曹麗娟，劉文博（承德市中心醫(yī)院婦產科，河北承德 067000）

miR-497和miR-34a在鉑敏感和鉑耐藥卵巢上皮癌患者中的表達差異及機制研究

曹麗娟＊，劉文博（承德市中心醫(yī)院婦產科，河北承德 067000）

目的：探討微小核糖核酸miR-497和miR-34a在鉑敏感和鉑耐藥卵巢上皮癌（EOC）患者中表達的差異及機制。方法：選取2008年1月－2012年1月于我院婦產科行卵巢癌分期手術或腫瘤細胞減滅術的EOC患者72例，術后均行以鉑類藥物為基礎的規(guī)范化療，并進行隨訪（時間為2008年7月－2016年7月）。根據患者對鉑類藥物的敏感性將其分為鉑敏感組（42例）和鉑耐藥組（30例）。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測兩組患者腫瘤組織中miR-497和miR-34a的表達水平，并考察其與患者總生存時間的相關性；采用巢式降落式甲基化特異性聚合酶鏈反應法檢測患者miR-497和miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化水平，采用蛋白印跡法考察組蛋白H3第9位賴氨酸殘基二甲基化（H3K9me2）水平，采用染色質免疫共沉淀法檢測miR-497和miR-34a啟動子區(qū)H3K9me2水平。結果：鉑敏感組患者miR-497和miR-34a的表達水平均顯著高于鉑耐藥組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；72例患者的總生存期為（45.7±17.5）個月，與其miR-497和miR-34a表達水平呈正相關（r2分別為0.271 4、0.378 2，P＜0.01）。鉑耐藥組患者miR-497和miR34a啟動子區(qū)DNA甲基化水平均顯著高于鉑敏感組，且其啟動子區(qū)H3K9me2水平也顯著高于鉑敏感組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；而鉑耐藥組患者H3K9me2水平雖略高于鉑敏感組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：EOC患者腫瘤組織中miR-497和miR-34a的表達水平與鉑化療的敏感性及患者的生存時間有關，啟動子區(qū)DNA甲基化和組蛋白甲基化可能是其表達變化的機制之一。

微小核糖核酸；miR-497；miR-34a；卵巢上皮癌；鉑耐藥；DNA甲基化；組蛋白甲基化；啟動子區(qū)

卵巢上皮癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中病死率位居第一位[1-2]。分期手術或細胞減滅術后行順鉑為主的化療是目前治療EOC的重要手段之一，但鉑耐藥的產生是導致化療失敗和腫瘤復發(fā)的中心環(huán)節(jié)，且耐藥機制十分復雜[3]。微小核糖核酸（miRNAs）是一類內源性小分子非編碼RNA，主要在轉錄后發(fā)揮基因表達的調控作用，參與多種生理及病理過程[4-5]。相關文獻報道，miR-497和miR-34a與卵巢癌細胞凋亡、侵襲等病理過程密切相關，且多種miRNAs可經不同機制參與EOC細胞鉑耐藥的產生[6-7]。但在此過程中，miRNAs的異常表達受何種方式調節(jié)尚不清楚。DNA甲基化和組蛋白甲基化是表觀遺傳學調控的重要方式，可通過調控不同基因的表達來介導EOC細胞鉑耐藥的產生[8-9]，但其是否影響EOC患者miRNAs的表達目前仍不清楚。本研究旨在探討miR-497和miR-34a在鉑耐藥和鉑敏感EOC患者中表達的差異及機制，并分析其表達水平與EOC患者生存時間的相關性，初步探討miR-497和miR-34a在EOC鉑耐藥中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究方案經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過后，選取2008年1月－2012年1月在我院婦產科診治的EOC患者72例作為研究對象。納入標準：（1）于我院初治的EOC患者；（2）既往無其他惡性腫瘤病史；（3）經卵巢癌分期手術或腫瘤細胞減滅術治療；（4）術中冰凍切片及術后病理檢查確診為EOC；（5）術前未經放、化療及其他方式治療；（6）術后行以鉑類藥物為基礎的規(guī)范化療；（7）有完整的臨床資料和隨訪資料（包括腫瘤復發(fā)時間和總生存期）。排除標準：（1）合并自身免疫性疾病者；（2）肝功能嚴重障礙者；（3）嚴重高血壓及心臟疾病患者；（4）孕婦。

