王來(lái)平++薛曉敏++路超++聶佩顯++王金政

摘要：以7年生天紅2號(hào)/SH40/八棱海棠蘋(píng)果為試材，花芽膨大期噴施去離子水（CK）、18 mg/L ABA、200 mg/L甜菜堿、40 mg/L水楊酸、60 mg/L蕓薹素、200 mg/L山梨醇等外源物質(zhì)，分別于花蕾期、盛花期、幼果期采集樣品，進(jìn)行0、-2、-4、-6、-8 ℃梯度的低溫脅迫，測(cè)定抗寒相關(guān)生理指標(biāo)，研究不同外源物質(zhì)對(duì)蘋(píng)果花器官不同發(fā)育階段抗寒力的影響效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著環(huán)境溫度的升高，花器官不同發(fā)育階段半致死溫度升高，抗寒力降低，即抗寒力花蕾期>盛花期>幼果期；施用外源物質(zhì)降低了花器官不同發(fā)育階段半致死溫度，提高了花器官的抗寒力；5種外源物質(zhì)均是通過(guò)提高低溫脅迫下花器官可溶性糖含量及抗氧化酶SOD、POD活性，降低了細(xì)胞MDA含量和電解質(zhì)外滲率，從而提高了蘋(píng)果花器官抗寒力。本試驗(yàn)表明施用18 mg/L ABA效果最好，其次是40 mg/L水楊酸。

關(guān)鍵詞：抗寒力；蘋(píng)果花期；蕓薹素；水楊酸；甜菜堿；山梨醇；ABA

中圖分類號(hào)： S661.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0109-03

蘋(píng)果為我國(guó)重要的果樹(shù)樹(shù)種，山東省、陜西省、甘肅省等蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)花期受寒流侵襲，易遭受低溫凍害，導(dǎo)致減產(chǎn)，給生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。目前，普遍采用施放煙霧、花期噴水等傳統(tǒng)方法防止蘋(píng)果花期凍害，這些方法耗時(shí)費(fèi)力，收效不大。因此，篩選能夠有效增強(qiáng)蘋(píng)果抗寒力的保護(hù)劑，不僅能夠解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題，對(duì)于研究低溫脅迫基礎(chǔ)理論也具有重要意義。蕓薹素、水楊酸、甜菜堿、山梨醇、ABA作為植物抗逆增強(qiáng)劑，在調(diào)節(jié)植物抗旱、耐鹽堿等方面效用明顯，調(diào)節(jié)機(jī)理不盡相同，其施用效果也有所差別。有研究表明，ABA是抗寒基因表達(dá)的啟動(dòng)因子，對(duì)植物抗寒力的調(diào)控起著非常重要的作用[1-3]，甜菜堿作為一種相容性物質(zhì)對(duì)植物的抗逆性起著調(diào)節(jié)作用。外施ABA、甜菜堿、水楊酸等能夠有效提高植物的抗寒力，這已在番茄、水稻、芝麻等植物上多見(jiàn)報(bào)道[4-6]，但這些物質(zhì)對(duì)提高蘋(píng)果花期抗寒力的效果怎樣，有什么樣的差別，還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以7年生天紅2號(hào)蘋(píng)果為材料，探討了外施蕓薹素、水楊酸、甜菜堿、山梨醇、ABA對(duì)蘋(píng)果花期抗寒力及相關(guān)生理指標(biāo)的影響，以期為選擇適宜于蘋(píng)果的抗逆增強(qiáng)劑提供參考，并為揭示蘋(píng)果花期抗寒生理特性和提高防凍技術(shù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)在山東省果樹(shù)研究所泰東基地進(jìn)行，試材為天紅2號(hào)/SH40/八棱海棠，7年生，生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)勢(shì)一致，管理水平較高。

1.2試劑與儀器

外源蕓薹素、水楊酸、甜菜堿、山梨醇、ABA由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。DDS-11C型電導(dǎo)儀由上海光學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.3方法

