任婷 饒春梅 成細華 楊勝輝 孫彥波 陳聰 彭霞 黃政德

摘要：目的 觀察加味丹參飲對SD大鼠心肌缺血再灌注損傷（IRI）模型精脒/精胺乙酰轉移酶（SSAT）/多胺通路的影響，探討其抗IRI的機制。方法 結扎大鼠冠狀動脈左前降支30 min再灌注90 min建立大鼠心肌IRI模型。實驗大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組和加味丹參飲組，每組10只。TTC染色測定大鼠心肌梗死面積，ELISA檢測大鼠心肌組織SSAT含量，RT-PCR和Western blot分別檢測大鼠心肌組織SSAT mRNA和蛋白表達，HPLC檢測大鼠心肌組織多胺（腐胺、精脒、精胺）含量。結果 與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死面積、SSAT含量增加，SSAT mRNA和蛋白表達升高，多胺含量降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，加味丹參飲組大鼠心肌梗死面積、SSAT含量減少，SSAT mRNA和蛋白表達降低，多胺含量升高（P<0.05，P<0.01）。結論 加味丹參飲可能通過調節(jié)SSAT/多胺通路，增加心肌細胞多胺含量，從而對大鼠心肌IRI發(fā)揮保護作用。

關鍵詞：加味丹參飲；心肌缺血再灌注損傷；多胺；精脒/精胺乙酰轉移酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）07-0062-04

Abstract： Objective To observe the effects of modified Danshen Decoction on spermidine/spermine acetyltransferase （SSAT） /polyamine pathways of SD rats with IRI； To investigate its protective mechanism. Methods The model of IRI was established by ligating left anterior descending coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 90 min. The SD rats were randomly divided into the control group， sham-operation group， model group and modified Danshen Decoction group， with 10 rats in each group. The myocardial infarction size was measured by using TTC staining. The contents of SSAT were measured by ELISA. The SSAT mRNA and SSAT protein expression level were detected with real-time fluorescent quantitative PCR method and Western blot， respectively. The contents of polyamines （putrescine， spermidine， spermine） in cardiac tissue were detected by HPLC. Results Compared with sham-operation group， the myocardial infarction size， the SSAT content， the SSAT mRNA and SSAT protein expression levels of model group increased significantly， the contents of polyamines decreased significantly， with statistical significance （P<0.01）； Compared with model group， the myocardial infarction size of modified Danshen Decoction group was significantly reduced， while the SSAT content and SSAT mRNA and protein expression level decreased significantly， the contents of polyamines increased， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Modified Danshen Decoction can adjust the SSAT polyamine pathways and increase polyamine content in cardiomyocytes， and thus play a role of protection of myocardial ischemia-reperfusion injury.

Key words： modified Danshen Decoction； myocardial ischemia/reperfusion injury； polyamines； spermidine/ spermine acetyltransferase； rats

近年來，隨著血運重建技術的廣泛開展，心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）機制及心肌保護的研究成為倍受重視的課題，但IRI所涉及機制復雜，目前尚未清楚，臨床上仍缺乏針對心肌保護的藥物。多胺（腐胺、精脒和精胺）是存在于真核細胞且含高密度正電荷的一類有機小分子，廣泛參與胚胎發(fā)育、細胞生長與分化、細胞程序性凋亡及基因表達調控等重要的生理病理過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多胺系統(tǒng)在IRI發(fā)揮重要作用[2]。在IRI時，多胺代謝失衡，多胺分解代謝的限速酶——精脒/精胺乙酰轉移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase，SSAT）表達改變，腐胺生成增多而精胺、精脒減少[3-4]，均與IRI密切相關。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血中藥復方加味丹參飲對防治心肌IRI有重要作用[5-7]。本研究在此基礎上，采用SD大鼠制作IRI模型，觀察加味丹參飲預處理對大鼠IRI后SSAT表達和活性及多胺含量變化的影響，從SSAT/多胺分解代謝調控角度進一步探討該方抗心肌IRI機制，為防治心肌IRI尋找新的靶點和藥物。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級SD大鼠100只，雌雄各半，8～10周齡，體質量220～300 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，溫度18～25 ℃、濕度50%～60%，正常光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物

