查沖+杜亞填+劉磊磊+劉建蘭+宋科

摘要：采用單因素、多因素正交試驗(yàn)研究南方紅豆杉枝葉中10-脫乙?；涂ㄍあ螅?0-DABⅢ）、紫衫醇的高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)方法及檢測(cè)樣制備。結(jié)果顯示，檢測(cè)樣制備采用10倍量甲醇于40 ℃恒溫水浴條件下浸提3 h，即可使 10-DABⅢ、紫杉醇得率達(dá)到峰值，且提取時(shí)間不宜超過3 h，否則會(huì)導(dǎo)致檢出結(jié)果比實(shí)際含量偏低。由于采用 10-DABⅢ、紫杉醇混合同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相梯度洗脫方案較為關(guān)鍵，較好的洗脫方案會(huì)使檢測(cè)圖譜的基線分離較好。

關(guān)鍵詞：10-DABⅢ；紫杉醇；南方紅豆杉；高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)；檢測(cè)樣

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0140-06

南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）是紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）在中國(guó)的1個(gè)變種，是國(guó)家一級(jí)保護(hù)樹種。紅豆杉植物中的紫杉醇屬于二萜類化合物，是目前最有效的抗癌藥物，主要用于治療卵巢癌、乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也有一定的療效[1-2]。紅豆杉植物生物合成紫杉醇的最重要前體物質(zhì) 10-脫乙?；涂ㄍあ螅?0-DABⅢ），也是二萜類紫杉烷衍生物，是目前半合成生產(chǎn)紫杉醇或多烯紫杉醇（多烯它賽，docetaxe）的主要原料，故10-DABⅢ常與紫杉醇一起被研究[3]。紫杉醇、10-DABⅢ在紅豆杉植物體中含量極低（一般 <0.03%），基本不具備商業(yè)提取價(jià)值，且天然資源非常有限。因此，提高紅豆杉枝葉中紫杉醇或10-DABⅢ的含量，是解決紫杉醇藥源問題的途徑之一。通過選育，發(fā)現(xiàn)在一種歐洲紅豆杉枝葉中10-DABⅢ的含量高達(dá)0.11%，故該紅豆杉的枝葉是目前市場(chǎng)上提取生產(chǎn)10-DABⅢ的主要原料[4]。但在21世紀(jì)初，國(guó)內(nèi)為解決紫杉醇藥源短缺問題，曾大量種植南方紅豆杉，現(xiàn)因其藥用成分含量低（紫衫醇含量約≤001%）而被閑置[5]。本研究團(tuán)隊(duì)通過研究南方紅豆杉根際微生物發(fā)現(xiàn)，可通過微生物作用來(lái)大幅提高南方紅豆杉枝葉中紫杉醇、10-DABⅢ含量[6-8]。為了能較快捷、精準(zhǔn)地開展該研究，本試驗(yàn)對(duì)南方紅豆杉枝葉中10-DABⅢ和紫杉醇的分析檢測(cè)方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究與優(yōu)化，以為進(jìn)一步的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

南方紅豆杉枝葉（該南方紅豆杉種植在湖南省岳陽(yáng)市平江縣黃金洞鄉(xiāng)金星村，樹齡為6年，湖南東慧紅豆杉科技開發(fā)有限公司）。紫杉醇對(duì)照品[高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)用對(duì)照品，≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司]，10-DABⅢ對(duì)照品（HPLC檢測(cè)用對(duì)照品，≥95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），甲醇（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），二氯甲烷（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），乙醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司），乙酸乙酯（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），丙酮（分析純，衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司），95%乙醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），乙腈（HPLC級(jí)，美國(guó)TEDIA試劑有限公司），甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó)TEDIA試劑有限公司），蒸餾水（自制）等。

LC-1260高效液相色譜儀，1260無(wú)限二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）。紫杉醇檢測(cè)專用色譜柱（MetaChem Taxsil，250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)迪馬公司）。萬(wàn)分之一天平（ML-204，瑞士梅特勒-托利多公司），十萬(wàn)分之一天平（AEG-220，日本島津公司），植物粉粹機(jī)（FY-130，天津市能斯特儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-215，德國(guó)海道夫公司），數(shù)顯鼓風(fēng)干燥器（GZX-9146MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司），超聲波清洗器（KQ-250E，昆山市超聲儀器有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（U-3900，日本日立公司）。