1.2 材料

1.2.1 儀器 QuantStudio?3型實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；T100 Thermal Cycler型PCR儀、Mini-PROTEAN?Tetra手灌膠系統(tǒng)、Mini-PROTEAN?3 DodecaTM小型高通量電泳槽和ChemiDocTM凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；5247R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；SW-CJ-2FD型雙人超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備公司）。

1.2.2 試劑 miRNA提取試劑盒（批號：DP501），miRNA逆轉錄試劑盒（批號：KR201），miR-497、miR-34a和U6（內參）RT-qPCR引物（批號分別為CD201-0441、CD201-0034和CD201-0145）均購自天根生化科技有限公司；AxyPrep基因組DNA小量制備試劑盒（美國AXYGEN公司，批號：AP-MN-MS-GDNA-50G）；DNA甲基化修飾試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司，批號：D5001）；anti-H3K9me2、anti-H3（美國Abcam公司，批號分別為ab1220、ab1791）；辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZDR-5306）；核蛋白和漿蛋白提取試劑盒（批號：KGP150）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（批號：KGP113）均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；蛋白G磁珠（Protein G agarose，美國ThermoFisher公司，批號：88803）；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone公司，pH＝7.4）；甲醛、甲醇、甘氨酸等為分析純。

1.3 方法

1.3.1 治療與分組方法 術后所有患者均參照美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南[10]行以鉑類藥物為基礎的規(guī)范化療，并進行隨訪。隨訪時間為2008年7月－2016年7月，隨訪內容包括：患者對鉑類藥物的敏感性、隨訪終止時患者的總生存時間等。

參照NCCN指南對EOC鉑耐藥和鉑敏感的定義[10]、根據患者對鉑類藥物的敏感性，將其分為鉑耐藥組和鉑敏感組[鉑耐藥：初次接受鉑類藥物化療，停藥后6個月內復發(fā)；鉑敏感：初次接受鉑類藥物化療，停藥后6個月及以上復發(fā)，或不復發(fā)。復發(fā)標準：經CT、磁共振成像（MRI）或多普勒超聲等影像學檢查診斷為EOC復發(fā)]。其中鉑耐藥組患者30例，年齡28～70歲，平均年齡（55.7±7.2）歲；漿液性卵巢癌14例，黏液性卵巢癌10例，子宮內膜樣癌6例；早期（Ⅰ～Ⅱ期）16例，晚期（Ⅲ～Ⅳ期）14例。鉑敏感組患者42例，年齡26～72歲，平均年齡（53.5±6.1）歲；漿液性卵巢癌20例，黏液性卵巢癌12例，子宮內膜樣癌10例；早期（Ⅰ～Ⅱ期）24例，晚期（Ⅲ～Ⅳ期）18例。兩組患者年齡、腫瘤類型和分期比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.3.2 RT-qPCR法檢測miR-497和miR-34a的表達 按照miRNA提取試劑盒說明書提取兩組患者腫瘤組織中的miRNA；按照miRNA逆轉錄試劑盒說明書將miRNA逆轉錄為cDNA；以cDNA為模板進行RT-qPCR分析。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PCR擴增反應線性梯度良好、熔解曲線峰形單一則表明特異性良好。以內參U6的表達水平為參照，按照2－ΔΔCt法分析待測miRNA的表達水平，ΔΔCt＝（Ct待測物－Ct內參）（Ct值表示每個反應管內熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環(huán)數）。

1.3.3 巢式降落式甲基化特異性PCR（nt-MSP）法檢測miR-497和miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化水平 按照AxyPrep基因組的DNA小量制備試劑盒說明書操作，提取兩組患者的DNA；在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）和Ensembl網站（http：//asia.ensembl.org/index.html）查找miR-497和miR-34a的啟動子區(qū)；使用在線甲基化引物設計網 站 （http：//www.urogene.org/cgi- bin/methprimer/ methprimer.cgi）預測miR-497和miR-34a啟動子區(qū)CpG島含量及CpG島分布情況，并設計外引物和內引物（甲基化和非甲基化引物）（見表1）。采用DNA甲基化修飾試劑盒和亞硫酸鹽修飾法對DNA進行甲基化修飾，采用nt-MSP法檢測其miR-497和miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化水平的改變。外引物擴增反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共20個循環(huán)，每個循環(huán)下降0.5℃，直至達到退火溫度（Tm），72℃再延伸5 min。繼續(xù)以其PCR產物為模板，進行內引物的擴增反應，條件同外引物。取PCR產物5 μL于2%瓊脂糖凝膠上電泳，于凝膠成像系統(tǒng)上成像，分析其甲基化條帶的吸光度（OD甲）值和非甲基化條帶的吸光度（OD非）值，甲基化水平＝OD甲/（OD甲+OD非）。