加味丹參飲（丹參20 g、檀香6 g、赤芍10 g、川芎6 g、當歸6 g、紅花6 g、生地黃12 g等），飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，藥物混勻，浸泡30 min，水煎2次（檀香后下），合并煎液，過濾，濃縮至1 g原藥材/mL。

1.3 主要試劑與儀器

腐胺、精脒、精胺（美國Sigma公司），ELISA試劑盒（Clod-Clone Corp公司），RevertAid? H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），反轉錄試劑盒（Taka-Ra公司），SYBR GreenPCR Master Mix（美國ABI），引物（上海生工生物工程技術服務有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），兔抗大鼠SAT1一抗（Bioss公司），β-actin一抗（Santa cruz公司），HRP耦聯(lián)山羊抗兔IgG（美國Sigma公司）。小動物呼吸機（浙江大學醫(yī)學實驗儀器廠，DH-8型），十六導生理記錄儀（Biopac公司，MPl50型），RT-PCR儀（美國ABI公司，7900型），水平電泳槽（北京君意東方儀器公司，JY-SPC），電泳儀（北京鼎國生物技術發(fā)展中心，DG-Ⅲ），紫外凝膠檢測和成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國），高速冷凍離心機（美國Sigma公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

參照文獻[3]方法進行造模。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，切開氣管，連接小動物呼吸機行人工通氣，于第3、4肋間開胸暴露心臟，于冠狀動脈左心室前降支離左心耳下緣約0.15 cm處繞左心室支穿線結扎，缺血30 min后剪開結扎線，再灌注90 min，造成心肌IRI。假手術組冠狀動脈穿線不結扎。術中連續(xù)監(jiān)視心電圖Ⅱ導聯(lián)的變化，以ST段抬高，T波高聳、倒置或左心室變?yōu)樯n白色為心肌缺血結扎成功（心肌缺血）的標志，剪開結扎線后ST段回落50%以上、高聳T波下降或左心室由蒼白變?yōu)榘导t色表示再灌注成功。

2.2 分組與給藥

實驗大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組和加味丹參飲組，每組10只。加味丹參飲組每日給予加味丹參飲7.74 g/kg灌胃[8]（按人和動物間體表面積等效劑量換算），于末次灌胃1 h后建立IRI模型。正常對照組、假手術組和模型組均予等量生理鹽水灌胃。灌胃體積均為7.74 mL/kg，每日2次，連續(xù)14 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 TTC染色測定心肌組織梗死面積 再灌注結束后取下心臟，剪除左心室以外心肌組織，置于-20 ℃冰箱冰凍10 min后切片，每片厚約1 mm，放入1%TTC PBS（pH 7.4）中，37 ℃水浴箱中孵育20 min，振蕩染色液，使之與心肌充分接觸。終止染色后將切片置于10%甲醛溶液中固定過夜。數(shù)碼相機拍照，存活心肌呈磚紅色，梗死區(qū)呈灰白色。應用Imagemaster VDS圖像分析儀分析心肌梗死面積占心肌總面積的百分比。心肌梗死面積率（%）=所有切片梗死面積之和÷心肌總面積之和×100%。

2.3.2 ELISA檢測心肌組織精脒/精胺乙酰轉移酶含量 再灌注結束后取大鼠左心室肌組織，用預冷PBS沖洗后加入5 mL PBS，于玻璃勻漿器冰上充分研磨，勻漿液5000 r/min離心5 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定SSAT含量。

