周桂林 劉奇燕 范家萌

摘要 [目的]建立高效SSR分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)體系，加快抗稻瘟病育種進(jìn)程，并為促進(jìn)、推廣SSR分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在企業(yè)育種科研上的應(yīng)用提供方法。[方法]采用田間葉片快速DNA提取技術(shù)、抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2連鎖標(biāo)記MRG4766和AP22的兩重PCR技術(shù)及兩道聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)抗稻瘟病育種群體

進(jìn)行高效分子標(biāo)記輔助選擇。[結(jié)果]建立了一種成本低、操作簡(jiǎn)單、能夠?qū)沟疚敛‰p基因Pi-1和Pi-2進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷、規(guī)?；瘷z測(cè)的方法。[結(jié)論]該技術(shù)體系可對(duì)抗稻瘟病育種群體進(jìn)行高效分子標(biāo)記輔助選擇，加快抗稻瘟病育種進(jìn)程，為SSR分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在企業(yè)育種科研上的廣泛應(yīng)用提供了借鑒方法。

關(guān)鍵詞 分子標(biāo)記輔助選擇；抗稻瘟?。籇NA快速提??；兩重PCR

中圖分類號(hào) S503.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）18-0115-03

Abstract [Objective] Exploring highefficient detection technology system of SSR molecular markers，to accelerate the process of rice blast resistance breeding and provide a new way of promoting and popularizing the markerassistant selection technology in enterprise field.[Method] The DNAs of leaves in field were extracted by rapid method，twofold PCR and twoline polyacrylamide gel electrophoresis with primers MRG4766 and AP22 were used to select breeding population.[Result] An technology system with less cost and simple operation was set up to fast detect rice blast resistant genes Pi1 and Pi2 accurately and stably on a large scale.[Conclusion] By the technology system，highefficient markerassistant selection to the blast resistant breeding population can be achieved to quicken the breeding process，and then popularize markerassistant selection technology in enterprise field.

Key words Markerassistant selection；Rice blast resistance；DNA fast extraction；Twofold PCR

稻瘟病是全球性的毀滅性水稻病害之一，全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失為 11%～30%，給糧食安全造成隱患[1-2]。但由于稻瘟病菌小種的遺傳復(fù)雜性及易變性，推廣品種稻瘟病抗性周期短已經(jīng)成為水稻生產(chǎn)的主要障礙之一，通過分子標(biāo)記輔助選擇（Markerassisted selection，MAS）技術(shù)，將多個(gè)抗病基因聚合到一個(gè)水稻品種中，培育具有廣譜、持久抗性的水稻新品種，以延長(zhǎng)品種的抗病周期，是當(dāng)前有效的措施之一[3-5]。

來源于西非粳稻品種 LAC23 的 Pi-1和哥倫比亞秈稻品種 5173 的Pi-2 基因是2個(gè)顯性廣譜高抗稻瘟病基因[6-7]。LIU等[8]、陳志偉等[9]分別發(fā)展了與Pi-1連鎖的SSR 標(biāo)記RM144和 MRG4766，遺傳距離分別為6.8 cm和1.3 cm；WU等[10]開發(fā)了與 Pi-2 緊密連鎖的 SSR 標(biāo)記 AP22，遺傳距離為1.3 cm。這些以 PCR 為基礎(chǔ)、操作簡(jiǎn)便、多態(tài)性豐富的 SSR 標(biāo)記開發(fā)，為Pi-1和Pi-2 基因的分子標(biāo)記輔助選擇提供了理想的條件。然而，常規(guī)的分子標(biāo)記檢測(cè)程序復(fù)雜，效率低，成本相對(duì)較高，難以大范圍、規(guī)?；剡\(yùn)用到商業(yè)化育種程序中去，因而在國(guó)內(nèi)中小種子企業(yè)育種科研上的推廣應(yīng)用力度還較小。

