楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

·論著·

膀胱移行細胞癌組織Livin的表達及其臨床意義

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

目的 探討Livin在膀胱移行細胞癌及癌旁組織中的蛋白表達水平，分析其與臨床病理指標的關系及意義，為膀胱移行細胞癌的診斷及臨床治療提供理論依據(jù)。方法 用流式細胞分析技術檢測45例膀胱移行細胞癌(膀胱轉(zhuǎn)行細胞癌組)及對應的45例癌旁組織(癌旁組織組)，及10例正常膀胱黏膜移行上皮組織(正常膀胱組)中的Livin蛋白的表達。結果 正常膀胱組、膀胱移行細胞癌組、癌旁組織組Livin表達陽性率分別為0、71.11%、0，其中膀胱移行細胞癌組陽性率均高于正常膀胱組和癌旁組織組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而正常膀胱組和癌旁組織組均未見表達。Livin表達與膀胱移行細胞癌淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(P<0.05)，與腫瘤的分級有一定關系；而與患者性別、年齡及臨床分期等指標均無相關性(P>0.05)。膀胱移行細胞癌組組織中Livin蛋白表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達(P<0.05)。結論 細胞凋亡抑制因子Livin在膀胱移行細胞癌組織中表達上調(diào)，并且與凋亡率呈負相關，提示Livin可能通過抑制細胞凋亡，對膀胱移行細胞癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用，有望成為一種有效、敏感的腫腫瘤標志物志物，并為膀胱移行細胞癌的基因治療提供新的靶點。

Livin：膀胱移行細胞癌：癌旁：蛋白表達：流式細胞分析技術

研究表明，腫瘤發(fā)生是細胞增殖因子與細胞凋亡因子失衡所致，受多種因素控制。凋亡抑制蛋白(IAP)是細胞內(nèi)源性凋亡途徑重要的調(diào)控因子，其既能抑制起始caspase又能抑制執(zhí)行caspase活性的內(nèi)源性蛋白(Crma和p53除外)，其高表達引起凋亡不足，與腫瘤發(fā)生關系密切，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)8個IAP家族成員(NIAP、cIAP-1、Ciap-2、XIAP、survivin、BRUCE、livin ILP-2)。其中Livin(又稱KIAP.MLIAP)是一種新近發(fā)現(xiàn)的IAP成員，其可以通過BIR結構域與激活的caspases蛋白結合，導致后者失活或降解產(chǎn)生抗凋亡作用，還可以通過選擇性激活JNK1發(fā)揮抗凋亡作用。本文用流式細胞分析技術研究Livin在膀胱移行細胞癌、癌旁組織中的蛋白表達水平，分析其與臨床生物學行為的關系及意義，為膀胱移行細胞癌的診斷及臨床治療提供理論方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本取自2012至2013年在我院泌尿外科進行外科治療的住院患者，其中膀胱移行細胞癌45例(膀胱移行細胞癌組)、對應的癌旁組織45例(癌旁組織組)，正常膀胱黏膜組織10例(正常膀胱組)。膀胱移行細胞癌組均經(jīng)術后病理證實，其中男33例，女12例；年齡26～68歲，平均年齡(50±10)歲；按照WHO病理分級：G1 12例，G2 20例，G3 13例；TNM臨床分期診斷標準：非浸潤性癌(Ta-1期)19例，浸潤性癌(T2～4期)26例;單發(fā)24例，多發(fā)21例；初發(fā)29例，復發(fā)16例；正常膀胱組患者10例均為前列腺增生癥、膀胱結石的膀胱黏膜組織且經(jīng)病理證實，其中男7例，女3例；年齡27～69歲，平均年齡(51±9)歲。上述標本經(jīng)4%多聚甲醛固定。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：鼠抗人Livin單克隆抗體(工作濃度1:700)，美國NEOMARKERS公司；hanks(緩沖液)百浩生物科技有限公司；AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)Proteintech公司；胃蛋白酶工作液(上海易欣生物科技有限公司)。

