孫易，丁樹哲

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體結(jié)構(gòu)偶聯(lián)及運動應激研究進展

孫易1，2，丁樹哲1，2

諸多生命活動依賴于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的協(xié)作。MAMs是存在于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間，由蛋白質(zhì)復合體組成的特殊結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)的完整性和生理功能的正常運行是保證線粒體動態(tài)變化、細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等生命過程有序進行的前提。對MAMs的最新研究動態(tài)進行歸納，提出Ca2+在MAMs調(diào)控中的決定性作用，MAMs在ROS、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞凋亡、細胞自噬、線粒體動態(tài)變化及流動性和炎癥等過程中扮演的重要角色，探討運動應激對MAMs的可能調(diào)節(jié)機制及MAMs相關(guān)分子介導運動適應的途徑，從而為未來運動適應機制的探索提供新的研究方向。

線粒體；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；MAMs；運動應激；Ca2+

膜包裹細胞器的出現(xiàn)標志著物種進化進入新的時代，不同屬性的生化反應得以在相對隔離的微環(huán)境中進行。與此同時，為了保障生命活動和分子反應的正常運行，牟定在細胞器間的固態(tài)連接網(wǎng)絡(luò)（physical contact）衍生而來，以利于代謝底物和生物信號在細胞器間半自由傳遞。固態(tài)連接網(wǎng)絡(luò)同時肩負著細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)控細胞器動態(tài)變化等重任。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細胞器間協(xié)作中的中心地位

存在于相鄰細胞器間的并由兩部分細胞器膜組成的特殊結(jié)構(gòu)稱作膜連接部位（MCSs，membrane contact sites）［14］。MCSs具有以下4個特點：1）兩種細胞器膜間距一般小于30 nm；2）膜互不融合：3）某些蛋白和脂質(zhì)在MCSs處格外豐富匯聚，充當系帶（tether）的作用；4）MCSs的特有結(jié)構(gòu)影響兩細胞器中至少1種的結(jié)構(gòu)或功能［42］。

作為細胞內(nèi)延展范圍最廣的膜結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與絕大多數(shù)細胞器及細胞結(jié)構(gòu)均需通過MCSs協(xié)同工作，如，線粒體［27］、溶酶體、高爾基體、內(nèi)涵體和細胞膜等［56］。人們最早意識到MCSs的顯著功能是充當Ca2+傳遞和脂質(zhì)交換的重要場所［57］。Ca2+在細胞內(nèi)高度活躍，可以充當多條信號通路的調(diào)控點。Ca2+失調(diào)或局部異常堆積會引起信號轉(zhuǎn)導失調(diào)，甚至造成細胞鈣毒性；而脂質(zhì)擴散受限則破壞細胞器膜結(jié)構(gòu)的完整性，對細胞生存帶來威脅。然而，擴散的不隨意性是Ca2+和脂質(zhì)的共同特點，其中，Ca2+需與某些受體分子結(jié)合方能在胞內(nèi)穿梭，而脂質(zhì)擴散則受限于其與細胞水性結(jié)構(gòu)的不相容性。MCSs的存在使Ca2+和脂質(zhì)的細胞器間傳遞成為可能。作為Ca2+和脂質(zhì)貯存的主要場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無疑是此領(lǐng)域研究的最大熱點。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的結(jié)構(gòu)及功能

除了膜連接外，線粒體的出現(xiàn)是物種進化中的另一轉(zhuǎn)折點。盡管多種學說各有千秋，然而眾多線索指向內(nèi)共生學說，即線粒體來源于細菌，被真核生物吞噬的細菌經(jīng)過漫長的演化和適應最終形成線粒體，以適應地球大氣中高氧環(huán)境的出現(xiàn)。在產(chǎn)生能量之余，線粒體還參與類固醇合成、凋亡信號傳導、鈣信號傳遞等生物過程。線粒體在物質(zhì)代謝調(diào)控和信號整合中發(fā)揮的作用很大程度上是通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合作得以實現(xiàn)的。

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的結(jié)構(gòu)

