侯維海+王建林+旦巴+胡單

摘要：依據(jù)已公布的蕎麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息，從Contig文庫(kù)中獲得了1個(gè)碳酸酐酶（carbonic anhydrase，簡(jiǎn)稱CA）轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增得到CA基因全長(zhǎng)序列。生物信息學(xué)分析表明，基因全長(zhǎng)1 233 bp，開(kāi)放閱讀框978 bp，編碼325個(gè)氨基酸；分子量35.11 ku，等電點(diǎn)7.59；包含9個(gè)α-螺旋、6個(gè)β-折疊、多個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈；含有1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)跨膜區(qū)；具有β-類碳酸酐酶典型的2個(gè)氨基酸保守域。亞細(xì)胞定位顯示，該蛋白出現(xiàn)在葉綠體中的可能性最大。利用同源建模法構(gòu)建了FsCA1三維結(jié)構(gòu)模型，表明甜蕎CA與豌豆CA同型八聚體能很好地匹配，推測(cè)甜蕎CA也是同型八聚體。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在蕎麥不同器官中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，[WTBX][STBX]FsCA1[WTBZ][STBZ] 在葉中表達(dá)水平最高，其次是在莖中，在根中表達(dá)水平最低。

關(guān)鍵詞：西藏甜蕎；碳酸酐酶；基因；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0020-04[HS）][HT9.SS]

碳酸酐酶（carbonic anhydrase，簡(jiǎn)稱CA，EC4.2.1.1）是一類含鋅的金屬酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物等有機(jī)體的組織和器官中[1]。植物中CAs至少包括5個(gè)基因家族（α、β、γ、δ和ε），主要分布在綠色組織中，可逆地催化CO2的水合反應(yīng)，產(chǎn)生HCO-3和H+，參與植物光合CO2的固定、CO2轉(zhuǎn)運(yùn)、呼吸作用、離子交換等生理過(guò)程[2-3]。CA能加快CO2在細(xì)胞內(nèi)的水合速度，有助于CO2運(yùn)輸?shù)交钴S的光合細(xì)胞中，從而提高光合速率；同時(shí)，CA活性隨著葉綠素含量、鋅含量增加而增強(qiáng)，具有明顯提高光合作用的能力，在一定程度上CA活性與光合作用呈正相關(guān)[4-6]。近年來(lái)，前人對(duì)植物CA的研究主要涉及生理生化作用和酶學(xué)特性，而對(duì)編碼該酶基因的組成、結(jié)構(gòu)和功能等尚未形成統(tǒng)一認(rèn)識(shí)；現(xiàn)有研究?jī)H限于少數(shù)幾種植物，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[4，7]、黃頂菊（Flaveria）[8]、玉米（Zea mays）[2]、龍眼（Dimocarpus longan Lour）[9]等，尚未見(jiàn)關(guān)于蕎麥CA基因克隆和表達(dá)分析的報(bào)道。在高等植物中CA主要有3類，即α-CA、β-CA和γ-CA，各種類型之間氨基酸序列保守性較低，同時(shí)每個(gè)亞基因家族又包含多個(gè)成員，其成員亞細(xì)胞定位有較大差異。例如，擬南芥β-CA基因家族有6個(gè)成員（[WTBX][STBX]β-CA1～β-CA6），其中β-CA1、β-CA5定位于葉綠體中，β-CA2、β-CA3、β-CA4定位于細(xì)胞質(zhì)中，β-CA6[WTBZ][STBZ]定位于線粒體中[4-5，10-11]；在黃頂菊屬（Flaveria）中，C3類F. pringlei、C4類F. bidentis的葉片中均分離到3個(gè)不同的[WTBX][STBX]β-CA單體（βCA1～βCA3[WTBZ][STBZ]），這些成員基因之間的序列相似性或保守性超過(guò)90%。CA基因的功能驗(yàn)證在模式植物擬南芥上已取得進(jìn)展，以β-CA基因家族的研究較為深入。有研究發(fā)現(xiàn)，[WTBX][STBX]Atβ-CA1[WTBZ][STBZ]編碼蛋白可發(fā)生巰基亞硝酸化，降低與水楊酸結(jié)合的能力，進(jìn)而影響CA活性，其表達(dá)豐度與擬南芥幼苗存活率相關(guān)[12-13]；同時(shí)Atβ-CA1、Atβ-CA4參與調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞氣孔運(yùn)動(dòng)，是保衛(wèi)細(xì)胞氣孔運(yùn)動(dòng)的上游調(diào)節(jié)因子[14]。但是，關(guān)于其他β-CA的功能目前還不清楚[10]?？傮w而言，在C3植物中，β-CA主要分布在葉綠體葉肉細(xì)胞的基質(zhì)中[7]，可能參與協(xié)助CO2從葉綠體被膜擴(kuò)散或者催化HCO-3快速脫水形成CO2；質(zhì)粒中也存在β-CA，可能與氣孔的關(guān)閉、脂類合成和抗病性有關(guān)[12，15-17]。