1.2.2 儀器:BD FACSEALIBUR流式細胞儀 BD Bioscience公司(U.S.A)。

1.3 試驗方法 應用流式細胞分析技術檢測。

1.4 試驗步驟 在檢測蛋白免疫熒光標記物時，設hanks(緩沖液)為陰性對照，二抗AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)為陽性對照。具體操作步驟如下：

1.4.1 標本蠟塊的處理：在切片機上將蠟塊包埋的組織切取3～5片40～50 μm厚的組織片。

1.4.2 脫蠟：將切取的組織片放入試管中，用二甲苯5～8 ml(室溫)浸泡2～3 d，其間更換1次或2次二甲苯，脫凈石蠟。

1.4.3 水化：依次用100%、95%、70%、50%濃度的乙醇6～8 ml對組織進行水化，每次水化10～15 min，棄掉乙醇。加入0.9%氯化鈉溶液5～8 ml浸泡30 min，棄掉0.9%氯化鈉溶液。

1.4.4 消化：經(jīng)水化的組織加入0.5%胃蛋白酶(pH值1.5～2)2 ml，置37℃恒溫水浴中，每10分鐘振蕩1次。30 min后，立即加入0.9%氯化鈉溶液終止消化。

1.4.5 過濾：將消化好的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織，邊搓邊用0.9%氯化鈉溶液沖洗，直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目銅網(wǎng)過濾去掉細胞團塊。

1.4.6 離心：將收集的細胞懸液離心沉淀，1 500 r/min，4 min，去掉多余懸清液，以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，離心沉淀1 000 r/min，4 min，去掉多余懸清液，再以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，再離心沉淀800 r/min，4 min，去掉多余懸清液，剩約0.5 ml。

1.4.7 標抗：將Livin一抗均按1∶50進行稀釋。離心后的組織加入Livin抗體工作液0.1 ml，靜置1 h，加入hanks (0.01 mol/L)5～8 ml，離心沉淀800 r/min，4 min，棄懸清液，再加入二抗(AlexaFiuor488)100 μl，2 h 后，加入hanks 5～8 ml，離心同上，除去未結合的熒光二抗，上機檢測。

1.5 結果評定標準 Livin蛋白表達含量以細胞的平均熒光強度表示，為了使免疫熒光定量分析更加完備，將平均熒光強度換算成熒光指數(shù)(FI)，用FI來表示Livin在組織中的相對表達含量，按照組織細胞表達熒光指數(shù)大小對其進行統(tǒng)計分類，F(xiàn)I≤1判定表達量為陰性，F(xiàn)I>1判定為陽性。應用流式細胞儀檢測Livin,Bcl-2陽性和陰性表達細胞的凋亡率。

2 結果

2.1 3組Livin蛋白在膀胱組織中的表達陽性率比較 正常膀胱組、膀胱移行細胞癌組、癌旁組織組Livin表達陽性率分別為0、71.11%、0，其中膀胱移行細胞癌組陽性率均高于正常膀胱組和癌旁組織組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而正常膀胱組和癌旁組織組均未見表達。見表1。

表1 3組Livin蛋白在膀胱組織中的表達陽性率比較

注：與正常膀胱組比較，*P<0.05；與膀胱移行細胞癌比較，#P<0.05

2.2 膀胱移行細胞癌臨床生物學行為之間的關系 Livin表達在膀胱移行細胞癌是否有淋巴轉(zhuǎn)移、不同腫瘤分級間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在患者不同性別、年齡段及臨床分期等比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 膀胱移行細胞癌臨床生物學行為之間的關系 例(%)