盡管在數(shù)十年前，已有學者提出線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間存在固態(tài)連接這一假說，然而直到1969年，Ruby等才通過電子顯微鏡實際觀察到此結(jié)構(gòu)［46］。充當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間系帶的蛋白復合體MAMs（mitohcondria associated membrane）則依賴于細胞片段化分離技術(shù)，直到20世紀90年代才得以確認［58］。目前學界對MAMs的普遍定義是：與線粒體緊密連接的，可以被純化為獨立結(jié)構(gòu)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。繼線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分別在19世紀及20世紀中葉被發(fā)現(xiàn)并取得關(guān)注以來，MAMs結(jié)構(gòu)的成功分離純化無疑為亞細胞層面的研究注入了新的活力，相關(guān)探索在過去20年呈現(xiàn)蓬勃上升趨勢。MAMs是一種對細胞生理環(huán)境高度敏感的動態(tài)結(jié)構(gòu)，這導致其結(jié)構(gòu)具有一過性和多變性的特點。MAMs扮演的多種角色與其獨特的脂質(zhì)和蛋白組成有關(guān)。當前已知的有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)（以下簡稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體）參與調(diào)控的細胞過程和功能主要包括ROS、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞凋亡、細胞自噬、線粒體動態(tài)變化及流動性和炎癥等。

2.1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的構(gòu)成

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體系帶最早在卡氏棘阿米巴，一種非光合作用的單細胞真核生物中被觀察到。盡管MAMs的構(gòu)成在各物種間不盡相同，然而，其功能卻具有高度保守性。隨著技術(shù)手段的進步，酵母細胞中MAMs的蛋白構(gòu)成ERMES得以確定。ERMES（ER-mitochondria encounter structure）由Mmm1、Mdm10、Mdm12和Mdm34 4種蛋白組合而成，且復合體中的任一組件對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體系帶的維持都是必不可少的［35］。線粒體似乎對ERMES結(jié)構(gòu)完整性格外敏感，當組件缺失時，線粒體會受損并發(fā)生片段化。

與酵母細胞的ERMES相比，目前對哺乳動物MAMs結(jié)構(gòu)的了解還很粗淺。已知MAMs是由一系列蛋白質(zhì)靈活組成的，能夠根據(jù)細胞的需求招募多種多樣信號分子的結(jié)構(gòu)，然而，對于哺乳動物的MAMs究竟包含多少種蛋白質(zhì)尚無定論。近期一份基于小鼠腦組織的檢測顯示，超過1 212種蛋白質(zhì)與MAMs有關(guān)［41］。從功能上劃分，這些蛋白質(zhì)包括且不限于位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體外膜的Ca2+通道（IP3R，VDAC1）、脂質(zhì)合成或轉(zhuǎn)運蛋白（PC、PS）、伴侶蛋白（Grp75、CNX、S1R）、氧化還原調(diào)節(jié)酶（Ero1α）、蛋白激酶（PERK）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分揀蛋白（PACS-2）、線粒體動態(tài)變化相關(guān)蛋白（Mfn2、Miro1）、炎癥相關(guān)蛋白（NACHT、LRR、NALP3）、凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2）等。其中，Mfn2是目前MAMs蛋白中研究較透徹的一種，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體處格外豐富。Mfn2位于線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，其缺失導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位結(jié)構(gòu)破壞，使兩細胞器間距離增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體形態(tài)發(fā)生改變，同時，線粒體對Ca2+的攝取亦產(chǎn)生缺陷［13］。此外，VDAC-GRP75-IP3R復合體也被發(fā)現(xiàn)存在于MAMs，充當Ca2+傳遞的重要孔道。

從形態(tài)上劃分，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包括片狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩種。片狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常適合與多核糖體結(jié)合，因此是蛋白質(zhì)折疊發(fā)生的主要場所；而管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則是鈣信號傳遞和脂質(zhì)合成的大本營。某些參與管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的蛋白質(zhì)，如，酵母菌中的Sey1P和哺乳動物中的atlastins，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)和脂質(zhì)傳遞至關(guān)重要，這表明，管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)似乎更適合與其他細胞器間形成固態(tài)連接［60］。盡管目前鮮見運動對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)影響的探索性研究，然而，考慮到有氧運動和抗阻訓練對蛋白質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝的差異性調(diào)控作用，是否有一種可能，即運動是通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)、修飾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)從而發(fā)揮其代謝效應的？