甜蕎屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），是一種重要的雜糧兼藥用植物。隨著市場(chǎng)上對(duì)蕎麥需求量的增加，蕎麥育種研究顯得愈發(fā)重要。蕎麥起源于西藏地區(qū)，該區(qū)是世界蕎麥的起源中心之一[18]，屬于低緯度高海拔農(nóng)業(yè)區(qū)，具有全球最典型的立體生境，其地質(zhì)獨(dú)特，地形地貌復(fù)雜，土壤種類繁多，生態(tài)環(huán)境千差萬(wàn)別，產(chǎn)生了豐富的蕎麥變異類型，具有區(qū)域獨(dú)特的蕎麥種質(zhì)。本研究擬以西藏林芝市郊區(qū)野生甜蕎為材料，根據(jù)已公布的甜蕎轉(zhuǎn)錄組Contig文庫(kù)中篩選出的碳酸酐酶轉(zhuǎn)錄本信息，設(shè)計(jì)CA基因的特異引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）獲得蕎麥CA基因全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行生物學(xué)信息分析，初步明確蕎麥CA基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)，為蕎麥抗逆品種的選育提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及其總RNA提取

甜蕎種子于2013年10月在西藏林芝市章麥村（地理位置29°50′N、93°25′E，海拔3 000 m）野外收集，次年4月初，將收集的野生甜蕎種子散播種植于西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院試驗(yàn)田內(nèi)，除人工除草、澆水外，均在自然條件下生長(zhǎng)。在蕎麥5葉期，選取5株健壯植株的幼嫩葉片，作為提取RNA的試驗(yàn)材料。選取材料均設(shè)3次重復(fù)，用清水沖洗5～8次，然后再用吸水紙輕輕吸去水分，立刻置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。[JP]

取新鮮幼葉3.0 g，在液氮保護(hù)中快速研磨成粉末狀，然后按照TRIzol試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）說(shuō)明書介紹的方法提取總RNA，用DNaseⅠ去除RNA中的痕量DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)總RNA的完整性，紫外分光光度計(jì)分析其濃度、純度。

1.2基因全長(zhǎng)序列的克隆

測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST比對(duì)和開(kāi)放閱讀框（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析，用DNAMAN軟件進(jìn)行同源核苷酸和氨基酸序列多重比對(duì)分析，確定克隆序列為[WTBX][STBX]β-CA1[WTBZ][STBZ]。利用在線工具ExPASy Proteomics Server（http：//www.expasy.org）預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，用Psipred Server、SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org）分別對(duì)編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和三級(jí)結(jié)構(gòu)建模。用Scan Prosite（http：//prosite.expasy.org/scanprosite）在線工具預(yù)測(cè)FsCA1編碼蛋白的motif保守序列，并用Signal P4.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測(cè)蛋白定位信號(hào)。用WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org）對(duì)FsCA1進(jìn)行亞細(xì)胞定位，用TMHMM Server v. 2.0軟件（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預(yù)測(cè)跨膜區(qū)。用Clustalx、MEGA5.1[JP]構(gòu)建鄰接（Neighbor-Joining）系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.4蕎麥不同器官中實(shí)時(shí)定量PCR分析