注：與G1比較，*P<0.05；與G2比較，#PM0.05；與有淋巴結轉(zhuǎn)移比較，△P<0.05

2.3 Livin蛋白表達與凋亡率的關系 膀胱移行細胞癌組組織中Livin蛋白表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達(P<0.05)。見表3。

表3 膀胱移行細胞癌組Livin蛋白表達與凋亡率的關系 ±s

3 討論

Livin(又稱KIAP.MLIAP) 是新發(fā)現(xiàn)的一個IAP家族成員，Ashhab等[1]明確了 Livin基因位于人染色體20q13.3,全長4.6 kb,包含7個外顯子?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA長1.4 kb。Livin蛋白N端僅包含一個BIR結構,C端含一個RING環(huán)指結構。編碼的Livin蛋白Livinα和Livinβ分別由298和280個氨基酸組成，Livin氨基酸殘基C124,C127,H44及C151與鋅原子結合，以穩(wěn)定整個重疊結構。Livinα和Livinβ蛋白分子量分別為39 000和37 000。Kasof等[2]認為Livin同時成絲狀表達于胞質(zhì)和胞核。其抗細胞凋亡機制為(1)抑制Caspase途徑:Livin可與介導細胞凋亡的下游效應Caspase ,即激活形式的Caspase3和Caspase7結合,抑制其活性，從而阻斷各種刺激因素誘導的細胞凋亡過程。(2)激活TAK1/JNK1信號傳導途徑:Livin可激活MAP(mitogen activated protein)激酶JNK1和JNK2,從而抑制細胞凋亡。TAK1是一上游MAP3激酶,在TGFβ1的刺激下可激活JNK1。TAB1是TAK1的共反應子(coactivator),TAB1本身對于JNK1無激活作用,但可促進TAK1介導的JNK1激活作用。而抑制細胞凋亡。鑒于Livin具有明顯的抗凋亡作用,人們開始日益關注其與腫瘤發(fā)生及發(fā)展的關系。

3.1 黑色素瘤 Livin在黑色素細胞中呈現(xiàn)低水平的表達，但前者在黑色素瘤中的表達明顯高于在研究的其他腫瘤表達水平。Vucic等[3]對黑色素瘤進行檢測發(fā)現(xiàn)，35株黑色素瘤細胞系均呈現(xiàn)高表達水平的Livin mRNA，而正常細胞未檢出相關表達。在黑色素瘤細胞系Livin基因有兩個剪接含有298和280個氨基酸的開放閱讀框，均含有桿狀病毒IAP重復一個單拷貝的變種(BIR)和環(huán)域，即Livinα和β。Schmollinger等[4]發(fā)現(xiàn)Ⅰ期臨床試驗的免疫策略治療播散性黑色素瘤顯示在轉(zhuǎn)移灶中密集的T細胞和B細胞浸潤，導致大量的腫瘤壞死和纖維化。同時在患者血清中檢測出高滴度的Livin抗體，表明Livin表達陽性的腫瘤細胞可被免疫細胞浸潤并殺傷，而在病程進展期的患者瘤細胞Livin表達低，缺少上述免疫細胞的浸潤，提示Livin可能與黑色素瘤甚至人某些類型腫瘤的形成存在密切關系，Livin可能是腫瘤細胞壞死免疫調(diào)節(jié)的靶點，而其抗原位點的缺失可以導致免疫逃逸?？勺鳛槟[瘤免疫治療的一個有效靶點，Livin的表達缺失則可使腫瘤實現(xiàn)免疫逃避。

3.2 肺癌 抗凋亡Livin和Survivin基因在癌細胞中高表達和轉(zhuǎn)化的細胞，但在正常分化組織中幾乎沒有表達。然而，沒有可用的數(shù)據(jù)對非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達。Tanabe等[5]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應測量了Livin mRNA和survivin mRNA表達，在38例NSCLC癌標本和15例非癌肺組織標本，在癌基因呈高表達，而非癌組織(P<0.001)，Livin和Survivin mRNA表達彼此不相關。當陽性截止值是非癌組織中的表達值，Livin和Survivin mRNA表達陽性率分別為76.3%(29/38)和36.8%(14/38)在肺癌患者和 6.7%(1/15)和0%(0/15)，在非癌肺組織樣本。Livin和Survivin mRNA的表達在腫瘤23/31上調(diào)(74.2%)早期非小細胞肺癌患者和11/31(35.5%)。兩基因在腫瘤中的表達獨立改變腫瘤組織。這些結果支持的可能性，Livin基因可能在肺癌的發(fā)展中發(fā)揮作用，Livin mRNA的表達增加可能成為肺癌治療的新靶點以及Survivin。Hariu等[6]以類似方法檢測肺腺癌、鱗瘤、大細胞癌的陽性率分別為75%、70%、100%，認為Livin表達于大多數(shù)肺癌組織，與腫瘤的組織類型無關。鱗癌和腺癌的陽性染色均與組織中T細胞的誘導效應呈正相關。在化療藥物耐受的肺癌細胞中Livin蛋白表達水平較高，提示Livin可能作為腫瘤的標記物和腫瘤免疫的靶向。孫建國等[7]在NSCLC進一步檢測到兩種異構體均有表達，但Livin α表達高于Livinβ。放化治療后組織中Livin表達陽性率顯著升高(43.5%)，在腺癌尤為明顯，推斷在化療藥物和放射線誘導癌細胞凋亡的同時，癌細胞合成表達抗凋亡的因子從而發(fā)生凋亡耐受，可能是臨床上肺腺癌發(fā)生耐藥的機制之一。術前已有轉(zhuǎn)移的腫瘤組織Livin表達率(33.3%)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者，但因樣本量偏少差異不顯著。結果顯示，凋亡抑制蛋白Livin在NSCLC表達，尤其是在肺腺癌患者中表達較高，不僅可作為肺腺癌的分子標志物，還有助于肺癌的診斷和組織分型。