2.3.3 RT-PCR檢測心肌組織精脒/精胺乙酰轉移酶mRNA表達 再灌注結束后取大鼠左心室組織，參照Trizol試劑盒方法提取總RNA，取2 μL RNA稀釋后，在紫外分光光度儀上測定樣品RNA純度及濃度。以總RNA為模板，按反轉錄試劑盒合成cDNA，取上述所得cDNA按25 μL體系，RT-PCR儀進行擴增。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。反應結束后讀取Ct值，通過融解曲線監(jiān)測各樣本PCR反應的特異性，以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt給藥組-ΔCt對照組，差別倍數(shù)=2-ΔΔCt，其中正常對照組數(shù)值設為1。PCR引物序列SSAT正義5'-AAAGGCACTGTCTTGCCACT-3'，反義5'-GTGGCTGGACGGATCTTAAA-3'，產物長度231 bp；β-actin正義5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'，反義5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，產物長度228 bp。

2.3.4 Western blot檢測心肌組織精脒/精胺乙酰轉移酶蛋白表達 取大鼠左心室心肌組織，加入預冷全細胞裂解液，于液氮內研磨，將勻漿冰上處理30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，提取胞漿總蛋白，BCA法測定上清液蛋白含量，置于-80 ℃?zhèn)溆?。取胞漿蛋白，加入上樣緩沖液，于100 ℃水中煮5 min，每孔40 μg蛋白上樣，經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉至PVDF膜，取膜后置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，加SSAT或β-actin一抗（按1∶500稀釋于一抗稀釋液中），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后加HRP標記羊抗兔IgG室溫孵育1 h；TBST洗膜后顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，計算條帶吸光度值。SSAT蛋白表達以其與β-actin內參蛋白吸光度比值表示。

2.3.5 HPLC測定心肌組織多胺含量 參照文獻[9]方法。再灌注后取左心室組織約150 mg，加0.3 mmol/L冷高氯酸，冰水浴中制成勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液400 μL，加入內標（1，6-己二胺）10 nmol混勻，加2 mol/L NaOH 2 mL、苯甲酰氯 10 μL，振蕩5 min，40 ℃水浴30 min后，加氯仿2 mL，振蕩2 min，2000 r/min離心10 min，取1.5 mL氯仿層，加2 mL流動相，振蕩，離心，再吸取氯仿層，加熱揮干，殘余物溶于300 μL甲醇，取10 μL，HPLC分析多胺。固定相為Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-雙蒸水（V∶V，65∶35），柱溫 35 ℃，流速0.4 mL/min，紫外檢測波長229 nm，AUFS 0.04。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 加味丹參飲對模型大鼠缺血再灌注心肌梗死面積的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠心肌梗死面積率顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，加味丹參飲組大鼠心肌梗死面積率顯著降低（P<0.01）。結果見表1。

4.2 加味丹參飲對模型大鼠心肌組織精脒/精胺乙酰轉移酶含量的影響

與正常對照組比較，假手術組大鼠心肌組織SSAT含量無明顯變化，模型組大鼠心肌組織SSAT含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，加味丹參飲組大鼠心肌組織SSAT含量顯著降低（P<0.01）。結果見表2。

4.3 加味丹參飲對模型大鼠心肌組織精脒/精胺乙酰轉移酶表達的影響

與正常對照組比較，假手術組大鼠心肌組織SSAT mRNA和蛋白表達無明顯差異，模型組大鼠心肌組織SSAT mRNA和蛋白表達顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，加味丹參飲組SSAT mRNA表達顯著降低（P<0.01）。結果見表3、圖1。

4.4 加味丹參飲對模型大鼠心肌組織多胺含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠心肌組織精胺合成減少（P<0.05），腐胺合成增加（P<0.01），精脒變化較小，總多胺池減少（P<0.05）；與模型組比較，加味丹參飲組腐胺合成減少（P<0.05），精胺和總多胺池含量增加（P<0.05）。結果見表4。