筆者摸索、建立了一種在水稻抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種過程中，能夠?qū)沟疚敛‰p基因Pi-1和Pi-2進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷、規(guī)?；瘷z測(cè)的方法，以期加快抗稻瘟病育種進(jìn)程，并促進(jìn)SSR分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在水稻育種科研上的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。用于抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種的供體材料同時(shí)含有抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2，編號(hào)為RBR1-2，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)陳慶全教授提供，受體材料為合肥豐樂種業(yè)股份有限公司提供的優(yōu)質(zhì)不育系廣占63S或恢復(fù)系R2106。通過回交育種技術(shù)手段培育抗稻瘟病的不育系廣占63S或恢復(fù)系R2106，并檢測(cè)每個(gè)雜交及回交世代育種群體的抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的基因型。

1.1.2 主要試劑。引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)中心；DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；磁珠法DNA提取試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)春志昂生物科技公司；NaOH、Tris等化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器。MyCler PCR儀由美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)，Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析儀由美國(guó)熱電公司生產(chǎn)，DYCZ-20C垂直電泳槽由北京六一公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2連鎖標(biāo)記在供體與受體親本間的多態(tài)性分析。利用磁珠法試劑盒提取抗稻瘟病基因供體材料RBR1-2，以及受體材料廣占63s和R2106的基因組DNA；分別用連鎖標(biāo)記MRG4766和AP22檢測(cè)抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的標(biāo)記基因型及其多態(tài)性。

1.2.2 育種群體高效分子標(biāo)記檢測(cè)。

1.2.2.1 DNA快速提取及質(zhì)量檢測(cè)。每個(gè)單株的葉片取1.0 cm×1.0 cm大小的樣品，放入96孔PCR管中，加入0.2 mol/L的NaOH溶液40 μL，在沸水中煮2 min，然后加入0.2 mol/L Tris-HCl溶液60 μL，在沸水中煮沸2 min后置冰上冷卻，取1 μL提取液供PCR擴(kuò)增反應(yīng)或4 ℃下保存。用Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA的濃度及質(zhì)量，隨后比較磁珠法提取DNA與快提法提取DNA在隨機(jī)選擇的12個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)上擴(kuò)增譜帶。

1.2.2.2 兩重PCR擴(kuò)增。采用10 μL的PCR反應(yīng)體系，即在PCR反應(yīng)管中分別加入樣品DNA提取液（1.0 μL）、10×Buffer（1.0 μL）、dNTP（0.9 μL）、Pi-1檢測(cè)引物MRG4766（0.5 μL），Pi-2檢測(cè)引物AP22（0.5 μL）、ddH2O（6.0 μL）和Taq酶（0.1 μL）；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋合?4 ℃預(yù)變性2 min；再94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，加入6×Loading Buffer 終止反應(yīng)，置4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 產(chǎn)物兩道電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用4%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用100孔密型點(diǎn)樣梳一次性點(diǎn)樣96孔PCR板上的96個(gè)樣品；在2 000 V、85 W條件下，電泳15 min后，點(diǎn)樣另外96個(gè)樣品；繼續(xù)電泳25 min后，染色、顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2連鎖標(biāo)記在供體與受體親本間的多態(tài)性分析結(jié)果 由圖1a、b可知，磁珠法提取的親本DNA濃度在20～30 ng/μL，質(zhì)量較高，OD260/OD280在2.0左右，滿足PCR擴(kuò)增要求；抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2的供體與受體在連鎖標(biāo)記MRG4766和AP22上的擴(kuò)增譜帶清晰，且具有多態(tài)性（圖2，每個(gè)品種3個(gè)重復(fù)），說明MRG4766和AP22可用于抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種。

2.2 育種群體快速DNA提取模板濃度及質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 快速法提取的基因組DNA的質(zhì)量（OD260/OD280<1.8）低于磁珠法提取DNA的質(zhì)量，但其濃度與磁珠法提取DNA濃度差異較小，且其在10對(duì)SSR引物上的擴(kuò)增譜帶清晰，與磁珠法提取DNA的擴(kuò)增效果相比，除略淺之外，擴(kuò)增結(jié)果一致（圖3），說明快速法提取的DNA質(zhì)量及濃度滿足一般PCR擴(kuò)增要求。

