖調(diào)節(jié)。[結(jié)論]硼是藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)中必不可少的微量元素；鈣對(duì)花粉管生長(zhǎng)起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，并推測(cè)鈣離子主要是通過(guò)電壓依賴(lài)型鈣通道進(jìn)入花粉管內(nèi)部。

關(guān)鍵詞 藍(lán)豬耳；花粉萌發(fā)；花粉管生長(zhǎng)；影響因素

中圖分類(lèi)號(hào) Q942.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）18-0011-04

Abstract [Objective] To explore the optimum culture conditions for the pollen tube of Torenia fournieri. [Method] Using the techniques of in vitro culture， the main influencing factors of pollen germination and pollen tubes growth in vitro of T. fournieri were studied. [Result] The suitable culture medium for pollen germination and pollen tubes growth in vitro of T. fournieri was as follows：5% （V/V） sucrose， 0.01% （V/V） CaCl2， 0.01% （V/V） boric acid and 0.01% （V/V） KH2PO4. The osmotic pressure of the medium was mainly regulated by sucrose. [Conclusion] Boron is an essential microelement in pollen germination of T. fournieri. Calcium plays an important role in pollen tubes growth. It is deduced that voltagedependent Ca2+ channels may be a main calcium influx pathway through which Ca2+ entered into pollen tube.

Key words Torenia fournieri；Pollen germination；Pollen tube growth；Influencing factors

花粉管在植物受精過(guò)程中起著傳遞、運(yùn)輸雄配子到達(dá)受精作用靶細(xì)胞區(qū)的作用，因此花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)是高等植物有性生殖過(guò)程的重要生理環(huán)節(jié)?；ǚ酃茏陨泶嬖凇白晕医M織調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”，使之具有極性生長(zhǎng)特性[1]。因此，花粉管常被作為植物細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、定向生長(zhǎng)、頂端或極性生長(zhǎng)、胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞骨架變化等研究的模式體系。

Ca2+ 是花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的核心調(diào)控因子，在囊泡的運(yùn)輸和融合、細(xì)胞骨架的組裝、細(xì)胞壁性狀等方面起調(diào)節(jié)作用[2]。關(guān)于花粉離體萌發(fā)的研究表明，花粉水合后萌發(fā)孔或萌發(fā)溝部位的鈣離子濃度升高，從而啟動(dòng)并促進(jìn)花粉萌發(fā)[3-5]?；ǚ酃艿纳L(zhǎng)對(duì)鈣的需求具有濃度效應(yīng)，只有適宜的外源鈣濃度才能促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)，鈣濃度過(guò)高或過(guò)低均抑制花粉管生長(zhǎng)。在花粉萌發(fā)孔和花粉管中存在從頂端至基部的鈣梯度[6-7]，尖端高濃度的鈣是胞外鈣經(jīng)活化的鈣通道內(nèi)流產(chǎn)生的，消除鈣梯度會(huì)抑制花粉管生長(zhǎng)[8]。鈣通道和鈣離子梯度等共同控制著花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)及其定向性。

硼對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)亦起促進(jìn)作用。細(xì)胞中大部分的硼位于細(xì)胞壁上，Blevins等[9]研究發(fā)現(xiàn)硼與果膠類(lèi)物質(zhì)GR-Ⅱ（鼠李半乳糖醛酸-Ⅱ）結(jié)合使酸性果膠變成酯化果膠。在花粉管中，酯化果膠集中在花粉管頂端，使頂端存在一定的延展性；酸性果膠遍及整個(gè)花粉管，使細(xì)胞壁有足夠的機(jī)械強(qiáng)度[10]。硼酸可防止酚類(lèi)物質(zhì)的積累，促進(jìn)花粉管的生長(zhǎng)[11]。

