趙 健, 胡劭驥, 和秋菊, 易傳輝, 和 菊, 馮志偉, 楊建華, 陳 鵬

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650223；3.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201)

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基于線粒體COⅠ和ND1基因分析三尾鳳蝶遺傳多樣性

趙 健1, 胡劭驥2, 和秋菊1, 易傳輝3, 和 菊3, 馮志偉3, 楊建華3, 陳 鵬3

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650223；3.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201)

以云南和四川分布的3個(gè)種群(云南麗江種群、云南東川種群、四川種群)共36頭三尾鳳蝶為研究對(duì)象，選取線粒體COⅠ和ND1基因作為分子標(biāo)記，對(duì)三尾鳳蝶的遺傳多樣性進(jìn)行了研究.結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增測(cè)得COⅠ和ND1基因聯(lián)合序列長(zhǎng)度為1 913 bp，A+T含量為74.3%，表現(xiàn)出明顯的A/T堿基偏向性；共檢測(cè)到4個(gè)變異位點(diǎn)，定義了5個(gè)單倍型，其中，Ha1出現(xiàn)的頻率較高，為共享單倍型.核苷酸和單倍型多樣性指數(shù)分別為0.000 2和0.218 0；遺傳分化系數(shù)(Gst)、固定系數(shù)(Fst)、基因流(Nm)和遺傳距離分別為0.059 98、0.059 95、3.920 00和0.分析顯示，三尾鳳蝶遺傳多樣性低，各地理種群基因交流頻繁，沒有形成明顯分化.

三尾鳳蝶; 線粒體；COⅠ; ND1; 遺傳多樣性; 遺傳分化

三尾鳳蝶(BhutanitisthaidinaBlanchard)，屬鱗翅目鳳蝶科尾鳳蝶屬Bhutanitis，多生活于海拔2 000 m以上的山區(qū)，主要分布在中國(guó)橫斷山及其周邊地區(qū)，具有很高的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和觀賞價(jià)值，是世界珍稀物種.世界自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN)在《受威脅的世界鳳蝶》中將其列為R級(jí)，瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)附錄Ⅱ保護(hù)物種，現(xiàn)已為瀕危物種[1].因此，加強(qiáng)對(duì)該物種保護(hù)已迫在眉睫.

一個(gè)物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力主要取決于其群體內(nèi)部的遺傳多樣性和相應(yīng)的遺傳結(jié)構(gòu)[2].遺傳多樣性是目前保護(hù)生物學(xué)研究的核心內(nèi)容之一，只有在充分了解物種遺傳結(jié)構(gòu)與多樣性的前提下，才能制定有效的保護(hù)策略[3-4].目前，有關(guān)三尾鳳蝶的研究不多，主要涉及其分布、生物學(xué)和生態(tài)特性、瀕危原因與保護(hù)策略等[5-8].諸立新等[9]對(duì)尾鳳蝶屬部分種類的分子系統(tǒng)關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)曾涉及到三尾鳳蝶，并對(duì)四川蘆山、云南東川和云南高貢山3個(gè)種群的COⅠ基因序列差異進(jìn)行了分析；但尚未見有關(guān)三尾鳳蝶遺傳多樣性方面的報(bào)道.

線粒體DNA(mitochondria DNA， mtDNA)因其母系遺傳、進(jìn)化速率快、拷貝數(shù)多等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于昆蟲的系統(tǒng)進(jìn)化及種群遺傳變異研究[10-12].本研究以三尾鳳蝶mtDNACOⅠ和ND1基因作為分子標(biāo)記，對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期為該物種的保護(hù)提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

三尾鳳蝶分別采自云南省和四川省，共36頭.為方便研究，根據(jù)分布地距離，分為3個(gè)地理種群.樣本采集后，立即將其一側(cè)的中后足取下，放入裝有無(wú)水乙醇的離心管中并標(biāo)記，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫瑯?biāo)本信息見表1.

表1 三尾鳳蝶樣本采集信息

1.2 DNA提取

將足移入1.5 mL的離心管中，加入1 000 μL STE緩沖液，在干式恒溫器中37 ℃加熱1 h，去除離心管中的緩沖液，重新加入200 μL STE緩沖液；用小剪刀將足剪碎，加入4 mL蛋白酶K；干式恒溫器中37 ℃處理5 min，95 ℃加熱15 min，每隔5 min震蕩一次，待樣本溫度回到室溫后離心(4 000 r·min-1)，-40 ℃冰箱保存待用.

1.3 PCR反應(yīng)與測(cè)序

參照Aubert et al[13]、Simon et al[14]和Sperling et al[15]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增.COⅠ引物序列：(Jerry)COⅠ-F為5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′，(Pat2)COⅠ-R為5′-TCCATTACATATAATCTGCCATATT-3′， (Djernaes)COⅠ-R為5′-GC TATTATAGCATA AATTATTCC-3′；ND1引物序列：ND1-F為5′-ATCAAAAGGAGCTCGATTAGTTTC-3′，ND1-R為5′-CGTAAAGTCCTAGGTTATATTCAGATTCG-3′.反應(yīng)體系為25 μL:模板DNA 1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL,ExTaqDNA聚合酶0.25 μL,濃度均為2.5 mmol·L-1，10 mmol·L-1dNTP Mix和25 mmol·L-1MgCl2各2.0 μL，10×Loading Buffer 2.5 μL.擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性94 ℃ 1 min，退火50 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃ 5 min.反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2.4 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)(電壓150 V，電泳緩沖液為0.5×TBE)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄.確定成功擴(kuò)增出目標(biāo)片斷后，送上海賽音生物技術(shù)有限公司完成雙向測(cè)序工作.本研究中COⅠ與ND1所使用反應(yīng)體系一致.