在蕎麥開(kāi)花期，選取葉片、主莖和主根作為試驗(yàn)材料，按照“1.2”節(jié)的cDNA第1鏈合成法分別獲得葉片、主莖和主根cDNA第1鏈，將3種器官的cDNA溶液按倍比稀釋成相同濃度，再按SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒說(shuō)明書操作方法，在CFX-96 PCR儀（Bio-Rad）上進(jìn)行qRT-RCR反應(yīng)，每個(gè)樣品至少重復(fù)3次。反應(yīng)體系20 μL，含10 μL 2×PrimeScript buffer，各1 μL 10 μmol上、下游引物，10 ng cDNA模板。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 15 s，退火溫度56～95 ℃，每個(gè)循環(huán)增加0.5 ℃，持續(xù)20 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。延伸階段搜集信號(hào)，持續(xù)0.05 s獲得解鏈溫度，采集熔解曲線熒光信號(hào)。程序運(yùn)行結(jié)束后，系統(tǒng)自帶的CFX管理軟件根據(jù)設(shè)定的參數(shù)給出結(jié)果。qRT-RCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均為150 bp。以三磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內(nèi)參基因（表1），以葉片中的表達(dá)量為對(duì)照。

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1全長(zhǎng)基因的獲得[HT]

測(cè)序結(jié)果表明，目的基因長(zhǎng)1 233 bp，是正確的CA基因序列。ORF finder預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該序列具有完整的開(kāi)放閱讀框（ORF），長(zhǎng)度為978 bp，編碼325個(gè)氨基酸殘基，詳見(jiàn)圖1。

2.2編碼蛋白的理化性質(zhì)和高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)FsCA1的分子式為C1 574H2 484N412O470S13，分子量 35.11 ku；正電殘基（Arg+Lys）、負(fù)電殘基（Asp+Glu）分別為34、33個(gè)，等電點(diǎn)7.59；不穩(wěn)定指數(shù)為50.78，表明該蛋白不穩(wěn)定；脂肪系數(shù)89.75；親水性系數(shù)0.023。

預(yù)測(cè)FsCA1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有4種類型，由9個(gè)α-螺旋、6個(gè)β-折疊、多個(gè)延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲組成。利用SWISS MODEL蛋白質(zhì)在線建模工具Alignment Model，以蕎麥FsCA1為目標(biāo)序列，以同源性高達(dá)82.38%的豌豆CA蛋白三維結(jié)構(gòu)（POB：1ekj.1.B）為模板進(jìn)行同源建模，建模殘基范圍116～325個(gè)，目標(biāo)序列和模板蛋白序列相似性達(dá)到56%。豌豆CA蛋白為同型八聚體，而FsCA1蛋白三維結(jié)構(gòu)具有豐富的α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲，因此推測(cè)本研究獲得的編碼產(chǎn)物也是同型八聚體（圖2）。

編碼蛋白信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)

Signal P4.0軟件預(yù)測(cè)表明，F(xiàn)sAC1的第1～25位氨基酸殘基間有1個(gè)信號(hào)肽。用WoLF PSORT預(yù)測(cè)表明，該蛋白在葉綠體的定位系數(shù)為12.0（chlo：12），在線粒體的定位系數(shù)為2.0 （mito：2.0），在其他細(xì)胞器官中無(wú)分布。據(jù)此判斷，[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]編碼蛋白最有可能在葉綠體、線粒體內(nèi)發(fā)揮作用，或附著在這些細(xì)胞器上共同完成。HMMTOP分析結(jié)果顯示，第192～214位氨基酸之間有23個(gè)氨基酸形成的跨膜區(qū)。

編碼蛋白的motif分析

β-碳酸酐酶具有2個(gè)典型的保守區(qū)，保守區(qū)H1：C-[SA]-D-S-R-[LIVM]-x-[AP]，保守序列L2[EQ]-[JP3][YF]-A-[LIVM]-x（2）-[LIVM]-x（4）-[LIVMF]（3）-x-G-H-x（2）-C-G。FsAC1序列完全與此符合，其中保守區(qū)H（第156～163位）的保守序列為CSDSRVcP，保守區(qū)F（第200～220位）的保守序列為EYAVlhLkvsnIVViGHsaCG。[JP]

2.5不同物種[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]基因及其編碼蛋白的序列同源比對(duì)