1.2檢測(cè)樣的制備

采集南方紅豆杉枝葉，50 ℃烘箱烘干，粉碎過篩，精確稱取3 g枝葉粉末，放入50 mL錐形瓶中，加入甲醇30 mL，40 ℃ 恒溫水浴條件下浸提6 h，取出超聲輔助提取30 min；取上清液，殘?jiān)鼜?fù)加30 mL甲醇，超聲輔助提取30 min，合并2次上清液，過濾，濾液于40 ℃條件下減壓濃縮，浸膏以 15 mL 二氯甲烷 ∶[KG-*3]15 mL水進(jìn)行萃取，超聲處理 5 min 后轉(zhuǎn)入離心管中，4 000 r/min離心5 min；收集二氯甲烷相，水相復(fù)加 15 mL 二氯甲烷，進(jìn)行萃取，重復(fù)上一步驟，合并2次二氯甲烷相，40 ℃減壓濃縮，用少量色譜甲醇充分洗出濃縮固形物于10 mL容量瓶中，并用色譜甲醇定容至 10 mL，用0.45 μm微孔膜過濾至Tube管中，置于冰箱中冷藏，備HPLC檢測(cè)用。

1.3采用不同溶劑提取制備檢測(cè)樣

準(zhǔn)確稱取南方紅豆杉干枝葉粉末3 g，共4份，分別以95%乙醇、甲醇、甲醇+二氯甲烷（體積比1 ∶[KG-*3]1）混合液，乙酸乙酯+丙酮（體積比1 ∶[KG-*3]1）混合液為浸提溶劑，10倍量水浴恒溫40 ℃提取，浸提6 h后按“1.2”節(jié)方法制備供試樣品以備檢測(cè)用。

1.4采用不同溫度提取制備檢測(cè)樣

準(zhǔn)確稱取南方紅豆杉干枝葉粉末3 g，共4份，于水浴中分別采用10、25、40、55 ℃溫度提取，以甲醇為浸提溶劑，10倍量溶劑提取6 h后按“1.2”節(jié)方法制備供試樣品。

1.5采用不同時(shí)間提取制備檢測(cè)樣

準(zhǔn)確稱取南方紅豆杉干枝葉粉末3 g，共5份，分別置于5個(gè)提取容器中并各自加入10倍量甲醇，于40 ℃水浴中，分別提取1、2、3、4、5 h后按“1.2”節(jié)方法制備供試樣品。

1.6采用不同料液比提取制備檢測(cè)樣

準(zhǔn)確稱取南方紅豆杉干枝葉粉末3 g，共5份，以甲醇為提取溶劑，分別采用1 g ∶[KG-*3]5 mL、1 g ∶[KG-*3]10 mL、1 g ∶[KG-*3]15 mL、1 g ∶[KG-*3]20 mL、1 g ∶[KG-*3]25 mL的料液比，于40 ℃水浴恒溫條件下分別提取3 h后按“1.2”節(jié)方法制備供試樣品。

1.7多因素正交試驗(yàn)提取制備檢測(cè)樣

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步選擇浸提溫度、時(shí)間、料液比3個(gè)因素，以紫杉醇、10-DABⅢ制得率為觀察指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)（表1）進(jìn)行試驗(yàn)。每組均準(zhǔn)確稱取南方紅豆杉干枝葉粉末3 g，以無(wú)水甲醇為提取溶劑，提取后按 “1.2” 節(jié)方法完成檢測(cè)樣的制備。

1.810-DABⅢ與紫杉醇最適測(cè)定波長(zhǎng)的確定

選取最佳的檢測(cè)波長(zhǎng)可以保證紫杉醇、10-DABⅢ達(dá)到最大的紫外吸收和最小的干擾，提高檢測(cè)的靈敏性、準(zhǔn)確度。采用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)紫杉醇、10-DABⅢ對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)2種物質(zhì)均在 230 nm 處有較高吸光度（圖1），故選擇230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.9HPLC檢測(cè)條件