1.3.4 蛋白印跡法檢測組蛋白H3第9位賴氨酸殘基二甲基化（H3K9me2）水平 采用核蛋白和漿蛋白提取試劑盒提取兩組患者核蛋白，采用二辛可寧酸（Bicincho-ninic acid，BCA）法進行蛋白定量。取核蛋白樣品10 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳，切取相應位置的凝膠進行半干轉膜，轉膜后采用5%脫脂奶粉封閉2 h，與anti-H3K9me2或anti-H3混合，于4℃下孵育過夜。洗膜后與HRP標記二抗混合，于室溫下孵育2 h，置凝膠成像系統(tǒng)上成像，并分析條帶灰度值。以anti-H3為內參，計算H3K9me2與H3灰度值的比值，考察H3K9me2水平。

表1 miR-497和miR-34a的nt-MSP引物Tab 1 nt-MSPprimers of miR-497 and miR-34a

1.3.5 染色質免疫共沉淀法檢測miR-497和miR-34a啟動子區(qū)H3K9me2水平 將患者EOC組織勻漿后，以質量分數為1%的甲醛于室溫下固定10 min，以終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸中止交聯（室溫水平輕微搖動5 min）。離心后盡量吸盡上清液，用冷PBS沖洗2次。以SDS裂解液重懸組織沉淀，超聲（25 Hz，超聲15 s，間隔50 s，重復10次）使DNA破碎為100～1 000 bp大小的片段。以離心半徑6 cm、轉速12 000 r/min離心15 min后取上清液100 μL，加入anti-H3K9me2 4 μL，于24℃下孵育過夜，經蛋白G瓊脂糖珠沉淀后，于65℃水浴中解交聯。以純化后的DNA為模板，對miR-497和miR-34a啟動子區(qū)進行PCR擴增反應。所用引物：上游5′-TTGCCCCACACACTCGAGTG-3′、下游5′-CTCGCAGCCTTTGCCAATTA-3′（miR-497）；上游5′-TTAGAGATTTAAACCGTGAAATGAT-3′、下游5′-TCCTACAACCTAGGTACTCTGGTAC-3′（miR-34a）。反應體系及條件、計算方法同“1.3.2”項。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計量資料以s表示，組間比較采用非配對Student’s t檢驗；相關性分析采用直線相關檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者miR-497和miR-34a的表達水平比較

鉑敏感組患者miR-497和miR-34a的表達水平（1.29±0.51和1.29±0.43）顯著高于鉑耐藥組（0.58± 0.40和0.59±0.27），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），詳見圖1。

2.2 miR-497和miR-34a表達水平與EOC患者總生存時間的相關性分析

圖1 兩組患者miR-497、miR-34a表達水平比較Fig 1 Comparison of miR-497 and miR-34a expression levels between 2 groups

隨訪結果顯示，72例患者的總生存時間為（45.7± 17.5）個月，且其miR-497和miR-34a表達水平與總生存時間呈正相關（r2分別為0.271 4、0.378 2，P＜0.01），詳見圖2。

2.3 兩組患者miR-497和miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化水平比較

圖2 miR-497和miR-34a表達水平與EOC患者總生存時間的相關性分析Fig 2 The correlation analysis of miR-497 and miR-34a expression levels with overall survival period of EOC patients

鉑耐藥組患者miR-497和miR-34a啟動子區(qū)甲基化水平[（0.67±0.17）和（0.57±0.22）]均顯著高于鉑敏感組患者[（0.37±0.18）和（0.32±0.20）]，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），詳見圖3、圖4。

2.4 兩組患者H3K9me2水平比較

圖3 兩組患者miR-497和miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化電泳圖Fig 3 DNA methylation electrophorogram of miR-497 and miR-34a promoter regions of 2 groups