2.3 育種群體在Pi-1和Pi-2連鎖標(biāo)記上基因型分析結(jié)果 快速法提取96×2=192個(gè)樣品的DNA后，經(jīng)過兩重PCR和兩道聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，譜帶清晰、易判讀，且基因型分離情況與育種群體世代相吻合，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。圖4為育種群體BC3F3世代6個(gè)株系（K133、K134、K135、K156、K157、K158）在MRG4766和AP22上的電泳圖譜，結(jié)果表明，K133株系未導(dǎo)入供體抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2；K134株系未導(dǎo)入抗稻瘟病基因Pi-1，但在Pi-2基因型分離；K135株系基本未導(dǎo)入Pi-2，但在Pi-1基因型分離；K156、K157、K158這3個(gè)株系在Pi-1、Pi-2均基因型分離；此外，也存在純合導(dǎo)入供體抗稻瘟病基因Pi-1或/和Pi-2的株系。

3 結(jié)論與討論

常規(guī)的SSR分子標(biāo)記檢測(cè)程序中，DNA提取通常采用簡(jiǎn)易CTAB法或SDS法，過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，即使采用磁珠法或柱式法等試劑盒法提取DNA，也同樣需要提前進(jìn)行樣品研磨，成本相對(duì)較高，而效率較低；此外，一般的單重PCR和單道聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖電泳，檢測(cè)大樣本多位點(diǎn)的效率也很低。因此，對(duì)于大的育種群體而言，采用常規(guī)SSR分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，其標(biāo)記基因型的檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，成本也相對(duì)較高，因而難以大范圍、規(guī)?；剡\(yùn)用于商業(yè)化的育種程序中，尤其難以推廣應(yīng)用于國(guó)內(nèi)中小種子企業(yè)的育種科研中。

該文研究了育種群體田間葉片快速DNA提取技術(shù)，以及抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2連鎖標(biāo)記MRG4766和AP22的兩重PCR及兩道聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，結(jié)果表明，采用該技術(shù)體系提高了檢測(cè)效率、降低了成本，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能在水稻抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種過程中，對(duì)抗稻瘟病雙基因Pi-1和Pi-2進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷、規(guī)?；臋z測(cè)。應(yīng)用該技術(shù)體系，經(jīng)過3年的分子標(biāo)記輔助回交育種，成功改良了合肥豐樂種業(yè)股份有限公司不育系廣占63S和恢復(fù)系R2106的稻瘟病抗性，且不需要每個(gè)世代均進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，從而加快了該公司抗稻瘟病育種進(jìn)程，并顯著降低了成本?？傊?，該技術(shù)體系為促進(jìn)、推廣SSR分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在企業(yè)育種科研上的應(yīng)用提供了一個(gè)新方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙二生，玉洪昊，張波.水稻稻瘟病抗病性育種研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2012（8）：18-20.

[2] 何秀英，廖耀平，陳釗明，等.水稻稻瘟病抗病育種研究進(jìn)展與展望[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（1）：30-33.

[3] 佚名.日本抗稻瘟病育種[J].上海農(nóng)業(yè)科技，1978（S3）：46-51.

[4] 伍尚忠，朱小源，劉斌，等.秈稻品種三黃占2號(hào)的稻瘟病持久抗性評(píng)價(jià)與遺傳分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（4）：528-534.

[5] 郭震華，劉傳雪，張?zhí)m民，等.分子標(biāo)記輔助選擇在水稻抗稻瘟病育種中的研究進(jìn)展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（2）：135-139.

[6] YU Z H，MACKILL D J，BONMAN J M，et al.Molecular mapping of genes for resistance to rice blast （Pyricularia grisea Sacc.）[J].Theor Appl Genet，1996，93（5）：859-863.

[7] YU Z H，MACKILL D J，BONMAN J M，et al.Tagging genes for blast resistance in rice via linkage to RFLP markers[J]. Theor Appl Genet，1991，81（4）：471-476.

[8] LIU S P，LI X，WANG Z Y et al.Improvement of resistance to rice blast in Zhenshan 97 by molecular markeraided selection[J].Acta Bot Sin，2003，45（11）：1346-1350.

[9] 陳志偉，官華忠，吳為人，等.稻瘟病抗性基因Pi-1連鎖SSR標(biāo)記的篩選和應(yīng)用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，34（1）：74-77.

[10] WU J H，JIANG J S，CHEN H L，et al. Fine mapping of rice blast resistance gene Pi-2（t）[J].Acta Agron Sin，2002，28（4）：505-509.