2.1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間的距離

共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡的發(fā)明使得學者們得以觀察線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的距離，結(jié)果表明，ER-線粒體接觸的區(qū)域約占其自身膜網(wǎng)絡(luò)面積的5%～20%。經(jīng)測量，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間距離約為10 nm，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)距線粒體25 nm左右［12］，然而，就是對這微小距離的精確控制決定了細胞的生死存亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間必須維持一定的距離以保持其功能的正常發(fā)揮。當其距離減小時，線粒體會經(jīng)歷鈣過載和線粒體外膜滲透（MOMP），繼而發(fā)生細胞凋亡。與此相對，當距離加寬時，線粒體呼吸受到刺激，使得ATP生成增加［12］。

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的功能

2.2.1 Ca2+的重要角色

Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持對諸多細胞過程都至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間偶聯(lián)的狀態(tài)和效率是決定線粒體Ca2+濃度的首要調(diào)控因素之一。在20世紀60年代，有學者發(fā)現(xiàn)，分離的線粒體在受到刺激時可攝取Ca2+。進一步的研究證實，盡管胞漿Ca2+遠沒有達到足以激活線粒體內(nèi)膜Ca2+轉(zhuǎn)運體（MCU，Ca2+uniporter）的濃度，然而，線粒體Ca2+仍隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道IP3R的開放而顯著升高。事實上，與靜息Ca2+濃度（0.1μmol/L）相比，盡管IP3R和RyR的開放使得胞漿［Ca2+］瞬間上升到1～3μmol/L，但這仍遠低于MCU的親和濃度。MAMs的發(fā)現(xiàn)解決了有關(guān)Ca2+攝取的這一長久困惑。Rizzuto等的成果顯示，在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的交界MAMs處存在Ca2+濃度顯著高于胞漿內(nèi)平均鈣濃度的微域（microdomain）［45］。骨骼肌收縮依賴于Ca2+和ATP的供應，因此受到Ca2+釋放單元（CRUs）三聯(lián)體和線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的控制。與其他細胞類似，骨骼肌纖維中的線粒體和CRUs在空間上很接近，且通過系帶形成物理連接。研究表明，衰老會導致CRUs和線粒體的數(shù)量減少，同時CRUs-線粒體間的偶聯(lián)頻率降低，因而力輸出和骨骼肌耐力減弱。運動則可以增加線粒體數(shù)量并改善線粒體與CRUs的聯(lián)系［43］。

諸多分子參與對這一微域Ca2+的調(diào)控。p53是最重要的腫瘤抑制因子之一，除了作為核轉(zhuǎn)錄因子參與對細胞凋亡的調(diào)控外，胞漿中的p53還以非依賴于轉(zhuǎn)錄的方式參與對Ca2+介導細胞凋亡的調(diào)控。其中，p53在MAMs處堆積并激活使細胞走向死亡的途徑，而p53缺失則導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［Ca2+］降低，Ca2+動員減少［17］。

除p53外，PML（promyelocytic leukemia）是另一參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間Ca2+對話的腫瘤抑制因子［39］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化物蛋白Ero1-Lα則通過IP3R1調(diào)控Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的釋放［1］。

2.2.2 MAMs與ROS

定位于MAMs的若干分子參與ROS生成及隨后的信號通路。p66Shc是一種位于MAMs的ROS生成蛋白。在生理狀態(tài)下，磷酸化的p66Shc是RAS介導信號通路的一種負調(diào)節(jié)因子。然而，在感受到氧化應激時，p66Shc則在Ser36位點被磷酸化，繼而轉(zhuǎn)位到線粒體和/或MAMs，參與ROS生成和凋亡相關(guān)信號通路［20］。MAMs片段中p66Shc的含量隨著年齡的增加也相應增加，且與線粒體H2O2生成水平的變化相一致，這從側(cè)面印證了p66Shc對ROS的作用。

除p66Shc外，Ero1-Lα和Ero1-Lβ也是位于MAMs的，參與ROS生成的重要蛋白質(zhì)。大約有超過75%的Ero1-Lα位于MAMs處，它與PDI（蛋白二硫化物異構(gòu)酶）共同參與二硫鍵的形成，因此在蛋白質(zhì)折疊中扮演重要角色［9，16］。研究顯示，Ero1-Lα的活性導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)H2O2的大量生成。