以[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因序列為探針，通過(guò)BLASTn同源對(duì)比，發(fā)現(xiàn)9條與[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因相似度較高的序列，分別為大豆（Glycine max）GmCA（XM_003553786.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[WTBX][STBX]AtCA1[WTBZ][STBZ]（NM_111016.3）、豇豆（Vigna unguiculata）VuCA（JQ429799）、黃百合（Flaveria brownii）FbCA（FBU08402）、綠豆（[WTBX][STBX]Vigna radiata）VrCA1[WTBZ][STBZ]（AF139464.2）、豌豆（Pisum sativum）PsCA（M63627.1）、線葉黃頂菊（Flaveria linearis）FICA1[JP3]（FLU19738）、甘藍(lán)（Brassica oleracea）BoCA1（XM_003553786.1）、[JP]甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）BnCA（GQ36780）、鷹嘴豆（Cicer atietinum）CaCA（XM_004489219.1）、煙草（Nicotiana tabacum）NtCA（AF4479.2）、蓖麻（Ricinus communis）RcCA（XM_002524596.1）、亞洲棉（Gossypium arboreum）GaCA（KHG255181）、亞麻薺（Camelina sativa）CaCA1（XP_010496563）、日中花（[WTBX][STBX]Mesembryanthemum nodiflorum）MnCA1[WTBZ][STBZ]（JN228098.1）、川桑（Morus notabilis）MnCA（XM_010110474）、龍眼（Dimocarpus longan）DlCA（JN033201）、歐洲與美洲山楊雜種（Populus tremula×Populus tremuloides）PtCA（PTU838）、胡楊（Populus euphratica）PeCA2（XM_011049011）、富貴草（Pachysandra terminalis）PtCA（DQ781308.1）、銀合歡（Leucaena leucocephala）LICA（KC92476.1）、菠菜（Spinacia）SpCA（J05403.1）和葡萄（[WTBX][STBX]Vitis vinifera）VvCA1[WTBZ][STBZ]（XM_002277921.3）。利用ClustalX、MEGA5.1軟件，構(gòu)建[WTBX][STBX]FsCA1和其他物種CA1[WTBZ][STBZ]編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，可見(jiàn)5種豆科植物CA1蛋白序列相似度較高，明顯聚為一類，除莧科藜亞科的菠菜、番杏科的日中花[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]序列有一定相似度外，其他物種均單獨(dú)成類（圖3）。[FL）]

3討論

碳酸酐酶（CA）普遍存在于綠色植物中，但物種間CA活

性差別很大。本試驗(yàn)對(duì)蕎麥CA基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆和序列分析，通過(guò)生物信息學(xué)分析、多物種同源序列比對(duì)，初步明確了[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因編碼蛋白的基本特性、高級(jí)結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)sCA1主要定位于葉綠體中，少量分布于線粒體中；組織特異性表達(dá)分析印證了上述結(jié)果，表明β-CA主要分布在葉綠體葉肉細(xì)胞的基質(zhì)中[16]。在蕎麥綠色組織中的表達(dá)豐度顯著高于在非綠色組織中，暗示FsCA1可能與光合作用有關(guān)。編碼蛋白motif預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)2個(gè)保守序列，具有β-CA典型結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步證明編碼蛋白是β-CA，似乎也支持FsCA1可能在光合作用中發(fā)揮功能的推測(cè)。這些結(jié)果為深入研究[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因奠定了基礎(chǔ)。

不同物種[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，蕎麥與菠菜的同源性（64%）略高于豌豆（61%），遠(yuǎn)高于日中花（58%）。有趣的是，根據(jù)蛋白序列比對(duì)生成的進(jìn)化樹卻顯示，蕎麥FsAC1卻與MnCA關(guān)系最近，其次是菠菜，而與豌豆的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。分析蛋白序列發(fā)現(xiàn)，蕎麥與日中花存在1段完全相同的序列（FMVFACSDSRVCPSHVLDFQPGEAFVVRNIANMVP），與菠菜的片段僅差異1個(gè)氨基酸（CEKEAVNVSLGHLLTYPFVRDGLVKKTLALKGGYYDFI），而與豌豆在2段蛋白片段上都有差異，分別相差1、2個(gè)氨基酸。這種同源基因保守序列上的差異可能反映物種的親緣關(guān)系，也可能與蛋白官能團(tuán)有關(guān)，但與預(yù)測(cè)的motif保守序列存在異議，還須進(jìn)一步論證。根據(jù)現(xiàn)有結(jié)果推測(cè)，蕎麥CA可能由上述2個(gè)官能團(tuán)決定功能，F(xiàn)sCA1在功能上可能更接近MnCA。本研究建立[WTBX][STBX]FSCA1[WTBZ][STBZ]編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)時(shí)，是以已知的同源豌豆CA（POB：1ekj.1.B）為模板的，這可能會(huì)帶來(lái)誤差，但是POB數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)存的模板數(shù)量有限，未發(fā)現(xiàn)與蕎麥CA功能最接近物種的模板，因此，F(xiàn)SCA1三維結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步完善。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hewett-Emmett D，Tashian R E. Functional diversity，conservation，and convergence in the evolution of the alpha-，beta-，and gamma-[JP]carbonic anhydrase gene families[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，1996，5（1）：50-77.

