雷夢林，連世超

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031；2.山西大學生物工程學院，山西太原030006）

大豆細胞質(zhì)雄性不育恢復基因的SSR標記定位

雷夢林1，連世超2

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031；2.山西大學生物工程學院，山西太原030006）

利用組合不育系SXJLCMS1A×恢復系Z-119-99構(gòu)建F2育性分離群體，進行育性的遺傳模式分析和恢復基因定位。結(jié)果表明，F(xiàn)1群體全為可育株，F(xiàn)2群體的可育株與半不育株經(jīng)卡方測驗符合1∶1的分離比例，說明該大豆細胞質(zhì)雄性不育符合單基因配子體不育的遺傳模式；利用F2分離群體，采用445對大豆SSR引物對其恢復基因進行分子標記和定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該恢復基因與J連鎖群的2個標記Satt674和Satt249連鎖，距2個標記的遺傳距離分別為8.7，9.6 cM。

大豆；基因定位；細胞質(zhì)雄性不育

細胞質(zhì)雄性不育是作物雜種優(yōu)勢利用的基礎[1]。有關(guān)大豆細胞質(zhì)雄性不育的研究是DAVIS[2]首次在美國的專利中報道。孫寰等[3]育成了我國第1個細胞質(zhì)雄性不育系，并實現(xiàn)栽培大豆三系配套。目前，我國已育成適應于不同生態(tài)區(qū)種植、農(nóng)藝性狀良好、不育度高、育性穩(wěn)定的優(yōu)良不育系10多個[4-10]，并審定了多個大豆雜交品種[11-14]。雖然我國在大豆細胞質(zhì)雄性不育的應用方面已經(jīng)取得了長足的進展，但對其機制研究仍然相對滯后。因此，研究大豆細胞質(zhì)雄性不育的形成原因及育性恢復的機制，對了解大豆細胞質(zhì)雄性不育的機制具有重要的理論價值與實際意義[15]。

利用SSR（Simple Sequence Repeats，SSR）標記定位基因是研究大豆細胞質(zhì)雄性不育育性恢復機制的主要手段之一。趙麗梅等[16]、許占友等[17]、WANG等[18]、董建生等[19]、湯復躍等[20]、李曙光等[21]、連世超等[22]、楊守萍等[23]、DONG等[24]以及YANG等[25]都利用分子標記手段對大豆不同細胞質(zhì)雄性不育恢復基因進行了研究，已將不同的大豆恢復基因定位在不同的連鎖群上，可見，大豆細胞質(zhì)遺傳基礎是比較復雜的。

本研究利用大豆細胞質(zhì)雄性不育系SXJLCMS1A和恢復系Z-119-99構(gòu)建分離群體，對恢復基因進行遺傳定位分析，以期獲得與恢復基因連鎖的SSR標記，為進一步精細定位并克隆該恢復基因打下基礎。

1 材料和方法

1.1 大豆細胞質(zhì)雄性不育的遺傳分析

大豆細胞質(zhì)雄性不育系SXJLCMS1A和恢復系Z-119-99試驗材料由山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所衛(wèi)保國研究員提供。以SXJLCMS1A為母本、Z-119-99為父本構(gòu)建F1群體和F2群體。參試材料于2012—2014年在山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所榆次東陽大豆試驗基地網(wǎng)室內(nèi)種植。

大豆盛花期，采摘每株植株中上部當天即將開放的花蕾3朵，用1%I2-KI染色法觀察父母本及F1，F(xiàn)2的花粉育性，隨機選取3個視野，分別統(tǒng)計不育和可育花粉粒的數(shù)目，計算花粉敗育率。

成熟期，大豆植株育性鑒定標準為：不育株表現(xiàn)為整株呈濃綠色，葉片肥厚不脫落，莖稈粗壯，結(jié)有大量未受精的幼嫩肉莢；可育植株表現(xiàn)正常，植株葉片呈黃色并脫落，有大量結(jié)實莢。

通過盛花期和成熟期的育性表現(xiàn)，F(xiàn)2群體的植株分為可育和半不育2類，并采用檢測方法對育性分離結(jié)果進行遺傳分析。

1.2 SSR標記分析

在大豆三節(jié)期，從母本、父本、F1和F2群體植株上分單株摘取葉片，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。通過CTAB[26]法提取葉片DNA。

利用混合分析法[27]（bulked segregate analysis，BSA），在不育系群體中隨機選取10株不育系單株的等量DNA混合構(gòu)成不育基因池。在F2群體中隨機選取10株可育單株的等量DNA混合構(gòu)成可育基因池；隨機選取10株半不育單株的等量DNA混合構(gòu)成半不育基因池。

從SoyBase網(wǎng)站（http://soybase.org/）上均勻挑選分布在大豆20個連鎖群上的SSR引物445對，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成所有引物。PCR反應體系（10 μL）：0.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），2 μLPrimer（10 μmol/L），5 μL模板DNA（10 ng/μL），1μL10×PCRbuffer，0.1μLReal Taq DNAPolymerase（5 U/μL），1.4 μL dd H2O。PCR反應在BIO-RAD C1000 Thermal Cycler擴增儀中進行。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，退火溫度下退火30 s，72℃延伸30 s，共進行34個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，用數(shù)碼相機記錄試驗結(jié)果。