與鉑敏感組患者（0.38±0.21）比較，鉑耐藥組患者H3K9me2水平（0.46±0.18）雖有上升趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見圖5、圖6。

2.5 兩組患者miR-497和miR-34a啟動子區(qū)H3K9me2水平比較

圖4 兩組患者miR-497和miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化水平比較Fig 4 Comparison of DNA methylation levels in miR-497 and miR-34a promoter regions between 2 groups

圖5 兩組患者H3K9me2凝膠成像圖Fig 5 H3K9me2 gel imaging of 2 groups

圖6 兩組患者H3K9me2水平比較Fig 6 Comparison of H3K9me2 levels between 2 groups

鉑耐藥組患者miR-497和miR-34a啟動子區(qū)H3K9me2水平[（0.61±0.28）和（0.58±0.25）]顯著高于鉑敏感組患者[（0.37±0.22）和（0.45±0.30）]，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見圖7。

3 討論

圖7 兩組患者miR-497和miR-34a啟動子區(qū)H3K9me2水平比較Fig 7 Comparison of H3K9me2 levels of miR-497 and miR-34a promoter regions between 2 groups

EOC發(fā)病隱匿、進展迅速，是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，每年可導致全球125 000人死亡[11]。至少約20%的EOC患者對一線化療藥物天然耐藥，而化療耐藥是導致EOC治療失敗、腫瘤復發(fā)和病死率居高不下的重要因素之一[12]。因此，尋找EOC癌細胞耐藥的靶點，闡明其耐藥機制是目前亟待解決的問題。

既往關于EOC耐藥的研究多集中于DNA和蛋白水平，隨著分子生物學技術的發(fā)展，miRNAs受到越來越多的關注。miRNAs是一類內源性的單鏈非編碼RNA，長約22個核苷酸，主要通過與靶信使RNA（Message RNA，mRNA）3′UTR區(qū)結合、抑制其降解和翻譯等方式來發(fā)揮抑制基因表達的作用[13]。miRNAs具有重要的生理學功能，其表達異?？蓪е露喾N疾病的發(fā)生與發(fā)展[4-5]。miRNAs可通過不同機制或通路來誘導癌細胞耐藥的產生：Liu J等[14]研究表明，miR-30a-5p高表達可增強癌細胞生長和集落形成能力，促進癌細胞遷移和侵襲，并與卵巢癌細胞耐藥密切相關；Zhu H等[15]研究表明，miR-17-92高表達和miR-134低表達可導致其靶基因表達發(fā)生改變，介導卵巢癌細胞耐藥的產生；Wu DD等[16]研究表明，miR-873通過靶向調節(jié)三磷酸腺苷結合盒轉運子B亞家族成員1（ABCB1）的表達水平來介導卵巢癌細胞的多重耐藥。由此可見，miRNAs的異常表達可能導致卵巢癌細胞耐藥。相關文獻報道，miR-497可通過靶向調節(jié)配對盒2（Paired box 2，PAX2）抑制卵巢癌細胞增殖并誘導其凋亡[6]；miR-34a可通過直接靶向調節(jié)鋅指轉錄因子（Snail）來抑制上皮細胞向間充質細胞轉化、癌細胞侵襲和癌細胞團形成的能力[7]。但miR-497和miR-34a在鉑敏感和鉑耐藥EOC患者中的表達尚不清楚。本研究結果顯示，鉑耐藥組患者miR-497和miR-34a的表達水平顯著低于鉑敏感組，且其表達與EOC患者總生存時間呈正相關，提示miR-497和miR-34a可能在EOC鉑耐藥中發(fā)揮作用。