色譜柱為MetaChem Taxsil（250 mm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)樣量為20 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫 30 ℃，采用1260無(wú)限二極管陣列檢測(cè)器。

1.10流動(dòng)相

流動(dòng)相采用乙腈/水梯度洗脫法。方案1（參照朱慧芳的[JP3]HPLC方法[9]改進(jìn)）：梯度洗脫時(shí)間設(shè)計(jì)為0～6 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（20 ∶[KG-*3]80）～（40 ∶[KG-*3]60）；6～10 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（40 ∶[KG-*3]60）～（50 ∶[KG-*3]50）；10～21 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=50 ∶[KG-*3]50；21～28 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（100 ∶[KG-*3]0）；28～30 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=20 ∶[KG-*3]80。方案2：梯度洗脫時(shí)間設(shè)計(jì)為0～6 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=20 ∶[KG-*3]80；6～15 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（20 ∶[KG-*3]80）～（40 ∶[KG-*3]60）；15～30 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（40 ∶[KG-*3]60）～（50 ∶[KG-*3]50）；30～37 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（50 ∶[KG-*3]50）～（100 ∶[KG-*3]0）；37～40 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（100 ∶[KG-*3]0）～（10 ∶[KG-*3]90）。方案3：0～6 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=20 ∶[KG-*3]80；6～15 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（20 ∶[KG-*3]80）～（40 ∶[KG-*3]60）；15～25 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（40 ∶[KG-*3]60）～（70 ∶[KG-*3]30）；25～30 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（70 ∶[KG-*3]30）～（50 ∶[KG-*3]50）；30～32 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（50 ∶[KG-*3]50）～（90 ∶[KG-*3]10）；32～37 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（90 ∶[KG-*3]10）～（100 ∶[KG-*3]0）；37～40 min，V乙腈 ∶[KG-*3]V水=（100 ∶[KG-*3]0）～（10 ∶[KG-*3]90）。

1.11標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取紫杉醇對(duì)照品2.60 mg、10-DABⅢ對(duì)照品 1.90 mg 于25 mL容量瓶中，用色譜級(jí)甲醇溶解并定容配制成混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液。分別精確吸取混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液1、2、4、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，用色譜級(jí)甲醇定容至 10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾、脫氣處理后，按“1.9”節(jié)的色譜條件、“1.10”節(jié)試驗(yàn)得出的最佳梯度洗脫方案，分別進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，并以濃度y（μg/mL）對(duì)峰面積x進(jìn)行最小二乘法線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。10-DABⅢ、紫杉醇的濃度分別用y1、y2表示，對(duì)應(yīng)的峰面積分別用x1、x2表示，得回歸方程分別為y1=0.048 4x1-1.598 3（r=0.998 9，n=5），y2=0.041 4x2-2.907 6（r=0.999 2，n=5），10-DABⅢ、紫杉醇分別在7.60～76.00 μg/mL、10.40～104.00 μg/mL范圍內(nèi)的實(shí)際濃度與其HPLC檢測(cè)峰面積間具有良好的線性關(guān)系（圖2）。

1.12精密度及重復(fù)性試驗(yàn)

用“1.2”節(jié)制備的樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，采用“1.9”節(jié)色譜條件及“1.10”節(jié)試驗(yàn)得出的最佳梯度洗脫方案，進(jìn)行檢測(cè)，[JP3]根據(jù) “1.11” 節(jié)中10-DABⅢ與紫衫醇的出峰保留時(shí)間，分別計(jì)算每1次各自的峰面積，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析與檢驗(yàn)。

1.13穩(wěn)定性試驗(yàn)

選擇“1.11”節(jié)中配制的任意濃度的10-DABⅢ、紫衫醇對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.9”節(jié)色譜條件及“1.10”節(jié)試驗(yàn)得出的最佳梯度洗脫方案，每間隔2 h進(jìn)樣1次，重復(fù)進(jìn)樣6次，然后根據(jù)測(cè)得的10-DABⅢ、紫衫醇的峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與檢驗(yàn)。