1.4 數(shù)據(jù)分析

從NCBI網(wǎng)站中通過(guò)BLAST同源檢索確認(rèn)所測(cè)樣本的COⅠ和ND1基因序列.將校對(duì)后的測(cè)序結(jié)果通過(guò)BioEdit 7.0.9軟件中的Clustal W功能進(jìn)行逆向互補(bǔ)校對(duì)，并對(duì)序列進(jìn)行手工矯正和剪切；利用MEGA 5.0對(duì)整理好的序列進(jìn)行概念翻譯，基于Kimura-2參數(shù)對(duì)序列特征、群體間遺傳距離(P-distance)和遺傳差異進(jìn)行分析[16-17].應(yīng)用DnaSP 5.0軟件分析計(jì)算三尾鳳蝶各地理種群間單倍型多樣性(haplotype diversity,Hd)、核苷酸平均差異數(shù)(average number of nucleotide differences,K)、種群間核苷酸平均差異數(shù)(average number of nucleotide differences between populations,Kxy)、核苷酸歧義度(average number of nuc. subs. Per site between population,Dxy)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,Pi)、固定系數(shù)(fixation indices,Fst)、遺傳分化系數(shù)(coefficient of genetic differentiation,Gst)及基因流(gene flow,Nm)等分子遺傳學(xué)系數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行Tajima′sD和Fu′s Fs中性檢驗(yàn)[18].參照Clement et al[19]的方法，采用TCS 1.2.1軟件對(duì)線粒體部分基因序列進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化分析，構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，簡(jiǎn)約上限默認(rèn)值為95%.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因特征

去除測(cè)序結(jié)果兩端側(cè)翼序列，得2段三尾鳳蝶COⅠ序列，長(zhǎng)度分別為658和775 bp，ND1序列長(zhǎng)度480 bp，整合COⅠ和ND1序列后，得總長(zhǎng)度為1 913 bp. 4種核苷酸的平均含量：T為39.6%，C為13.8%，A為34.7%，G為11.9%.A+T含量為74.3%，表現(xiàn)出明顯的A/T堿基偏向性.

2.2 遺傳多樣性分析

線粒體聯(lián)合基因序列中，僅TH03、TH04、TH11和TH14樣本之間有1～2個(gè)堿基位點(diǎn)的變異，其余序列完全相同.共定義5個(gè)單倍型，標(biāo)記為Ha1、Ha2、Ha3、Ha4和Ha5.其中，Ha1出現(xiàn)的頻率較高，為云南麗江種群、東川種群和四川種群的共享單倍型；Ha2、Ha3為獨(dú)享單倍型，僅在云南麗江種群中出現(xiàn)；Ha4、Ha5為四川種群的獨(dú)享單倍型(表2).共發(fā)現(xiàn)4個(gè)變異位點(diǎn)，約占全長(zhǎng)的0.2%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)3個(gè)，約占全長(zhǎng)的0.16%；自裔位點(diǎn)1個(gè)，未發(fā)現(xiàn)有核苷酸的替換.核苷酸差異數(shù)K為0.390，種群間核苷酸差異數(shù)Kxy為0.398 50～0.561 40；核苷酸歧義度Dxy介于0.000 21～0.000 29之間；單倍型多樣性Hd為0.218，核苷酸多樣性Pi為0.000 2(表3).各地理種群總遺傳分化系數(shù)Gst為0.059 98，總固定系數(shù)Fst為0.059 95，總基因流Nm為3.92.中性檢測(cè)Tajima′sD值為-1.476 50， Fu′s Fs為-3.059(表3)，差異不顯著(P>0.10).多樣性分析表明，三尾鳳蝶遺傳多樣性低.

表2 三尾鳳蝶不同地理種群線粒體基因單倍型在群體中的分布

表3 三尾鳳蝶3種地理種群部分線粒體基因的遺傳多樣性與中性檢驗(yàn)

2.3 遺傳分化

2.3.1 遺傳距離 采用MEGA 5.0軟件基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型，計(jì)算三尾鳳蝶各地理種群間的遺傳距離.結(jié)果顯示，三尾鳳蝶云南和四川各種群間的遺傳距離均約為0.000，總體遺傳距離為 0.

2.3.2 單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系 由TCS軟件構(gòu)建了一個(gè)連續(xù)的三尾鳳蝶單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖1).各單倍型未表現(xiàn)明顯的地理區(qū)域聚類關(guān)系，其中，單倍型Ha1為所有單倍型聚類的起點(diǎn).