DNA甲基化是指基因組內CpG島二核苷酸的胞嘧啶被甲基所修飾，從而在不改變基因結構的基礎上調控基因的表達，是真核生物中一種常見的堿基共價修飾過程[17]。組蛋白甲基化是指發(fā)生在組蛋白H3和H4氮端賴氨酸或精氨酸殘基上的甲基化，其功能主要體現在轉錄調控、異染色質形成和基因印記等方面，是表觀遺傳學的重要調控方式，依據組蛋白甲基化位點的不同而呈現不同的生物學效應，如組蛋白H3K4位點的甲基化可以導致基因活化，而H3K9二甲基化修飾則是基因沉默的標志[18]。有文獻報道，表觀遺傳學機制在卵巢癌天然耐藥和獲得性耐藥中發(fā)揮了重要作用，藥物治療可逆轉異常的表觀遺傳狀態(tài)，因此，正常表觀遺傳狀態(tài)的維持可能成為逆轉卵巢癌細胞耐藥的潛在靶點[19]。研究表明，與鉑敏感卵巢癌細胞系比較，鉑耐藥組酵母錯配修復基因人同源物（hMLH1）啟動子區(qū)DNA甲基化水平升高，組蛋白甲基化酶（EZH2）在鉑耐藥細胞系A2780/DDP中的表達高于鉑敏感細胞系A2780[20]。由于miR-497和miR-34a啟動子區(qū)CpG位點豐富，且DNA甲基化和組蛋白甲基化具有協同作用，因此，DNA甲基化和組蛋白甲基化可能參與了miR-497和miR-34a表達的調控。本研究結果顯示，miR-497和miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化和H3K9me2水平均顯著升高，提示表觀遺傳學修飾可能影響了miR-497和miR-34a的表達。

綜上所述，miR-497和miR-34a在EOC鉑耐藥中發(fā)揮著作用，且與EOC患者總生存時間呈正相關；啟動子區(qū)DNA甲基化和組蛋白甲基化可能參與調控miR-497和miR-34a的表達。本研究從miRNAs的DNA甲基化和組蛋白甲基化角度出發(fā)，初步探討了EOC鉑耐藥的機制，為EOC鉑耐藥提供了干預靶點，但EOC鉑耐藥機制復雜，仍有待后續(xù)深入研究。

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（編輯：張元媛）

Expression Difference and Its Mechanisms of miR-497 and miR-34a in Platinum-sensitive and Platinum-resistant Epithelial Ovarian Carcinoma Patients

CAO Lijuan，LIU Wenbo（Dept.of Gynaecology and Obstetrics，Chengde Municipal Central Hospital，Hebei Chengde 067000，China）

OBJECTIVE：To investigate the expression difference and its mechanism of miR-497 and miR-34a in platinum-sensitive and platinum-resistant epithelial ovarian carcinoma（EOC）patients.METHODS：A total of 72 EOC patients underwent ovarian cancer staging surgery or cytoreductive surgery were selected from department of gynaecology and obstetriscs of our hospital during Jan.2008-Jan.2012.They

standardized platinum chemotherapy after surgery and were followed up（during Jul.2008-Jul.2016）.According to the sensitivity to platinum，those patients were divided into platinum-sensitive group（42 cases）and platinum-resistant group（30 cases）.Real-time fluorescent quantitative PCR was adopted to detect the expression of miR-497 and miR-34a in tumor tissue，and the relationship of it with total survival period was investigated.The levels of DNA methylation of miR-497 and miR-34a promoter region were determined by nest type land type methylation specific PCR.Western blot assay was used to detect the H3K9 dimethylation（H3K9me2）levels.The H3K9me2 levels of miR-497 and miR-34a promoter region were determined by chromatin immunoprecipitation method.RESULTS：The expression levels of miR-497 and miR-34a in platinum-sensitive group were significantly higher than platinum-resistant group，with statistical significance（P＜0.05）.Total survival period of 72 patients was（45.7±17.5）months，which was positively correlated with the expression levels of miR-497 and miR-34a（r2were 0.271 4，0.378 2，P＜0.01）.The DNA methylation of miR-497 and miR-34a promoter region in platinum-resistant group was significantly higher than platinum-sensitive group，and H3K9me2 level of promoter region was significantly higher than platinum-sensitive group，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.H3K9me2 levels of platinum-resistant group were slightly higher than that of platinum-sensitive group，but there was no statistical significance（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The expression of miR-497 and miR-34a in tumor tissue of EOC patients are related to the sensitivity of platinum chemotherapy and the survival time of patients.DNA methylation and histone methylation of promoter region may be one of the mechanisms of their expression changes.

MicroRNAs；miR-497；miR-34a；Epithelial ovarian cancer；Platinum resistant；DNA methylation；Histone methylation；Promoter region

R737.31

A

1001-0408（2017）17-2308-06

2016-09-27

2017-04-20）

＊副主任醫(yī)師。研究方向：婦科腫瘤。電話：0314-2028107。E-mail：18603140900@wo.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.17.02