[2]Tems U，Burnell J N. Characterization and expression of the maize β-carbonic anhydrase gene repeat regions[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（12）：945-951.

[3]Deng Q H，Gan L，F(xiàn)u C H，et al. Comparison of carbonic anhydrase activities of several species in Brassica[J]. Plant Physiol Commun，2009，45（7）：663-666.

[4]Moroney J V，Bartlett S G，Samuelsson G. Carbonic anhydrases in plants and algae[J]. Plant Cell and Environment，2001，24（2）：141-153.

[5]楊霄，劉再華，曹建華，等. 巖溶區(qū)和非巖溶區(qū)玉米光合作用與鋅含量和碳酸酐酶關(guān)系的對(duì)比研究[J]. 中國(guó)巖溶，2008，27（2）：20.

[6]Tsuzuki M，Miyachi S，Edwards G E. Localization of carbonic anhydrase in mesophyll cells of terrestrial C3 plants in relation to CO2 assimilation[J]. Plant Cell Physiol，1985，26：881-891.[HJ1.7mm]

[7]Ivanov B N，Ignatova L K，Romanova A K. Diversityinforms and functions of carbonic anhydrase interrestrial higher plants[J]. Russ J Plant Physiol，2007，54（2）：143-162.

[8]Tetu S G，Tanz S K，Vella N，et al. The flaveria bidentis β-carbonic anhydrase gene family encodes cytosolic and chloroplastic isoforms demonstrating distinct organ-specific expression patterns[J]. Plant Physiol，2007，144（3）：1316-1327.

[9]陳虎，何新華，羅聰，等. 低溫脅迫下龍眼碳酸酐酶基因（CA）的克隆與表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2012，39（2）：243-252.

[10]Fabre N，Reiter I M，Becuwe-Linka N，et al. Characterization and expression analysisof genes encoding α and β-carbonic anhydrases in Arabidopsis[J]. Plant Cell Environ，2007，30（5）：617-629.

[11]Coleman J R. Carbonic anhydrase and its role in photosynthesis[J]. Adv Photosyn Respiration，2000，9：353-367.

[12]Wang Y Q，F(xiàn)eechan A，Yun B W，et al. S-nitrosylation of AtSABP3 antagonizes the expression of plant immunity[J]. The Journal of Biological Chemistry，2009，284（4）：2131-2137.

[13]Ferreira F J，Guo C，Coleman J R. Reduction of plastid-localized carbonic anhydrase activity results in reduced Arabidopsis seedling survivorship[J]. Plant Physiology，2008，147（2）：585-594.

[14]Hu H H，Boisson-Dernier A，Israelsson-Nordstroem M，et al. Carbonic anhydrases are upstream regulators of CO2-controlled stomatal movements in guard cells[J]. Nature Cell Biology，2010，12（1）：87-93，S1-S18.

[15]Price G D，von Caemmerer S，Evans J R，et al. Specific reduction of chloroplast carbonic anhydrasea ctivity by antisense RNA in transgenic tobacco plants has a minor effect on photosynthetic CO2 assimilation[J]. Planta，1994，193（3）：331-340.

[16]Hoang C V，Chapman K D. Biochemical and molecular inhibition of plastidial carbonic anhydrase reduces the incorporation of acetate into lipids in cotton embryos and tobacco cell suspensions and leaves[J]. Plant Physiology，2002，128（4）：1417-1427.

[17]Restrepo S，Myers K L，del Pozo O，et al. Gene profling of acompatible interaction between Phytophthora infestans and Solanum tuberosum suggests a role for carbonic anhydrase[J]. Mol Plant-Microbe Interact，2005，18（9）：913-922.

[18]Tomiyoshi M，Yasui Y，Ohsako T，et al. Phylogenetic analysis of AGAMOUS sequences reveals the origin of the diploid and tetraploid forms of self-pollinating wild buckwheat，F(xiàn)agopyrum homotropicum Ohnishi[J]. Breeding Science，2012，62（3）：241-247.