2.2.3 MAMs與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

除了作為Ca2+的主要貯存庫外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還是蛋白質(zhì)合成和折疊的主要場所。在某些應激狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度降低，鈣結(jié)合伴侶（鈣網(wǎng)織蛋白、BiP/GRP98和GRP94）功能受限，ATP供量不足，繼而發(fā)生錯誤蛋白折疊，這一現(xiàn)象稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）［2］。ERS通過3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白PERK、IRE1和ATF6的激活進一步導致錯誤折疊蛋白反應（UPR）［54］。ERS初發(fā)生時，細胞試圖通過增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶含量，減少非重要蛋白翻譯和促進錯誤蛋白降解等途徑拯救被錯誤折疊的蛋白。這時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)發(fā)生變化，線粒體更加靠近內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并與之形成緊密偶聯(lián)。與此同時，線粒體膜電位升高，Ca2+攝取增多，ATP生成及氧攝取量增加。這使得細胞ATP儲量暫時升高，從而利于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶表達。然而，當ERS后果不可挽回時，細胞則會在的指引下走向凋亡。有證據(jù)表明MAMs也參與了ERS，如，PERK被發(fā)現(xiàn)定位于MAMs且能促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)［59］。另一MAMs相關(guān)蛋白Mfn2則能通過下調(diào)PERK的活性從而調(diào)控ERS導致的細胞自噬和凋亡［33］。

2.2.4 MAMs與細胞凋亡

眾所周知，線粒體在細胞死亡的啟動和信號擴大過程中均發(fā)揮重要作用［28］。線粒體對Ca2+攝取過量會導致線粒體發(fā)生MOMP、線粒體功能異常，繼而觸發(fā)凋亡發(fā)生［40］。其中，位于線粒體內(nèi)膜的滲透轉(zhuǎn)換孔（PTP）也可能扮演重要角色，其開放時間延長導致線粒體內(nèi)膜（IMM）滲透性發(fā)生變化。PTP開放反過來誘導線粒體腫脹和線粒體外膜（OMM）斷裂，繼而caspase激活因子釋放，凋亡發(fā)生［28］。MOMP發(fā)生后，細胞色素c釋放入胞漿，通過與IP3R結(jié)合并促進其功能，導致更多的Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體傳遞，進一步擴大凋亡信號［7］。

在感受到凋亡刺激后，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體處的Bap31（B-cell receptor-associated protein 31，B細胞受體相關(guān)蛋白31）-Fis1能招募caspase-8，剪切Bap31成為促死亡p20Bap31片段，而該活性片段能促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+貯存排空。臨近的線粒體在攝取Ca2+后發(fā)生PTP開放，發(fā)生凋亡因子的釋放，進而發(fā)生凋亡［24］。當PACS-2被敲除，MAMs的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，盡管Bap31仍能被剪切為p20Bap31，然而細胞死亡卻不會發(fā)生，這說明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間的緊密偶聯(lián)對于Bap31介導的細胞凋亡是必須的［53］。

有研究顯示，癌基因H-Ras位于MAMs，且可能通過調(diào)控Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的傳遞影響腫瘤存活和生長［44］。此外，作為一種下調(diào)Akt的腫瘤抑制因子，PTEN也位于MAMs［8］。它通過與Akt/IP3R復合物協(xié)作導致Ca2+釋放增加。另一腫瘤抑制因子PML也能通過與IP3R3協(xié)同作用調(diào)控鈣流及細胞凋亡［18］。除此之外，以下伴侶分子和氧化還原酶同樣定位于ER/MAMs。例如，ERp44直接與IP3R1發(fā)生作用，抑制其活性［23］。ERp44還能加強Ero1-Lα的作用，因此可以說，ERp44和Ero1-Lα共同參與對IP3R依賴鈣信號的調(diào)控，進而對細胞凋亡亦發(fā)揮作用。

2.2.5 MAMs與細胞自噬

2013年，一項發(fā)表于Nature的研究顯示，自噬體的形成源自MAMs。在饑餓條件下，自噬前體/自噬體標記物Atg14和Atg5定位于MAMs。此外，在PACS-2敲除和Mfn2敲除細胞中，無論是自噬標記物的堆積還是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)位均顯著減少，這表明，MAMs在自噬體的形成中扮演一定角色［22］。

mTOR是一種參與調(diào)控自噬的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包含mTORC1和mTORC2。研究表明，mTORC2位于MAMs，且可以激活Akt。激活的Akt則通過PACS和己糖激酶磷酸化控制MAMs的完整性和線粒體功能。此外，mTORC2和Akt共同調(diào)控IP3R3磷酸化和Ca2+釋放［6］。作為一種位于MAMs并參與自噬體形成的蛋白質(zhì)，Rab32被發(fā)現(xiàn)調(diào)控mTORC2的活性。另一MAMs蛋白p66Shc也被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控細胞自噬。PKCβ過表達使得p66Shc磷酸化增加，且轉(zhuǎn)移到線粒體的p66Shc增多。PKCβ和p66Shc過表達導致細胞自噬活性降低［38］。