于2016年3月中旬花芽膨大期噴施18 mg/L ABA、200 mg/L 甜菜堿、40 mg/L水楊酸、60 mg/L蕓薹素、200 mg/L 山梨醇（為多次試驗(yàn)篩選濃度）。試驗(yàn)按3株每小區(qū)，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。噴施后在顯蕾期、盛花期和幼果期分別采集花蕾、花朵和幼果作為試樣，在低溫冰箱中進(jìn)行低溫脅迫處理，設(shè)置0、-2、-4、-6、-8 ℃梯度的脅迫。冰箱放入材料時(shí)溫度為室溫，然后進(jìn)行降溫，降溫速度2 ℃/h，達(dá)到所需處理溫度后維持8 h，之后，切斷電源，冰箱溫度自然回升至室溫，取出材料，將材料室內(nèi)靜置10 h，進(jìn)行各生理指標(biāo)測(cè)定。

采用楊向娜的方法[7]進(jìn)行電解質(zhì)滲出率測(cè)定，電解質(zhì)滲出率=（煮沸前的電導(dǎo)值/煮沸后的電導(dǎo)值）×100%。對(duì)電解質(zhì)滲出率配以Logistic方程y=k/（1+ae-bx），用擬合的 Logistic 方程的拐點(diǎn)溫度表示組織的半致死溫度LT50[8]。式中，y表示電導(dǎo)率，x表示處理溫度，k、a、b為常數(shù)，e為自然對(duì)數(shù)。可溶性糖含量用蒽酮比色法測(cè)定[9]；丙二醛含量用硫代巴比妥酸TBA顯色法測(cè)定；SOD酶活性用氮蘭四唑（NBT）顯色法測(cè)定；POD酶活性用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理下蘋(píng)果花、幼果電解質(zhì)滲出率

在不同程度低溫脅迫下，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果的電解質(zhì)滲出率變化趨勢(shì)一致，均隨溫度的下降而上升，說(shuō)明隨著低溫脅迫的加劇，低溫對(duì)花器官不同發(fā)育時(shí)期細(xì)胞的傷害逐漸增加（表1）。噴施各調(diào)節(jié)劑后，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果電解質(zhì)滲出率均顯著小于對(duì)照，說(shuō)明各調(diào)節(jié)劑能緩解低溫對(duì)蘋(píng)果細(xì)胞造成的傷害?；ㄆ鞴俨煌l(fā)育階段，低溫下電解質(zhì)滲透率不同，花蕾期<盛花期<幼果期，說(shuō)明花器官在不同的發(fā)育階段抗寒力花蕾期>盛花期>幼果期。比較各調(diào)節(jié)劑處理下電解質(zhì)滲透率發(fā)現(xiàn)ABA處理的滲透率最低，說(shuō)明ABA在提高蘋(píng)果花器官抗寒力方面效果最好，在0 ℃到-6 ℃的低溫脅迫下水楊酸處理效果優(yōu)于蕓薹素、甜菜堿、山梨醇，在-8 ℃低溫脅迫下水楊酸和甜菜堿效果沒(méi)有顯著差別，二者均優(yōu)于山梨醇和蕓薹素。

2.2不同處理對(duì)蘋(píng)果花、幼果半致死溫度的影響

采用電解質(zhì)滲出率及Logistic回歸方程，求得蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果的半致死溫度（LT50）（表2）。從表2可以看出，不同處理下花和幼果的半致死溫度大小為花蕾<花朵<幼果，表明蘋(píng)果在器官發(fā)育過(guò)程中，隨著環(huán)境溫度的上升，器官不同發(fā)育時(shí)期半致死溫度逐漸升高，抗寒性逐漸降低。噴施調(diào)節(jié)劑后，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果的半致死溫度較對(duì)照均明顯降低（α=0.05），表明外源蕓薹素、水楊酸、甜菜堿、山梨醇、ABA均能提高蘋(píng)果的抗寒力，其中ABA處理施用效果最佳，其次是水楊酸。

2.3不同處理對(duì)蘋(píng)果及幼果MDA含量的影響

MDA是衡量逆境條件下植物細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化程度的指標(biāo)。在不同程度低溫脅迫下，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果的MDA含量變化趨勢(shì)一致，均隨溫度的下降而上升（表3）。說(shuō)明隨著低溫脅迫的加劇，蘋(píng)果花不同發(fā)育階段細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化程度增加，細(xì)胞傷害逐漸加重。噴施調(diào)節(jié)劑后，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果MDA含量均顯著小于對(duì)照，說(shuō)明調(diào)節(jié)劑能緩解低溫對(duì)植物細(xì)胞造成的傷害，低溫脅迫下MDA含量依次為花蕾期<盛花期<幼果期。比較各調(diào)節(jié)劑處理下MDA含量，外源ABA處理MDA含量最低，說(shuō)明施用效果最好。

