楊玉琪

摘要：顆粒酶是細(xì)胞毒細(xì)胞發(fā)揮作用的效應(yīng)蛋白之一。本文綜述了顆粒酶的分子生物學(xué)特性，顆粒酶在ⅧV感染中的作用，及中醫(yī)藥的免疫調(diào)節(jié)對顆粒酶作用的研究進展。

關(guān)鍵詞：顆粒酶；HIV感染；細(xì)胞毒細(xì)胞

中圖分類號：R512.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）03-0089-02

在HIV感染中，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxie T Lym-phoeyte，CTL）和自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK）介導(dǎo)的細(xì)胞毒性對于抑制HIV復(fù)制、延緩疾病進展發(fā)揮重要作用。顆粒酶是細(xì)胞毒性細(xì)胞所具有的重要效應(yīng)分子之一，在病毒感染的病原清除和靶細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。本文將顆粒酶在HIV感染中的作用研究進展作一綜述。

1顆粒酶的分子生物學(xué)特性

顆粒酶是存在于細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞胞漿顆粒的一組同源性的絲氨酸蛋白酶（serine protease），與穿孔素（pore-formingprotein，PFP）一起儲存于胞漿顆粒中，并一起通過胞吐作用釋放至靶細(xì)胞間隙，協(xié)同作用致靶細(xì)胞損傷。人顆粒酶包括顆粒酶A、B、K、H等，與疾病相關(guān)的免疫效應(yīng)關(guān)系較密切的是顆粒酶A（granzyme A，GzmA）、顆粒酶B（gaanzyme B，GzmB），尤以GzmB為最多見且極具價值。

人的GzmA基因定位于5號染色體上，GzmA分子是Ha-nuka因子cDNA編碼產(chǎn)物，由兩個分子量為27KD的單體通過二硫化合物連接成50KD的同源二聚體，具有類胰蛋白酶的性質(zhì)，在體內(nèi)能緩慢引起靶細(xì)胞DNA斷裂。人的GzmB基因定位于14號染色體上，GzmB是人類淋巴細(xì)胞蛋白酶（HLP）cD-NA編碼的產(chǎn)物，分子量有30KD、32KD、35KD 3種形式，經(jīng)葡萄糖苷酶水解后均剩下一個27KD的蛋白核心，說明3種形式的GzmB是同一蛋白帶有不同的糖基。GzmB具有門冬氨酸酶的活性，是主要效應(yīng)分子，能迅速引起靶DNA斷裂，作用強于GzmA。

活化的CTL和NK細(xì)胞是機體細(xì)胞毒細(xì)胞，能清除機體內(nèi)的病毒感染細(xì)胞、胞內(nèi)菌、腫瘤細(xì)胞并介導(dǎo)移植排斥反應(yīng)、自身免疫病和移植物抗宿主病。顆粒酶是活化的CTL和NK細(xì)胞的效應(yīng)分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GzmA、GzmB含量最豐富，表達(dá)上亦早于其它顆粒酶。GzmA主要誘導(dǎo)一種easpases非依賴性的細(xì)胞凋亡，它通過顆粒的胞吐作用釋放，在PFP協(xié)同作用下進入靶細(xì)胞的細(xì)胞漿中，并聚集在細(xì)胞核，通過裂解SET復(fù)合物釋放的脫氧核糖核酸酶NM23-H1對染色體DNA形成單股DNA鏈切（缺）口而引起DNA斷裂，最終引起靶細(xì)胞的凋亡。GzmB最初以酶原的形式合成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加工去除N端信號肽后，貯存于CTL的顆粒中。當(dāng)CTL識別靶細(xì)胞時，GzmB N端的酸性二肽被切除，成為活性形式?；钚孕虶zmB可通過穿孔素或受體進入靶細(xì)胞，切割含Asp-X，Glu-X位點的多種結(jié)構(gòu)和功能蛋白，引起細(xì)胞凋亡。

2顆粒酶在HIV感染中的作用

人體感染了HIV后很快建立了特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)以清除病毒。特異性的中和抗體可以迅速中和細(xì)胞外病毒，阻止其侵入易感細(xì)胞及在體內(nèi)擴散，但無法殺死細(xì)胞內(nèi)病毒，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可通過溶解病毒感染細(xì)胞或分泌抗病毒因子殺滅細(xì)胞內(nèi)病毒。因此，細(xì)胞免疫反應(yīng)在人體抵御病毒感染中起著中心和基礎(chǔ)的作用。細(xì)胞免疫反應(yīng)主要包括由NK細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)和由CD₈⁺的CTL介導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)，二者構(gòu)成了機體防御病毒感染和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的主要機制。

在HIV感染中，由CTL和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性對于抑制HIV復(fù)制、延緩疾病進展發(fā)揮著重要作用，HIV特異性CTL在特異性抗體產(chǎn)生前即能檢測到，能有效降低病毒載量，早期CTL反應(yīng)的強弱直接影響HIV感染后進展為艾滋病的時間；NK細(xì)胞是機體抵御HIV和機會性感染的第一道防線。文獻(xiàn)報道，CTL和NK細(xì)胞數(shù)量異常存在于艾滋病疾病進程的不同階段，但其功能損傷機制及評價指標(biāo)尚無定論。CTL和NK細(xì)胞對HIV的控制都主要通過顆粒胞吐途徑溶解病毒感染細(xì)胞，顆粒酶是這一機制中重要的效應(yīng)分子之一。