2.2.6 MAMs與線粒體動態(tài)變化及移動性

如前文所述，Mfn2在MAMs處的含量格外豐富。當鈣過載、ROS生成過多或細胞處于其他應激狀態(tài)時，線粒體膜電位降低并發(fā)生片段化。同時，Mff招募Drp1（dynaminrelated protein 1）至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體處。有研究認為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在這一過程中扮演一定角色［15］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在即將發(fā)生剪切的位置包裹住內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，且酵母菌的ERMES復合體也存在于此，這一事實也證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)對線粒體分裂的重要作用［34］。線粒體分裂發(fā)生前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體間首先形成緊密連接，繼而Drp1組裝。一般觀點認為，通過被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹，線粒體的形態(tài)（線粒體網(wǎng)絡(luò)的大小、長度和形狀）可能發(fā)生變化，從而利于Drp1組裝。然而，亦有證據(jù)顯示，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)并未影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹線粒體，且Drp1或Mff敲除也不會破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)，因此，不排除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間的固態(tài)連接結(jié)構(gòu)與線粒體分裂蛋白招募過程相互獨立這一可能性［15］。

作為為細胞集中供能的細胞器，線粒體需具備沿微管自由移動，并能準確定位到對能量需求高的部位的能力。濃度在正常生理范圍內(nèi)的胞漿Ca2+可控制線粒體移動——線粒體移動在Ca2+濃度低時較活躍，而在Ca2+濃度高時則受到抑制。同時，移動變緩的線粒體傾向于聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍，以便于接收從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+，并方便傳遞鈣信號。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)是促使線粒體在細胞內(nèi)自由移動，并保障合理Ca2+攝取和ATP生成的最優(yōu)途徑［61］。

2.2.7 MAMs與炎癥

人類NLR（NOD-like receptor，NOD樣受體）家族包含22個已知成員。在被激活后，這些蛋白質(zhì)形成復合體，也稱為炎性小體。NLRP3炎性小體是當前研究得較透徹的一種。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體與炎癥的關(guān)系在2011年得到首次揭示，發(fā)現(xiàn)ROS能促進NLRP3小體的激活［63］。在安靜狀態(tài)下，NLRP3位于胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。然而在炎癥激活時，NLRP3和它的銜接蛋白ASC共同轉(zhuǎn)位到MAMs，從而接收來自線粒體的信號［51］。除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體外，線粒體是ROS的主要生成部位。在多種刺激下，ROS均能激活NLRP3炎性小體。在正常情況下，生成ROS過度的線粒體會通過線粒體自噬途徑被清除。當自噬受到抑制時，功能異常的線粒體堆積，從而激活NLRP3炎性小體。

TXNIP（硫氧還蛋白互作蛋白）可以與NLRP3結(jié)合，在ERS和炎癥之間充當信號集線（hub）角色。在氧化應激下或感受到NLRP3炎性小體激活時，TXNIP重新分布到MAMs/線粒體［62］。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激刺激下，TXNIP通過PERK和IRE1通路被誘導激活，導致IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄增加，促進IL-1β生成，從而介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的β細胞死亡［36］。除TXNIP外，VDAC也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)參與NLRP3介導炎癥反應的另一重要分子。VDAC1/2敲除能選擇性消除NLRP3炎性小體形成［63］。