根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物電泳顯示的帶型，與可育基因池帶型一致記錄為“A”，與半不育帶型一致記錄為“B”，與不育系帶型一致記為“C”，將統(tǒng)計結(jié)果用Join Map 4.0作圖軟件分析標記與恢復基因之間的連鎖關(guān)系，構(gòu)建分子遺傳圖譜，并計算遺傳距離[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞質(zhì)雄性不育SXJLCMS1A的遺傳模式分析

通過對不育系SXJLCMS1A全部植株花粉進行鏡檢，結(jié)果表現(xiàn)為花粉全不育（圖1-A），而恢復系Z-119-99表現(xiàn)為全可育（圖1-C）。SXCMS1A和Z-119-99的F1群體在花期進行鏡檢，結(jié)果顯示全為半不育（圖1-B），統(tǒng)計計算F1花粉敗育率為55.52%，接近50%，成熟期全部表現(xiàn)為可育株。SXCMS1A和Z-119-99的F2群體共317株，花粉鏡檢表現(xiàn)為可育和半不育2種類型?；ǚ塾詤⒖紝O寰等[29]提出的大豆花粉育性判定標準，可育株、半不育株的數(shù)量分別為151，166，經(jīng)卡方檢測符合1∶1（χ2＝0.33，P＝0.56＞0.05）的分離比例（表1），F(xiàn)2群體成熟期的育性表現(xiàn)支持該分離結(jié)果。因此，推測該大豆細胞質(zhì)雄性不育符合單基因配子體不育遺傳特點。

表1 F2群體植株育性分離的適合性測驗

2.2 大豆細胞質(zhì)雄性不育恢復基因定位

通過遺傳分析研究，已經(jīng)確認大豆細胞質(zhì)雄性不育屬于單基因配子體不育。利用445對SSR引物對構(gòu)建的可育基因池、不育基因池、半不育基因池和父母本進行多態(tài)性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于J連鎖群上的標記Satt674，Satt249擴增產(chǎn)物表現(xiàn)出特異的多態(tài)性。利用標記Satt674，Satt249對F2群體進行擴增（圖2-A，B），統(tǒng)計群體的多態(tài)性結(jié)果，并結(jié)合表型鑒定結(jié)果，用Join Map 4.0遺傳作圖軟件進行作圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與恢復基因連鎖的SSR引物Satt674，Satt249的遺傳距離分別為8.7，9.6 cM（圖3）。

3 討論

花粉育性劃分標準是對細胞質(zhì)雄性不育及其恢復性遺傳研究的前提條件，本研究參考孫寰等[29]提出的大豆敗育率劃分標準，將試驗中的大豆花粉分為不育、半不育和可育3類，其中，不育花粉的敗育率為90.1%～100%、半不育花粉的敗育率為10.1%～90%、可育花粉的敗育率為0～10%。通過界定，將F2群體的花粉育性區(qū)分開來，以期獲得更可靠的試驗數(shù)據(jù)。此外，試驗鑒定花粉育性還運用目測法觀察花藥的散粉情況，不育株上的花藥瘦小、干癟，花藥不開裂或開裂不散粉；而可育株上的花藥開裂，有大量的花粉且形態(tài)飽滿，花粉為淡黃色。在大豆成熟期，通過對植株的形態(tài)特征再一次鑒定植株的育性，大大降低了只用一種方法的局限性和誤差。因此，在育性鑒定方法上的研究是可行的。

采用分子標記定位基因是作物研究雜種優(yōu)勢利用的前提。試驗采用445對SSR引物對大豆細胞質(zhì)雄性不育的恢復基因進行分子標記定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與恢復基因連鎖的標記Satt674和Satt249，但遺傳距離為8.7 cM還是很大的距離，這不利于后續(xù)的精細定位和克隆基因等。出現(xiàn)以上不足可能的原因是：一群體數(shù)量不夠大；二標記類型單一；三標記數(shù)量不多。這需要在后續(xù)試驗加以改進，為獲得更緊密的分子標記，并為克隆相關(guān)恢復基因和分子標記輔助育種奠定基礎。

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M apping for Fertility Restoring Genes of Cytop lasm ic M ale Sterility in Soybean by SSR Marker

LEI Menglin1，LIANShichao2
（1.Institute ofCrop Germplasm Resources，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Key Laboratory ofCrop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry ofAgriculture，Shanxi Key Laboratory ofGenetic Resources and Genetic Improvement ofMinor Crops，Taiyuan 030031，China；2.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Utilization of the cytoplasmic male sterile（CMS）line SXJLCMS1A×Z-119-99 constructed F2segregation population, cytoplasmic male sterility restorer gene was located using SSR markers in soybean.The results showed that the F1pollen were fertile.The separation ratio of fertile plants and semi-sterility plants of F2was 1∶1,which was under χ2test.The results of this study showed that cytoplasmic male sterile lines was controlled by single gene gametophyte sterility.The mapping results on F2showed that out of 445 random ly selected SSR markers Satt674 and Satt249 on linkage group J were linked to the male fertility gene Rf with their genetic distances of8.7,9.6 cM.

soybean;gene mapping;cytoplasmic male sterility

S565.1

：A

：1002-2481（2017）07-1053-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.07.01

2017-04-13

山西省青年科技研究基金項目（2014021029-1）

雷夢林（1984-），女，四川巴中人，助理研究員，主要從事大豆雜種優(yōu)勢利用研究工作。