1.14加樣回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取南方紅豆杉枝葉粉末5份，每份2 g，分別置于100 mL三角瓶中，編號(hào)1、2、3、4、5，并分別加入適量對(duì)照品（表2），之后按“1.2”節(jié)的方法制備樣品檢測(cè)液，按“1.9”節(jié)的色譜條件、“1.10”節(jié)的最佳流動(dòng)相梯度洗脫方案進(jìn)行檢測(cè)。

[HS2][JZ]加樣回收率=[SX（]加標(biāo)樣品檢出量-樣品檢出量加入對(duì)照品量[SX）]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1梯度洗脫方法的影響

根據(jù)HPLC檢測(cè)圖譜（圖3），不同的梯度洗脫方案，樣品

中被檢測(cè)成分的洗脫分離效果不同。由圖3可以看出，梯度洗脫方案3的效果優(yōu)于方案1、2。采用方案3，對(duì)照品中紫杉醇在30 min內(nèi)出峰，10-DABⅢ在20 min內(nèi)出峰，且基線分離較好（圖3-e、圖3-f）。方案1的圖譜（圖3-a、圖3-b）顯示，10-DABⅢ 的類似物較多，分離得不夠好。方案2的對(duì)照品中紫杉醇的出峰出現(xiàn)前延與基線漂移現(xiàn)象（圖3-c、圖3-d），樣品中 10-DABⅢ 的類似物較多，分離不夠好。

2.2精密度及重復(fù)性

5次重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示，10-DABⅢ、紫杉醇峰面積值的RSD分別為3.11%、1.16%（n=5），均符合精密度要求，重復(fù)性較好。

2.3穩(wěn)定性

連續(xù)6次間隔2 h進(jìn)樣檢測(cè)結(jié)果顯示，10-DABⅢ、紫杉醇峰面積的RSD分別為2.11%、3.71%（n=6）（表4），說明儀器和供試品在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性均較好。

之間相差不太明顯，據(jù)HPLC圖譜觀察，提取物中雜質(zhì)含量均看不出差別?？紤]到檢測(cè)成本與安全性，選擇甲醇為提取溶劑較好。

2.6提取溫度對(duì)樣品制備的影響

由圖5可以看出，溫度對(duì)提取物中2種紫杉烷類化合物得率的影響較明顯，在40 ℃條件下，10-DABⅢ、紫杉醇的得率較高，故選擇40 ℃為樣品制備的提取溫度。

2.7提取時(shí)間對(duì)樣品制備的影響

由圖6可以看出，提取時(shí)間為3 h時(shí)，10-DABⅢ、紫杉醇的得率已達(dá)到極大值，之后紫杉醇得率出現(xiàn)較明顯降低，說明檢測(cè)樣制備的提取時(shí)間以3 h為宜，不宜過長(zhǎng)，紫杉醇可能會(huì)因提取時(shí)間過長(zhǎng)而分解，影響檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際含量間的誤差。

2.8料液比對(duì)樣品制備的影響

由圖7可以看出，當(dāng)甲醇加入量料液比為1 g ∶[KG-*3]10 mL時(shí)，提取物中紫杉醇、10-DABⅢ的得率已達(dá)峰值或較大值，再增加溶劑量，二者得率不再有明顯變化，說明加入10倍量甲醇所得的提取物，已能較好地顯示材料中目標(biāo)物的真實(shí)含量。

2.9正交試驗(yàn)

據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析和方差SS值判斷，SSB>SSA>SSC，即浸提時(shí)間是檢測(cè)樣制備提取過程中的重要影響因素，浸提溫度為次要因素，料液比影響最?。ū?～表10）。據(jù)均值k分析，10-DABⅢ 以A2B2（或B3）C3為最優(yōu)，B2與B3的得率相差甚微，紫杉醇以A2B2C3為最優(yōu)。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇A2B2C3為最優(yōu)化方案，即以甲醇提取溶劑，浸提溫度為 40 ℃、時(shí)間為3 h、料液比為1 g ∶[KG-*3]15 mL即可。