3 MAMs相關(guān)分子在運動介導線粒體適應中的作用及機制

作為一種經(jīng)典的腫瘤抑制因子，p53在近年來還被發(fā)現(xiàn)參與對線粒體功能的調(diào)控，且介導對運動表現(xiàn)的修飾。在一項基于力竭游泳模型的研究中，p53敲除小鼠的運動能力下降50%，證明了p53對運動能力的重要性。此外，p53敲除小鼠的SS線粒體和IMF線粒體含量都顯著降低，COX活性和PGC-1α的表達水平也顯著下降，表明p53參與對線粒體生物發(fā)生的調(diào)控［47］。若干證據(jù)顯示，不同方式的運動干預對p53的功能也有不同的修飾作用。例如，施加急性力竭電刺激誘導肌肉收縮后即刻，p53在Ser15位點上磷酸化水平增加，因此推測其活性和穩(wěn)定性也增加［47］。此外，高強度間歇運動和中等強度的連續(xù)運動均會導致p53在Ser15位點上磷酸化水平增加，且其作用可能是通過上游信號AMPK和p38MAPK實現(xiàn)的［4］。除了在翻譯后水平調(diào)控外，運動還能誘導p53的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位。例如，急性跑臺運動能誘導p53轉(zhuǎn)位到SS和IMF線粒體，并與Tfam和mtDNA形成復合物，推測p53可能通過對Tfam的活性進行直接或間接調(diào)控來修飾線粒體基因組。也有學者提出理論，認為在感受到運動應激后，p53可能首先在細胞核中上調(diào)Tfam的表達，繼而轉(zhuǎn)位到線粒體，修飾線粒體Tfam的活性［3］。然而，又有證據(jù)認為，運動僅會導致核p53的變化，而對線粒體p53則無明顯的干預作用。事實上，一項基于人骨骼肌的研究顯示，急性運動后核p53增加，而線粒體或胞漿中的p53則無顯著變化［55］。運動強度也是調(diào)控p53表達的因素之一，如，沖刺跑間歇性訓練能上調(diào)p53的蛋白表達水平，而較低強度的運動則不能達到類似的效果［21］。

除了介導線粒體生物發(fā)生外，p53在細胞內(nèi)的不同位置還與細胞自噬相關(guān)。Grp78是一種關(guān)鍵的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白。當發(fā)生ERS時，Grp78的表達水平顯著增加。研究顯示，ERS會上調(diào)Grp78的表達，并導致p53轉(zhuǎn)位到細胞核并誘導細胞自噬發(fā)生，而Grp78下調(diào)則使p53轉(zhuǎn)位到胞漿并抑制自噬［26］。此外，急性運動導致的細胞核p53上調(diào)伴隨線粒體Atg5減少和胞漿PINK1增加，這些都標志著細胞自噬水平的上升，以利于清除受損的蛋白質(zhì)和細胞器［55］。

以往的研究認為，胞漿p53和核p53分別通過非轉(zhuǎn)錄依賴以及轉(zhuǎn)錄依賴的機制對應激響應。其中，胞漿p53主要通過線粒體轉(zhuǎn)位參與非轉(zhuǎn)錄通路。除此之外，Giorgi課題組于2015年的新近發(fā)現(xiàn)為p53的功能發(fā)揮提供了新思路［17］。他們認為，線粒體p53可能不是促進凋亡的唯一非轉(zhuǎn)錄依賴通路。相反，p53的一部分與MAMs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連，且此部分非核p53能在生理病理應激條件，以及抗癌藥物的作用下通過修飾鈣穩(wěn)態(tài)促進凋亡。由于Giorgi等的研究發(fā)現(xiàn)較新，在此基礎(chǔ)上尚無直接證據(jù)闡釋運動介導p53的變化對MAMs功能影響的研究。然而，考慮到運動對線粒體生物發(fā)生和凋亡的雙重影響［47］，以及運動干預對細胞內(nèi)Ca2+已知修飾作用，很有可能核p53和位于MAMs處的p53分別以轉(zhuǎn)錄依賴和非轉(zhuǎn)錄依賴的方式共同參與運動對細胞凋亡的調(diào)控，而胞漿p53則以非轉(zhuǎn)錄依賴（線粒體轉(zhuǎn)位）的方式介導運動對線粒體生物發(fā)生的影響。

Mfn2最初被認為在線粒體動態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用，通過與Mfn1形成同質(zhì)或異質(zhì)連接介導線粒體融合［11］。通過連接線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Mfn2還在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)以及UPR中扮演重要角色［13］。Mfn2功能喪失會誘導ERS慢性激活，并發(fā)生胰島素抵抗和代謝失調(diào)［52］。由于通過慢性施加TUDCA能減輕ERS，從而使得肝臟特異性Mfn2敲除小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)、氧化應激和胰島素信號缺陷恢復正常，因此推測Mfn2缺陷所致的線粒體功能異常是通過ERS實現(xiàn)的［52］。Mfn2還與運動能力有關(guān)，肺動脈高壓患者可見骨骼肌Mfn2和Mfn1表達減少，同時出現(xiàn)運動不耐受［5］。此外，急性和慢性運動均能誘導骨骼肌Mfn2生成，且Mfn2基因的誘導表達可能是通過PGC-1α/ERRα實現(xiàn)的［10］。一般認為，誘導MAMs處蛋白表達會使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體聯(lián)系更緊密。然而，較新的證據(jù)顯示，敲除Mfn2會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體聯(lián)系增加，且鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體轉(zhuǎn)移增多，這表明Mfn2可能充當MAMs的負調(diào)節(jié)因子［29］。因此，盡管已知位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Mfn2分子主要通過與位于線粒體的Mfn2或Mfn1分子協(xié)同作用發(fā)揮功能，以及運動對Mfn2有確定的修飾作用，然而，運動能否通過修飾Mfn2對MAMs的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響尚不得而知，需要進一步的探索研究。