3.3 絨毛膜細胞癌 Ka等[8]以免疫印跡法和免疫組織化學法研究了不同時期的胎盤、足月孕滋養(yǎng)層細胞和絨毛膜癌細胞系:JEG-3(HTB-36)和Jar(HTB-144)。對早期和晚期妊娠胎盤各6例用免疫印跡法并未檢測到Livin表達，分析可能是Livin在胎盤中含量不高以及免疫印跡法敏感度較低所致。免疫組織化學染色得到與陰性對照明顯不同的陽性表達，且僅僅表達于胞核。免疫活性蛋白在絨毛的細胞滋養(yǎng)細胞、間質(zhì)細胞、合體滋養(yǎng)層的胞核內(nèi)均可檢測到，以后者為最低。Livin在絨毛膜癌細胞中含量比在正常滋養(yǎng)層細胞中更為豐富。認為Livin和其他抗凋亡因子一樣，保證了絨毛膜滋養(yǎng)層細胞有絲分裂得以完整進行，在滋養(yǎng)層細胞的增殖中起了重要作用。

3.4 消化系惡性腫瘤 Livin在消化系腫瘤患者高表達，與人消化系腫瘤的發(fā)生存在一定關系。研究顯示，Livin在胰腺癌AsPC-1株和結腸癌HT-29的表達最強，與GAPDH對照組中mRNA含量之比分別為0.78,0.42[9]。在胰腺癌細胞MIAPaCa-2和BxPC-3,胃癌細胞MKN-1以及結腸癌細胞LSI180和SW620中無表達。另外，對35例病理確診的胃腸癌患者的血清ELISA檢測Livin抗體，17例呈陽性反應，陽性率為47%。陽性結果如下:膽管癌5例中3例，胃癌6例中3例，結腸直腸癌11例中6例，肝癌3例中1例，胰腺癌7例中2例，食管癌3例中2例。15例胃癌患者中6例血清(7例Ⅲ期中4例，2例Ⅳ期中1例，復發(fā)胃癌1例)與Livin蛋白有反應。胃癌、結腸癌、胰腺癌和肝癌細胞Livin m R NA均過度表達，以胃腸癌檢出率相對較高(47%)，甚至高于抗survivin(40%)，與抗survivin抗體缺少相關性，表明對抗體Livin的檢測可以用作癌癥的檢出，Livin可作為一種新型的癌抗原。