3結(jié)論與討論

紅豆杉植物中10-DABⅢ、紫杉醇含量HPLC檢測(cè)方法相關(guān)的研究較多[10-13]，但發(fā)表的文章中相關(guān)檢測(cè)圖譜的基線均分離不夠好。本試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)樣制備到檢測(cè)條件優(yōu)化進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，并針對(duì)樣品制備中的提取環(huán)節(jié)進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸提溫度為40 ℃、時(shí)間為3 h、料液比為 1 g ∶[KG-*3]15 mL 時(shí)，能較好地滿足檢測(cè)樣制備提取要求，使 10-DABⅢ、紫杉醇的得率均可達(dá)到峰值，且提取時(shí)間不宜超過 3 h，否則已提取出來(lái)的紫杉醇會(huì)因時(shí)間過長(zhǎng)而降解，影響檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性。有報(bào)道用不同流動(dòng)相梯度洗脫方法對(duì)血液[14]、愈傷組織[15]、注射針劑[16]中的紫杉醇進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，可見梯度洗脫對(duì)分離復(fù)雜樣品具有分離時(shí)間短、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，與等度洗脫方法相比，它能改善分離效果。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)梯度洗脫方案的優(yōu)化對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較大，會(huì)影響檢測(cè)圖譜的基線分離。所以，本研究結(jié)果對(duì)生產(chǎn)紫杉醇、10-DABⅢ均具有應(yīng)用參考意義。檢測(cè)樣制備過程中如何減少或除去背景成分中的類似物，仍值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙春芳，余龍江，劉智，等. 中國(guó)紅豆杉中主要紫杉烷類物質(zhì)的分布研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2005，25（1）：89-93.

[2]羅小梅，王昭陽(yáng). 紫杉醇提取純化方法的研究進(jìn)展[J]. 宜春學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，32（12）：92-94.

[3]王玉震，柯春婷，仝川，等. 胸徑、構(gòu)件和季節(jié)對(duì)南方紅豆杉中紫杉醇和10-DABⅢ含量的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30（8）：1990-1997.

[4]李雙明. 東北紅豆杉中10-DABⅢ的提取純化及多西紫杉醇的半合成[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2007.

[5]馬淑楨. 南方紅豆杉中10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的分離及純化工藝的研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2006.

[6]張盼盼，秦盛，袁博，等. 南方紅豆杉內(nèi)生及根際放線菌多樣性及其生物活性[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2016，56（2）：241-252.

[7]Soca-Chafre G，Rivera-Ordua F N，Hidalgo-Lara M E，et al. Molecular phylogeny and paclitaxel screening of fungal endophytes from Taxus globosa[J]. Fungal Biology，2011，115（2）：143-156.

[8]龔雪元，杜亞填，劉嬌，等. 南方紅豆杉菌根菌液體純發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)紫杉醇及10-去乙酰巴卡亭Ⅲ[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2015，35（3）：114-120.

[9]朱慧芳. 產(chǎn)紫杉烷類物質(zhì)內(nèi)生真菌的分離鑒定[D]. 上海：上海交通大學(xué)，2010.

[10]Pulok K M. Evidence-based validation of herbal medicine[M]. NoordHolland：Elsevier，2015.

[11]牟德海，周治發(fā)，林展江，等. 反相HPLC法分析紅豆杉樹皮和樹葉中紫杉醇及其類似物含量的研究[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，1997，16（6）：8-11.

[12]李乃偉，束曉春，彭峰，等. 紫杉醇提取方法和曼地亞紅豆杉HPLC指紋圖譜的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：296-298.

[13]沈衛(wèi)陽(yáng)，史文吏，沈圃毅，等. 紫杉醇有關(guān)物質(zhì)的HPLC法測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2015，46（3）：277-281.

[14]Huizing M T，Rosing H，Koopman F，et，al. High-perforrnance liquid chromatographic procedures for the quantitative determination of paclitaxel（taxol） in human urine[J]. Journal of Chromatography B，1995，664（2）：373-377.

[15]Adeline M T，Wang X P，Poupat C，et al. Evaluation of taxoids from Taxus sp. crude extacrts by high perforrnance liquid chromatography[J]. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies，1997，20（19）：3135-3145.

[16]Shao L K，Locke D C. Determination of paclitaxel and related taxanes in bulk drug and injectable dosage forms by reversed phase liquid chromatography[J]. Analytical Chemistry，1997，69（11）：2008-2016.