單倍型之間的連接代表突變差異；未標(biāo)記的節(jié)點(diǎn)表示推斷出來(lái)的突變步驟，且未在樣品中實(shí)際觀察到；回路結(jié)構(gòu)是趨同進(jìn)化的結(jié)果.

3 討論

對(duì)三尾鳳蝶線粒體DNACOⅠ和ND1序列分析顯示，單倍型少，核苷酸多樣性較低，表明三尾鳳蝶的遺傳多樣性低，與諸立新等[9]的結(jié)論一致；Fst是表明不同種群間遺傳分化的重要參數(shù)，其值越大表明種群間的分化程度越高[20].DNACOⅠ和ND1序列Fst為0.059 95，表明三尾鳳蝶遺傳分化水平較低.遺傳距離和基因流表明，各種群間基因交流頻繁.

棲息地喪失、退化與破碎化是導(dǎo)致物種消失的根本原因[21-24].棲息地的片斷化，導(dǎo)致個(gè)體在適宜棲息地斑塊間的遷移變得更加困難，種群規(guī)模縮小，斑塊間基因流減少，種群內(nèi)部近交和遺傳漂變導(dǎo)致遺傳多樣性下降，從而引起適合度下降，最終導(dǎo)致局部滅絕[22，25-26].物種本身遺傳多樣性喪失帶來(lái)的問題也不容忽視.物種遺傳多樣性高低與其進(jìn)化潛力、環(huán)境適應(yīng)能力緊密相關(guān)，較高的遺傳多樣性對(duì)物種在遭受環(huán)境脅迫情況下維持生存繁衍具有重要意義[5,27].本研究顯示，三尾鳳蝶的遺傳多樣性低，表明該物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力較弱，生存和進(jìn)化潛力較小.因此，建議對(duì)三尾鳳蝶所有種群進(jìn)行保護(hù).

由小種群入侵迅速擴(kuò)張建立的種群和進(jìn)化歷史上經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)的物種往往表現(xiàn)為較低的多樣性[28-31].四川和云南分布的三尾鳳蝶3個(gè)種群遺傳多樣性較低，推測(cè)在其進(jìn)化歷史過(guò)程中經(jīng)歷了一次或幾次瓶頸效應(yīng)，現(xiàn)有種群可能由一個(gè)小種群建立并擴(kuò)張而成.諸立新等[9]也認(rèn)為，三尾鳳蝶可能在近期經(jīng)歷過(guò)一次瓶頸效應(yīng).單倍型網(wǎng)絡(luò)分析顯示，Ha1為所有單倍型聚類的起點(diǎn)，該單倍型可能為三尾鳳蝶的祖先類型；該單倍型為四川和云南種群所共享，進(jìn)一步說(shuō)明云南和四川分布的三尾鳳蝶種群可能起源于一個(gè)小的種群，并經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張.三尾鳳蝶以橫斷山為中心分布，并延伸到周邊地區(qū)，分布相對(duì)較廣，南至緬甸北部，北至甘肅、陜西秦嶺，西至西藏東部，東至湖北神龍架和湖南武陵山脈西南端.本研究?jī)H涉及云南和四川種群，整個(gè)三尾鳳蝶種群遺傳多樣性狀況有待進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Genetic diversity ofBhutanitisthaidinaBlanchard, based on mitochondrialCOⅠ and ND1

ZHAO Jian1, HU Shaoji2, HE Qiuju1, YI Chuanhui3, HE Ju3, FENG Zhiwei3, YANG Jianhua3, CHEN Peng3

(1.Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan 650224, China; 2.School of Agriculture, Yunnan University, Kunming, Yunnan 650223, China;3.Yunnan Academy of Forestry, Kunming, Yunnan 650201, China)

Thirty-sixBhutanitisthaidinasamples were collected from 3 geographical populations (YNLJ, YNDC, SC) in Yunnan and Sichuan Provinces, and mitochondrialCOⅠ and ND1 genes were sequenced and analyzed. The results showed that the combined mitochondrialCOⅠ and ND1 fragment were 1 913 bp in length. Base composition of A and T was 74.3%, indicating a strong A+T bias. A total of 4 mutation sites and 5 haplotypes including one shared haploid type (Ha1) were detected. The nucleotide and haplotype diversity were 0.000 2 and 0.218 0. Coefficient of genetic differentiation (Gst), fixation indices (Fst), gene flow (Nm) and genetic distance were 0.059 98, 0.059 95, 3.920 00 and 0, respectively. The results indicated low genetic diversity and an extensive gene flow among differentB.thaidinapopulations， and gene differentiations were not found among all populations.

Bhutanitisthaidina; mitochondria；COⅠ; ND1; genetic diversity; gene differentiation

2016-09-21

2017-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260527);云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目(2013HB093);云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(ZK150005).

趙健(1990-)，男，碩士研究生.研究方向:蝴蝶多樣性.Email:a540648169@qq.com.通訊作者易傳輝(1970-),男,副研究員,博士.研究方向:昆蟲生態(tài)、資源昆蟲培育與利用.Email:ynkcx2007@163.com.

Q963

A

1671-5470(2017)04-0387-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.04.004