本研究顯示，Livin在膀胱移行細胞癌中陽性表達率為71.11%,而在正常膀胱黏膜組織及癌旁組織中無表達。Livin蛋白的陽性表達率與BTCC的病理分級有一定的相關性,Ⅰ級與Ⅲ級間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明膀胱癌惡性程度越高，Livin陽性表達率越高。非浸潤性癌和浸潤性癌之間,單發(fā)癌與復發(fā)癌之間，初發(fā)性癌與復發(fā)性癌之間，Livin蛋白陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，Livin的表達和臨床特征的關系結果表明11例BTCC淋巴轉(zhuǎn)移患者均有Livin的表達，表明Livin的高表達與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關，同時與腫瘤的惡性程度呈正相關。我們在研究中還發(fā)現(xiàn)在膀胱移行細胞癌中，Livin蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生特點無關(P>0.05),這說明Livin蛋白表達可能與上述因素無相關性，具體機制尚待進一步研究。細胞凋亡抑制因子Livin在BTCC組織中表達增加，提示Livin可能通過抑制細胞凋亡，對BTCC的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，Livin在膀胱癌中的高表達有望成為一種有效、敏感的瘤標，并為BTCC的基因治療提供新的方向。本研究結果也說明,Livin表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達，即Livin表達與凋亡率呈負相關，表明Livin參與BTCC的凋亡調(diào)控。Gazzaniga等[10]結果顯示Livinα和Livinβ在正常膀胱組織中均無表達,Livinβ在膀胱癌組織中也無表達,而Livinα表達陽性率為23%。進一步分析顯示Livinα表達陽性的患者術后腫瘤平均復發(fā)時間為3.5月,而Livinα表達陰性的患者則延長至27.2月,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示Livinα表達與膀胱癌患者治療預后關系密切。有文獻報道以Livin基因為靶點的RNAi技術可以有效的特異性阻斷內(nèi)源性Livin基因的表達，使得caspase-3活化，明顯增強各種促凋亡因素(如阿霉素、紫外線照射、TNF-α)導致的細胞凋亡率。用Livin基因的反義核酸和Smac肽反向調(diào)節(jié)Livin基因的抗凋亡活性也收到明顯的效果，包括增加化療藥物的促凋亡作用[11，12]。Livin在膀胱移行細胞癌細胞凋亡的調(diào)控方面起著顯著作用。其機制可能是抑制Caspase途徑從而抑制細胞的凋亡，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但相關課題研究較少，尚需進一步探究。

1 Ashhab Y,Alian A,Polliack A,et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with differentbiological properties and tissue distribution pattern.FEBS Lett,2001,495:56-60.

2 Kasof GM,Gomes BC.Livin,anovel inbitor of apoptosis protein family member .J Biol Chem,2001,276:3238-3246.

3 Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et al.MLIAP,anovel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas.Curr Biol,2000,10:1359-1366.

4 Schmollinger JC, Vonderheide RH,Hoar KM,et al.Melanoma inhibitor of apoptosis protein (ML-IAP) is a target for immune-mediated tumor destruction.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:3398-3403.

5 Tanabe H,Yagihashi A,Tsuji N，et al.Expression of survivin mRNA and livin mRNA in non-small-cell lung cancer.Lung Cancer, 2004,46 299-304.

6 Hariu H,Hirohashi Y,Tcrigce T,et al.Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family,Livin/ML-IAP in lung cancer.Clin Cancer Res,2005,11:1000-1009.

7 孫建國，廖榮霞，陳正堂，等.一種新的凋亡抑制蛋白Livin在非小細胞肺癌組織中的表達.重慶醫(yī)學,2004,33:982-984.

8 Ka H,Hunt JS.Temporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human placentas,Am J Pathol,2003,163:413-422.

9 Yagihashi A,Asanuma K,Tsuji N,et al.Detection of anti-livin antibody in gastrointestinal cancer rpatients.ClinChem,2003,49:1206-1208.

10 Gazzaniga P,Gradilone A,Giulian L,et al.Expression and prognostic significance of LIVIN,SURVIVIN and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer.Annoncol,2003,14:85-90.

11 I Crnkovic-Merrens,F Hoppe-Seyler,Butz K,Induction of apoptosis in tumor cells by siRNA-mediated silencing of the Livin/ML-IAP/KIAP gene,Onco gene,2003,22:8330-8336.

12 楊立軍,鄭文武,周安傳,等.Livin和Bcl-2蛋白生物學特性及與膀胱移行細胞癌關系的研究進展.河北醫(yī)藥,2016,38:2349-2353.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.013

050051 河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科(楊立軍、蘇曉哲、吳亞東、李珅)；河北省石家莊市第二醫(yī)院中西醫(yī)結合科(鄭文武)；河北省辛集市中醫(yī)院中西醫(yī)結合外科(周安傳)

R 737.14

A

1002-7386(2017)14-2132-04

2017-02-13)