藍(lán)豬耳是玄參科（Scrophulariaceae）蝴蝶草屬（Torenia L.）植物，具有半裸露的胚囊結(jié)構(gòu)。研究者利用其獨(dú)特的胚囊特征，建立了藍(lán)豬耳花粉管定向生長(zhǎng)至胚囊的離體試驗(yàn)技術(shù)，首次驗(yàn)證了受精過(guò)程中助細(xì)胞是引導(dǎo)花粉管定向進(jìn)入胚囊的靶位點(diǎn)[12]。創(chuàng)建離體受精體系是研究高等植物有性生殖的熱點(diǎn)領(lǐng)域。藍(lán)豬耳是被子植物受精生物學(xué)研究的模式植物，研究藍(lán)豬耳花粉離體萌發(fā)和花粉管離體生長(zhǎng)的影響因素是建立藍(lán)豬耳離體受精體系的前提。筆者研究鈣和硼對(duì)藍(lán)豬耳花粉離體萌發(fā)和花粉管離體生長(zhǎng)的影響，探索花粉管的最佳培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藍(lán)豬耳種植在中國(guó)科學(xué)院華南植物園，每年4—12月開(kāi)花，6—10月為盛花期。藍(lán)豬耳是二強(qiáng)雄蕊，兩長(zhǎng)花絲上的花藥在柱頭上方，自花、異花授粉都能受精、結(jié)實(shí)。當(dāng)開(kāi)花后2 d，花藥有開(kāi)裂，取柱頭上的兩枚花藥，用于花粉離體萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

花粉萌發(fā)的培養(yǎng)液基本成分包括：磷酸二氫鉀、氯化鈣、硼酸和蔗糖?；ǚ酃芘囵B(yǎng)基配制方法如下：①蔗糖濃度梯度設(shè)置為3%、5%、7%、10%和15%（V/V），磷酸二氫鉀、氯化鈣和硼酸濃度均為0.01%（V/V），確定花粉萌發(fā)率最高時(shí)蔗糖的濃度（即蔗糖最佳濃度）；②當(dāng)蔗糖為最佳濃度，磷酸二氫鉀濃度為0.01%（V/V）時(shí)，Ca2+ 和H3BO3濃度梯度分別為0、0.001%、0.010%和0.100%（V/V）。

在培養(yǎng)皿中用凡士林制出若干個(gè)小室，將花粉萌發(fā)培養(yǎng)液放于其中，用微針從花藥中挑取花粉灑入培養(yǎng)液中，花粉要均勻遍及液體表面，然后將培養(yǎng)皿置于黑暗、22 ℃恒溫條件下萌發(fā)。分別在花粉培養(yǎng)1和3 h，取出培養(yǎng)皿在倒置顯微鏡下觀察，每1微室取6個(gè)視野，每個(gè)視野的花粉粒達(dá)30粒以上；每種培養(yǎng)液重復(fù)3次，取萌發(fā)率平均值?；ǚ勖劝l(fā)以花粉管長(zhǎng)度大于或等于萌發(fā)孔直徑為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

硝苯吡啶（Nif）、Al3+、La3+為鈣通道抑制劑。在上述花粉萌發(fā)最好的培養(yǎng)液中加入有機(jī)抑制劑硝苯吡啶和無(wú)機(jī)抑制劑氯化鋁、氯化鑭，在倒置顯微鏡下觀察不同濃度不同鈣通道抑制劑培養(yǎng)液中花粉管萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度。同時(shí)，對(duì)50 μmol/L硝苯吡啶培養(yǎng)液中生長(zhǎng)3 h的花粉管拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)豬耳花粉的離體萌發(fā)

藍(lán)豬耳的花粉需要在含少量糖的培養(yǎng)基上才能較好的萌發(fā)?；ǚ叟囵B(yǎng)1 h時(shí)，5個(gè)濃度的蔗糖培養(yǎng)液中花粉萌發(fā)率都不高，花粉正處于剛開(kāi)始萌發(fā)階段，彼此之間萌發(fā)率相差不大；花粉培養(yǎng)3 h時(shí)，在5%的蔗糖培養(yǎng)液中，花粉萌發(fā)率達(dá)最高，而在3%和7%的蔗糖培養(yǎng)液中，萌發(fā)率也比較高，與5%的相差不大，隨著蔗糖濃度的升高，萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)（表1）。這表明蔗糖濃度5%為藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)的最佳濃度。

確定最佳蔗糖濃度后，改變鈣和硼的濃度研究二者對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響。

當(dāng)藍(lán)豬耳花粉離體培養(yǎng)1 h，在無(wú)鈣條件下，隨硼濃度的升高，花粉萌發(fā)率逐漸升高，當(dāng)硼濃度為0.010%時(shí)，花粉萌發(fā)率達(dá)最高，然后隨硼濃度的繼續(xù)升高，花粉萌發(fā)率反而下降；在無(wú)硼條件下，改變鈣的濃度，花粉萌發(fā)率都很低；同時(shí)，在無(wú)鈣無(wú)硼條件下，花粉萌發(fā)率相當(dāng)?shù)?。從花粉離體培養(yǎng)1 h的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在無(wú)鈣且硼酸濃度為0.010%時(shí)，花粉萌發(fā)率最高，達(dá)40.8%（表2）。