運動很早即被發(fā)現(xiàn)對ROS生成及其信號通路具有干預作用，其中p66Shc扮演重要角色。p66Shc屬于ShcA銜接蛋白家族，最初被發(fā)現(xiàn)在氧化應激反應中發(fā)揮作用，因此也與細胞凋亡相關(guān)。p66Shc在細胞內(nèi)所處的位置一直飽受爭議。研究認為在質(zhì)膜上，p66Shc參與Ras/MAPK信號，促進Rac1激活。p66Shc還被發(fā)現(xiàn)位于MAMs和PAMs（plasma membrane-associated membranes）處。在感受到氧化應激刺激時，p66Shc在Ser36位點被PKCβ磷酸化，繼而轉(zhuǎn)位到線粒體，隨后線粒體ROS生成增加，從而促進凋亡發(fā)生［30］。在細胞核內(nèi)，p66Shc能抑制FOXO轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控ROS清除酶的表達。p66Shc還被發(fā)現(xiàn)位于線粒體膜間隙，與細胞色素c發(fā)生聯(lián)系并參與ROS生成［20］。盡管眾所周知，運動對ROS生成和凋亡調(diào)控均有重要干預作用，然而，p66Shc在此過程中扮演的角色則探討相對較少。已知大劑量的抗腫瘤制劑DOX具有線粒體毒性。研究發(fā)現(xiàn)，DOX干預會增加腦組織線粒體中p66Shc（ser36）/p66Shc比，而運動可以削弱這種變化［32］。此外，12周的自主跑輪運動也降低大鼠肝臟中p66Shc（ser36）的水平［49］。長時間的游泳運動雖增加大鼠心肌中p66Shc磷酸化的水平，卻沒有帶來線粒體其他氧化應激標記物或抗氧化酶活性的變化［64］。盡管上述3項研究均對運動應激下p66Shc的表達進行了定量檢測，然而，其共同不足在于沒有分析p66Shc的細胞內(nèi)定位。如前所述，學界當前對p66Shc的細胞內(nèi)定位尚未達成一致。證據(jù)顯示，大概35%的線粒體p66Shc位于膜間隙，但也有學者認為這一比例被高估了［19］。另有研究顯示，p66Shc的細胞內(nèi)定位與機體年齡有關(guān)。在1月齡小鼠中，與MAM相比，PAM中含有更多的p66Shc蛋白，且可能參與表皮生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導。在23月齡小鼠中，更多的p66Shc是位于MAM的，這可能與其誘導線粒體氧化應激的功能有關(guān)［30］。結(jié)合運動對氧化應激的已知作用，我們推測線粒體處，尤其是MAMs處的p66Shc主要參與介導運動干預對細胞氧化應激的修飾作用。