顆粒酶的釋放是CTL特異殺傷的基礎(chǔ)，活化的CTL通過特異識別靶細(xì)胞，含有顆粒酶的胞漿分泌顆粒在CTL內(nèi)重新定位于靶細(xì)胞接觸的細(xì)胞膜位點，然后將顆粒酶和穿孔素分泌到細(xì)胞間隙。細(xì)胞毒細(xì)胞的活化過程伴隨有顆粒酶的合成產(chǎn)生過程，CTL識別靶細(xì)胞后，一方面以細(xì)胞排粒的方式分泌顆粒酶，一方面又迅速合成顆粒酶，新合成的顆粒酶既能直接持續(xù)分泌到細(xì)胞外，又能“再充入”胞漿顆粒中貯存起來，以供殺傷下一個靶細(xì)胞。

HIV特異性CD₈⁺T淋巴細(xì)胞能控制HIV的復(fù)制，延緩疾病進程，這與HIV特異性CD₈⁺T淋巴細(xì)胞利用PEP和GzmB或CD95L直接殺傷被HIV-1感染的細(xì)胞，從而清除感染原密切相關(guān)。北京協(xié)和醫(yī)院李太生教授等研究發(fā)現(xiàn)，CD₈⁺T淋巴細(xì)胞在對HIV病毒的控制中不能單純起作用，而是受抗HIV特異性CD₄⁺T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的指揮。麻省普科醫(yī)院理根研究所和哈佛大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)HIV特異性CD₄⁺T淋巴細(xì)胞應(yīng)答具有細(xì)胞殺傷活性，可破壞HIV感染的巨噬細(xì)胞，而CD₄⁺T淋巴細(xì)胞應(yīng)答受到GzmA表達(dá)的支配。HIV特異性CD₄⁺T淋巴細(xì)胞或CD₈⁺T淋巴細(xì)胞發(fā)揮其抗HIV生物活性與GzmA、GzmB有關(guān)。

NK細(xì)胞的主要功能就是通過多種機制溶解殺傷靶細(xì)胞。GzmB是NK細(xì)胞釋放的胞漿顆粒，可以與PEP配合溶解靶細(xì)胞或介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。周方圓等用流式細(xì)胞儀檢測了未經(jīng)HAART治療的CD₄⁺T細(xì)胞高和低兩組HIV感染者外周血NK細(xì)胞及各亞群IFN-γ、CD107a和GzmB的表達(dá)情況，結(jié)果CD₄⁺T細(xì)胞高組NK細(xì)胞及各亞群分泌IFN-γ和CD107a的水平較HIV抗體陰性對照組高，GzmB釋放百分比高于HIV抗體陰性對照組和CD₄⁺T細(xì)胞低組，其IFN-γ⁺NK細(xì)胞百分比與病毒載量呈顯著負(fù)相關(guān)。提示NK細(xì)胞功能增強可能是控制HIV感染疾病進程的因素之一。

3中醫(yī)藥的免疫調(diào)節(jié)對顆粒酶的作用

臨床觀察表明中醫(yī)藥可調(diào)節(jié)艾滋病患者的免疫功能，改善患者的臨床癥狀，提高患者的生存質(zhì)量。對其免疫調(diào)節(jié)作用進一步研究發(fā)現(xiàn)：中醫(yī)藥治療可明顯增強艾滋病患者HIV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答強度，這可能是中藥治療艾滋病調(diào)節(jié)免疫作用機制之一。但目前中醫(yī)藥增強HIV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答是否與GzmA、GzmB相關(guān)國內(nèi)無報道。李曼等用由女貞子，早蓮草等組成的補腎方治療慢性乙型肝炎，患者經(jīng)補腎方治療6個月后，其CD₈⁺T細(xì)胞表達(dá)的GzmB降低，提示中醫(yī)藥可減少T細(xì)胞免疫效應(yīng)分子的表達(dá)。錢潔玉等探討了益艾康含藥血清對人自然殺傷細(xì)胞增殖及其效應(yīng)分子顆粒酶基因表達(dá)的影響，不同濃度的益艾康含藥血清均能夠促進NK-92MI細(xì)胞增殖，增強NK-92MI細(xì)胞毒功能，其機制可能與上調(diào)顆粒酶基因的表達(dá)有關(guān)。李曉楠等觀察了中藥黃芩的主要活性成分漢黃芩素對人外周血單個核細(xì)胞CD3AK細(xì)胞增殖及對肝癌細(xì)胞SMMC-7721殺傷活性的影響，結(jié)果漢黃芩素在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進CD3AK細(xì)胞增殖，增強其對肝癌細(xì)胞SMMC-7721的殺傷活性，抑制SMMC-7721細(xì)胞生長、遷移和細(xì)胞的融合。漢黃芩素促進CD3AK細(xì)胞增殖和功能改變可能與上調(diào)CD3AK細(xì)胞表面GzmB的表達(dá)有關(guān)。上述這些研究報道提示中醫(yī)藥的免疫調(diào)節(jié)作用與顆粒酶有關(guān)。

4小結(jié)

免疫系統(tǒng)是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，任何環(huán)節(jié)都是相關(guān)聯(lián)的，在HIV感染的情況下，其復(fù)雜性更加難以想象，正是這種復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)，為中藥抗HIV/AIDS的研究提供了可能。闡明中醫(yī)藥對HIV感染者機體免疫調(diào)節(jié)作用是中醫(yī)藥治療艾滋病的臨床應(yīng)用所需，而目前安全、科學(xué)、規(guī)范地開展中醫(yī)藥治療艾滋病改善機體免疫作用機制方面研究仍存在較大的困難。研究中醫(yī)藥治療的艾滋病患者其外周血中顆粒酶變化情況，不失為一種探索中醫(yī)藥調(diào)節(jié)免疫在艾滋病治療中作用的方法，值得在臨床中進一步探索研究。

（收稿日期：2016-11-15）