當(dāng)藍(lán)豬耳花粉離體培養(yǎng)3 h，在無(wú)鈣條件下，當(dāng)硼濃度小于0.010%時(shí)，隨著硼濃度的升高，花粉萌發(fā)率驟升，直到硼濃度為0.010%，萌發(fā)率達(dá)到最大值（86.0%），然后隨著硼濃度的繼續(xù)增加，萌發(fā)率開(kāi)始降低；在無(wú)硼條件下，雖然有鈣加入，但萌發(fā)率仍然不高，當(dāng)鈣濃度為0.001%時(shí)，萌發(fā)率最高（37.3%），然而在無(wú)硼、無(wú)鈣條件下，花粉萌發(fā)率仍然很低，只有9.7%。同時(shí)改變鈣和硼的濃度，當(dāng)鈣和硼濃度均為0.010%時(shí)，花粉萌發(fā)率最高，達(dá)91.7%（表3）。

以上結(jié)果表明，藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)時(shí)可不需要外源鈣，但高鈣會(huì)抑制花粉的萌發(fā)；硼在花粉萌發(fā)時(shí)起重要的作用，是花粉萌發(fā)必不可少的微量元素。

2.2 鈣通道抑制劑對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響

在含有鈣通道無(wú)機(jī)抑制劑（3價(jià)陽(yáng)離子）的培養(yǎng)基中，藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)率比對(duì)照稍低，花粉管長(zhǎng)度低于對(duì)照水平（圖1）。抑制劑對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的抑制效果與其濃度密切相關(guān)，分別加入10、20、50、100 μmol/L 的氯化鋁和氯化鑭處理后，花粉萌發(fā)率受影響不大，在體外培養(yǎng)3 h，萌發(fā)率在70%左右。然而，鈣通道無(wú)機(jī)抑制劑對(duì)花粉管生長(zhǎng)的抑制效果較明顯，濃度越高，培養(yǎng)3 h的花粉管長(zhǎng)度就越短；將氯化鋁和氯化鑭2種抑制劑進(jìn)行比較，鋁抑制花粉管生長(zhǎng)的效果比鑭明顯。

在含有鈣通道有機(jī)抑制劑硝苯吡啶的培養(yǎng)基中，藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)率低于對(duì)照，花粉管長(zhǎng)度明顯低于對(duì)照水平（圖2）。抑制劑對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的抑制效果與其濃度密切相關(guān)，分別加入1、10、50、100 μmol/L 的硝苯吡啶處理后，花粉萌發(fā)率雖然比對(duì)照的降低較多，但在體外培養(yǎng)3 h，萌發(fā)率仍達(dá)60%以上。然而，鈣通道有機(jī)抑制劑對(duì)花粉管生長(zhǎng)的抑制效果很明顯，當(dāng)加入1 μmol/L 的硝苯吡啶時(shí)，培養(yǎng)3 h的花粉管長(zhǎng)度只有對(duì)照的1/3。硝苯吡啶濃度越高，花粉管長(zhǎng)度越短。當(dāng)硝苯吡啶濃度為100 μmol/L時(shí)，花粉管長(zhǎng)度僅有（29.25±10.97）μm。這表明有機(jī)抑制劑對(duì)藍(lán)豬耳花粉管生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)。

2.3 硝苯吡啶對(duì)藍(lán)豬耳花粉管形態(tài)的影響

定時(shí)觀察花粉管的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)藍(lán)豬耳花粉管在適宜的培養(yǎng)液中形態(tài)正常。當(dāng)10 μmol/L硝苯吡啶處理時(shí)，在抑制花粉管生長(zhǎng)的同時(shí)，還導(dǎo)致花粉管形態(tài)異常。其形態(tài)異常主要表現(xiàn)為：萌發(fā)孔處破裂，溢出花粉內(nèi)含物；花粉管扭曲，螺旋生長(zhǎng)；花粉管分枝生長(zhǎng)，其中有的分叉出現(xiàn)在基部，有的在生長(zhǎng)一段時(shí)間后在頂部出現(xiàn)分叉（圖3）。