MTORC1通路一直被認為是參與骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的兩條主要信號通路之一，與蛋白質(zhì)合成和肌肉肥大有關(guān)。隨后的研究表明，由于對營養(yǎng)和能量的敏感性，MTORC1還參與對自噬的調(diào)節(jié)，尤其是負責運動應激下對細胞自噬的負調(diào)控，這主要是MTOR通過磷酸化ULK1，抑制ULK1激活和自噬起始實現(xiàn)的。而MTORC2通過在Ser473位點磷酸化Akt，并協(xié)助PDK1介導的Akt在Thr308位點的磷酸化來進一步激活MTORC1通路［50］。除MTORC2外，另一定位于MAMs的關(guān)鍵因子Atg5則對自噬體膜的形成非常重要。研究顯示，抗阻訓練能增加老齡大鼠骨骼肌中Atg5/12的表達水平，并下調(diào)mTOR的磷酸化水平［31］。與之相似，超長時間一次性跑步運動會降低mTOR（Ser2448）的磷酸化水平，且同時Atg5-Atg12聚合體形成顯著增加［25］。這些證據(jù)均表明運動能促進自噬的發(fā)生。在漸進性耐力運動中，MTOR介導的ULK1磷酸化水平降低，表明即使在低強度的運動刺激下，細胞自噬也會被誘導發(fā)生［37］。也有理論認為，在耐力運動中，MTORC1信號通路的抑制會修飾FOXO3a的活性和ULK1信號軸，從而動員蛋白質(zhì)降解成為營養(yǎng)和能量底物，以備在運動強度增高時使用［48］。在過去很多年里，學界對于自噬體膜的來源頗有爭議。隨后，Hamasaki等于2013年報道了在哺乳動物細胞中，饑餓誘導后自噬體膜在MAMs處形成［22］。由于有證據(jù)表明饑餓和運動干預對細胞自噬具有類似的作用并享有十分相似的分子機制，可以合理推測細胞自噬對運動的應答很可能與MAMs的結(jié)構(gòu)和功能緊密相關(guān)，且Atg14、Atg5和MTORC2均在其中扮演重要角色。

4 小結(jié)和展望

自發(fā)現(xiàn)以來，MAMs一直是學者們研究的熱點，借用現(xiàn)代技術(shù)手段對MAMs的結(jié)構(gòu)和功能開展了全方位的探索性研究。然而，目前取得的成果距離使我們理解MAMs神秘的結(jié)構(gòu)和復雜的功能還很遠，諸多關(guān)鍵性信息仍亟待解答：MAMs是如何在應激條件下引導細胞走向自噬抑或凋亡的道路？哺乳動物MAMs的結(jié)構(gòu)究竟由哪些組件構(gòu)成？除Ca2+之外，是否存在其他分子或結(jié)構(gòu)同樣作為MAMs的調(diào)控樞紐？哪些信號分子觸發(fā)了MAMs組件的分離及整合，MAMs又是如何調(diào)控下游信號通路的？MAMs失調(diào)能否繼氧化應激和炎癥之后，成為下一個慢性疾?。ㄈ绶逝?、II型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等）的共有致病因素？與上述問題相比，更值得我們關(guān)注的是當前運動人體科學領(lǐng)域?qū)AMs的研究還處于空白局面，尚無運動對MAMs組件構(gòu)成、膜間距離和作用機制方面的直接探索。填補這一空白無疑將極大補充對運動適應機制的認識。

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New Progress in Endoplasmic Reticulum -Mitochondria Coupling and Exercise Stress

SUN Yi1，2，DING Shu-zhe1，2

Various cellular activities depend on the cooperation of mitochondria and endoplasmic reticulum. MAMs are special structures that exist between the two organelles，making up of certain protein complex. The integrated structure and normal functioning of MAMs are pre-requisites that biological processes such as mitochondrial dynamics，apoptosis and endoplasmic reticulum stress take place as designed. In this review，we will summarize the current progress in research of MAMs，and bring up the idea that Ca2+plays a central role in the regulation of MAMs. The important role that MAMs play in ROS，endoplasmic reticulum stress，apoptosis，autophagy，mitochondrial dynamics，mitochondrial mobility and in fl ammation etc. will be summarized. The possible mechanism that exercise regulates MAMs as well as the pathways that MAMs molecules mediate exercise adaptation will be discussed，in the hope of providing insight into the potential directions of future investigations in the fi eld of exercise adaptation.

mitochondria；endoplasmic reticulum；MAMs；exercise stress；Ca2+

G804.6

A

2016-10-11；

2017-08-11

國家自然科學基金資助項目（31600967）；青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室建設(shè)項目（40500-541235-14203/004）。

孫易，女，講師，博士，主要研究方向為運動對肥胖和II型糖尿病的干預機制，Tel：（021）54341197，E-mail：ysun@tyxx.ecnu.edu.cn；丁樹哲，男，教授，博士，博士研究生導師，主要研究方向為線粒體運動適應與信號調(diào)控，E-mail：szding@tyxx.ecnu.edu.cn。

1.華東師范大學 青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室，上海 200241；2.華東師范大學 體育與健康學院，上海 200241

1. Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention of Ministry of Education，East China Normal University，Shanghai 200241，China；2. School of Physical Education & Health Care，East China Normal University，Shanghai 200241，China.