2.4不同處理對(duì)蘋(píng)果花、幼果可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，是衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一。表4表明，在低溫脅迫下，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果的可溶性糖含量均隨溫度的下降而上升，說(shuō)明隨著低溫脅迫的加劇，蘋(píng)果滲透調(diào)節(jié)能力逐漸增強(qiáng)。噴施各調(diào)節(jié)劑后，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果可溶性糖含量均高于對(duì)照，說(shuō)明各調(diào)節(jié)劑能增強(qiáng)低溫脅迫下花和幼果滲透調(diào)節(jié)能力?；ê陀坠蜏叵聺B透調(diào)節(jié)能力不同，其中花蕾期>盛花期>幼果期。各調(diào)節(jié)劑處理下以外源ABA處理可溶性糖含量最高，說(shuō)明其施用效果最好。

2.5不同處理對(duì)蘋(píng)果花及幼果抗氧化酶活性的影響

逆境條件下，植物抗氧化酶活性增強(qiáng)，清除由于逆境而產(chǎn)生的過(guò)多的活性氧（ROS），防止活性氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。表5和表6表明，在低溫脅迫下，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果的SOD和POD活性均隨溫度的下降而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明低程度的低溫脅迫下，蘋(píng)果抗氧化酶活性逐漸增強(qiáng)，隨著脅迫程度加重，酶蛋白遭到破壞，活性降低。噴施各調(diào)節(jié)劑后，蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果SOD，POD活性均高于對(duì)照， 說(shuō)明各調(diào)節(jié)劑均能增強(qiáng)低溫脅迫下蘋(píng)果花器官抗氧化酶活性，提高其抗寒力。比較各調(diào)節(jié)劑處理下抗氧化酶活性，施用ABA處理抗氧化酶活性顯著高于其他處理，施用效果最好。在 0 ℃ 到-2 ℃的低溫脅迫下水楊酸處理抗氧化酶SOD、POD活性高于蕓薹素、甜菜堿、山梨醇處理，但是在-2 ℃到 -8 ℃ 的低溫脅迫下，甜菜堿處理的抗氧化酶SOD、POD活性顯著高于水楊酸、蕓薹素和山梨醇。這可能是因?yàn)樘鸩藟A具有維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能[10]，低溫脅迫下能更好維持抗氧化酶功能。

3討論

低溫脅迫下植物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭受破壞，且破壞程度隨脅迫程度的增加而增大。細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲率是衡量細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞程度的指標(biāo)之一，比較相同脅迫水平下電解質(zhì)的外滲率，是評(píng)價(jià)植物抗寒力的一種有效手段[11]。用電解質(zhì)滲出率及Logistic方程求得半致死溫（LT50），是鑒定植物抗寒性強(qiáng)弱的常用方法，已被廣泛應(yīng)用[12]。植物處于逆境條件下，細(xì)內(nèi)自由基清除與產(chǎn)生的平衡被打破，活性氧自由基逐漸積累，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生傷害。細(xì)胞膜系統(tǒng)首先受傷害，造成膜內(nèi)離子滲出和膜脂的過(guò)氧化。而作為膜脂過(guò)氧化的中間產(chǎn)物之一的MDA，使生物膜受到的傷害進(jìn)一步加劇[13]。SOD和POD是防御膜脂過(guò)氧化作用的重要保護(hù)被，是清除逆境下產(chǎn)生的活性氧自由基的關(guān)鍵酶。提高逆境下植物體內(nèi)清除活性氧自由基的SOD和POD等保護(hù)酶活性，就可以減輕膜脂的過(guò)氧化程度，降低活性氧自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的傷害，提高植物的抗逆性[14]。本試驗(yàn)中，施用外源蕓薹素、水楊酸、甜菜堿、山梨醇、ABA降低了蘋(píng)果花蕾、花朵和幼果的電解質(zhì)滲出率，SOD和POD酶的活性增強(qiáng)，減緩了MDA的積累，增加了可溶性糖的含量，降低了半致死溫度，提高了蘋(píng)果的抗寒性。這在番茄、芝麻、水稻、香蕉等植物上的研究結(jié)論基本一致[15-17]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，外源蕓薹素、水楊酸、甜菜堿、山梨醇、ABA對(duì)于提高蘋(píng)果抗寒性效果有所差異，在本試驗(yàn)中，施用外源ABA處理效果最佳，其次是水楊酸。施用甜菜堿處理對(duì)于抗氧化酶保護(hù)有著顯著的作用，顯著優(yōu)于蕓薹素、水楊酸、山梨醇，可能是因?yàn)樘鸩藟A具有維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能[10]，低溫脅迫下能更好地維持抗氧化酶功能。因此，生產(chǎn)中施用調(diào)節(jié)劑可以有選擇地進(jìn)行復(fù)配，以提高施用效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]彭艷華，黃永秀. 脫落酸應(yīng)答基因的結(jié)構(gòu)，表達(dá)調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[J]. 植物生理學(xué)通訊，1996，32（2）：155-158.