3 討論與結(jié)論

從花粉離體萌發(fā)所需培養(yǎng)基來(lái)看，不同植物對(duì)培養(yǎng)基成分的要求不同[13]。藍(lán)豬耳花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基需要恰當(dāng)平衡的鹽/糖、適宜的鈣和硼。目前，大量研究表明硼對(duì)花粉的萌發(fā)有促進(jìn)作用，硼作為Ca2+誘導(dǎo)劑引導(dǎo)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度以促進(jìn)花粉萌發(fā)，對(duì)花粉管的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的影響[5]。在藍(lán)豬耳花粉離體萌發(fā)中，硼的需求顯得格外重要，在無(wú)硼的培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率相當(dāng)?shù)停蝗欢?，外源鈣的影響顯得不甚明顯。一般認(rèn)為，花粉內(nèi)存在較多的鈣，而缺乏硼，因此萌發(fā)時(shí)胞外鈣對(duì)萌發(fā)率的影響不如硼顯著[14]。藍(lán)豬耳花粉中的鈣量足以滿(mǎn)足花粉萌發(fā)，而硼則需要外援。雖然硼和鈣在花粉萌發(fā)中的作用被一致認(rèn)為是2個(gè)相當(dāng)獨(dú)立的過(guò)程，但是在藍(lán)豬耳花粉離體萌發(fā)試驗(yàn)中雙向調(diào)節(jié)硼和鈣的濃度，發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)所需的最佳鈣和硼濃度是一致的，表明二者是協(xié)同促進(jìn)花粉萌發(fā)。

鈣離子參與花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中的許多調(diào)節(jié)過(guò)程，外源鈣濃度可能通過(guò)花粉管上的鈣通道調(diào)節(jié)花粉管內(nèi)的鈣動(dòng)態(tài)影響花粉管的生長(zhǎng)，尤其是在花粉管的極性、頂端的定向生長(zhǎng)過(guò)程中，鈣過(guò)高，牽拉型的鈣通道受到傷害，致使花粉管生長(zhǎng)受到抑制[3，15]。筆者通過(guò)采用一些常用的鈣通道抑制劑處理花粉，觀察它們對(duì)花粉萌發(fā)率的影響不是很明顯，表明在藍(lán)豬耳花粉中存在足夠的鈣作用于花粉萌發(fā)過(guò)程。然而，花粉培養(yǎng)3 h后，觀察發(fā)現(xiàn)抑制劑對(duì)花粉管的生長(zhǎng)產(chǎn)生了強(qiáng)烈抑制作用。據(jù)此推測(cè)，在藍(lán)豬耳花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中，外援鈣主要通過(guò)對(duì)這些抑制劑敏感的鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，由于這些抑制劑主要作用于電壓依賴(lài)的鈣通道，所以電壓依賴(lài)鈣通道很可能是花粉管生長(zhǎng)中從體外環(huán)境中吸收鈣離子的重要途徑。Véry等[16]在研究擬南芥根毛伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中參與鈣離子內(nèi)流的鈣通道時(shí)指出，鈣離子是通過(guò)超級(jí)化激活的電壓依賴(lài)型鈣通道進(jìn)入根毛細(xì)胞內(nèi)部的。根毛的生長(zhǎng)與花粉管存在相似之處，因此推測(cè)在花粉管生長(zhǎng)的過(guò)程中，類(lèi)似的鈣通道很可能同樣發(fā)揮重要作用。該試驗(yàn)結(jié)果表明，鈣通道對(duì)2種無(wú)機(jī)抑制劑氯化鋁和氯化鑭較為敏感，尤其對(duì)L-型鈣通道抑制劑硝苯吡啶表現(xiàn)出更高的敏感性。因此，推測(cè)藍(lán)豬耳花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中，參與鈣離子吸收的鈣通道可能和根毛的類(lèi)似。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)對(duì)培養(yǎng)基的滲透壓有特殊的要求，主要靠蔗糖來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓；硼是藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)中必不可少的微量元素；鈣對(duì)花粉管生長(zhǎng)起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，并推測(cè)鈣離子主要是通過(guò)電壓依賴(lài)型鈣通道進(jìn)入花粉管內(nèi)部。

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