5 討論

多胺具有眾多生理功能，并在許多病理過程中發(fā)揮作用，多胺能抑制內毒素誘導小鼠血清中炎癥介質的釋放；在心肌缺血和心肌肥大的細胞凋亡中均發(fā)揮重要作用。目前已知腫瘤發(fā)生、應激、心肌肥大、心肌重構、腦缺血等許多病理事件的發(fā)生與細胞內多胺代謝失衡有關，心肌IRI時多胺代謝失衡，鳥氨酸脫羧酶及SSAT的活性改變[10]。SSAT為多胺代謝限速酶，SSAT催化精胺逆轉化為精脒及精脒逆轉化為腐胺的過程。SSAT使腐胺生成增多而精胺、精脒減少，將導致繼發(fā)性的心肌損傷。SSAT過表達老鼠表現(xiàn)出多胺降解增加，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和CYP450表達下降，導致過氧化氫生成增加[11]，可見影響SSAT活性則可影響多胺含量變化，從而對心肌組織IRI產生影響。調控SSAT表達可能對于IRI具有潛在的治療價值。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注時SSAT含量顯著增加，SSAT mRNA和蛋白表達均顯著升高。同時發(fā)現(xiàn)SSAT表達升高后，腐胺含量增加和精脒、精胺、總多胺池含量減少，表明心肌組織IRI可能誘導多胺代謝過程產生應激反應，多胺分解代謝酶SSAT表達升高。SSAT腐胺生成增多而精胺、精脒減少，將導致繼發(fā)性的心肌損傷[12]。

我們前期實驗結果顯示，加味丹參飲對IRI心肌有明顯的延遲保護作用[5-7]。本研究結果顯示，加味丹參飲預處理大鼠心肌IRI模型后，SSAT mRNA和蛋白表達均顯著降低，SSAT含量顯著減少，提示加味丹參飲可能通過調節(jié)SSAT/多胺分解代謝，減少IRI后腐胺生成，從而發(fā)揮抗IRI保護作用，但具體機制尚待進一步研究。

參考文獻：

[1] LEONOR M F， VIRIDIANA O S， KATE C， et a1. Remaining mysteries of molecular biology：the role of polyamines in the cell[J]. J Mol Biol，2015，427：3389-3406.

[2] DING L， BA X H. Role of ornithine decarboxylase/polyamine pathway in focal cerebral ischemia-reperfusion injury and its mechanism in rats[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8（11）：20624-20630.

[3] 韓麗萍，徐長慶，姜春明，等.多胺代謝與大鼠心肌缺血再灌注損傷關系的實驗研究[J].中華心血管病雜志，2008，36（4）：346-349.

[4] RYU J H， CHO Y S， CHUN Y S， et al. Myocardial SSAT induction via AMPK signaling and its implication for ischemic injury[J]. Biochem Biophys Res Commum，2008，366（2）：438-444.

[5] 王慶高，黃政德，肖健，等.加味丹參飲預處理對乳鼠缺氧/復氧心肌細胞的延遲保護作用及對蛋白激酶C的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2007，5（10）：953-955.

[6] 李鑫輝，黃政德，葛金文.加味丹參飲對血瘀證兔心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18（6）：37-39.

[7] 潘小平，黃政德，楊偉峰，等.加味丹參飲對動脈粥樣硬化模型小鼠內皮細胞功能及超微結構的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2015，22（11）：42-45.

[8] 彭霞，黃政德，成細華，等.加味丹參飲預處理調控自噬相關基因Beclin1和Atg5表達抗大鼠心肌缺血再灌注損傷[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2016，36（7）：20-24.

[9] 趙雅君，徐長慶，李全風，等.應用反向高效液相色譜分析離體心臟灌流大鼠心肌組織中的多胺[J].中國病理生理雜志，2005，21（2）：412- 413.

[10] 趙雅君，王麗娜，李鴻珠，等.大鼠心肌多胺代謝限速酶ODC、SSAT活性分析[J].中國藥理學通報，2005，21（5）：555-559.

[11] CERRADA-GIMENZ M， PIETIL? M， LOIMAS S， el a1. Continuous oxidative stress due to activation of polyamine catabolism accelerates aging and protects against hepatotoxic insults[J]. Transgenic Res，2011，20：387-396.

[12] 林巖，肖薇，李波.二氟甲基鳥氨酸對異丙腎上腺素誘導的心肌細胞肥大與凋亡的影響[J].中國藥理學通報，2015，31（5）：668-672.

（收稿日期：2016-09-29）

（修回日期：2016-10-31；編輯：華強）