[2]謝吉容，向鄧云，梅虎，等. 南方紅豆杉抗寒性的變化與內(nèi)源激素的關(guān)系[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，27（2）：231-234.

[3]郭鳳領(lǐng)，盧育華，李寶光. 外源ABA對(duì)番茄苗期和開(kāi)花期抗冷特性的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，31（4）：357-362.

[4]黨秋玲，余超，王禎麗. ABA處理種子對(duì)加工番茄幼苗抗寒力及相關(guān)生理指的影響[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，23（3）：349-351.

[5]曾韶西，王以柔，李美茹，等. 冷鍛煉和ABA誘導(dǎo)水稻幼苗提高抗冷性期間膜保護(hù)系統(tǒng)的變化[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，1994，2（1）：44-50.

[6]李亞男，陳大清，胡培麗. ABA和6-BA對(duì)不同溫度條件下芝麻幼苗某些生理指標(biāo)的影響[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，2（8）：67-68，75.

[7]楊向娜，魏安智，楊途熙，等. 仁用杏3個(gè)生理指標(biāo)與抗寒性的關(guān)系研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21（3）：30-33.

[8]龔月樺，周永學(xué)，樊軍鋒，等. 美國(guó)黃松、班克松和油松的抗寒性比較[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（8）：1389-1392.

[9]高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 西安：世界圖書(shū)出版公司，2000.

[10]侯彩霞，於新建，李榮，等. 甜菜堿穩(wěn)定PSⅡ放氧中心外周多肽機(jī)理[J]. 中國(guó)科學(xué)：C輯，1998，28（4）：355-361.

[11]聶慶娟，孟朝，梁海永，等. 低溫脅迫對(duì)4種常綠闊葉植物膜脂過(guò)氧化及保護(hù)酶活性的影響[J]. 植物研究，2007，27（5）：578-581.

[12]趙習(xí)平，劉鐵錚，付雅麗. 杏樹(shù)花期霜凍危害及其抗寒性研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19（11）：33-35.

[13]和紅云，田麗萍，薛琳. 植物抗寒性生理生化研究進(jìn)展[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，13（2）：10-13.

[14]王燕凌，廖康，劉君，等. 越冬前低溫鍛煉期間不同品種葡萄枝條中滲透性物質(zhì)和保護(hù)酶活性的變化[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2006，23（3）：375-378.

[15]白潔，蔣衛(wèi)杰，余宏軍，等. 外源ABA、Put和BR對(duì)亞適溫條件下番茄幼苗葉片保護(hù)酶活性的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（6）：317-320.

[16]詹嘉紅，藍(lán)宗輝. 外源ABA對(duì)低溫脅迫水稻幼苗酯酶同工酶的影響[J]. 生物技術(shù)，2000，10（4）：19-21.

[17]周玉萍，鄭燕玲，田長(zhǎng)恩，等. 脫落酸、多效唑和油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫期間香蕉過(guò)氧化物酶和電導(dǎo)率的影響[J]. 廣西植物，2002，22（5）：444-448.