張芝慧 邵 韻/編譯

挖掘微生物：為抗爭疾病創(chuàng)造基因組工具

張芝慧 邵 韻/編譯

成千上萬不同的細菌種類構成了人類的腸道植物群

●隨著DNA測序成本越來越低，基因組學已經(jīng)成為研究個體微生物及微生物群落的流行工具。如今，各式各樣的測序技術已整裝待發(fā)，從樣本采集至分析等各方面來協(xié)助研究人員。

2015年，倫敦皇家布朗普敦醫(yī)院重癥監(jiān)護室的幾位患者出現(xiàn)了不明原因的病癥。醫(yī)生懷疑是真菌感染，但是難以確診，而培養(yǎng)病人血液中的菌類又需要時間。于是，他們請來了倫敦帝國大學的遺傳流行病學家喬·羅德斯（Jo Rhodes）。在使用了名叫MinlON的微型DNA測序機后，羅德斯確認了病原體為念珠菌，這是2009年在日本首次發(fā)現(xiàn)的新的真菌種類。通過與患者的序列比較，羅德斯可以判斷疫情爆發(fā)始于單一源頭，可能是受污染設備。她為真菌建立了一個完整的基因組，通過與美國疾病預防控制中心從世界各地收集的念珠菌序列進行對比，確定了醫(yī)院菌株與來自印度或巴基斯坦的菌株相關。

盡管疫情爆發(fā)在找到準確源頭前就已被控制，羅德斯認為如此迅速的測序能夠提供重要的醫(yī)療信息。例如，測序能夠鑒定對氟康唑有抗藥性的基因，這將有助于醫(yī)生避免常見但在一些情況下無用的治療。

個體化醫(yī)療并不是這類微生物DNA閱讀的唯一應用。加州大學戴維斯分校的進化微生物學家喬納森·艾森（Jonathan Eisen）說：“低成本測序已經(jīng)徹底顛覆了微生物基因組學。一個細菌或古細菌的完整基因組成本可能低于100美元。”研究人員正在收集微生物基因組以鑒定各種疾病的原因，從簡單的病毒感染到復雜的疾病，如受到腸道微生物群落影響的癌癥。他們正利用基因組探索新型治療方法，包括微生物本體及其產(chǎn)物。研究人員同時也在研究許多其他微生物的基因組，如污染供水中的微生物基因組。

對微生物中的核糖體RNA（rRNA）基因進行測序能夠幫助研究人員在屬級鑒別它們。然而，許多研究人員想要額外的數(shù)據(jù)，例如，對于單個或群組樣本中不同功能的基因，只有通過全面測序才能夠提供。

去哪里找糞便？

研究人員開始處理數(shù)據(jù)前，他們有一個更基本的挑戰(zhàn)——獲取樣本。在阿肯色州小石城的兒童研究中心，臨床研究學家約翰·斯拉特里（John Slattery）和他的同事們致力于研究自閉癥譜系障礙（ASD）的發(fā)病原因和生理特征。近期，他們正著重研究患者腸道中的微生物，這些微生物可能是造成ASD患者胃腸道問題和線粒體功能障礙的主要原因。斯拉特里希望對ASD患者的腸道微生物進行更深入的研究，但有一個問題，糞便樣本很難獲取。捐贈者必須使用一種叫“收集帽”的笨重容器。對于兒童和他們的家長來說，這是非常令人反感的。而80%患有ASD的兒童有便秘、腹瀉或兩種癥狀交替出現(xiàn)，這讓獲取糞便樣本難上加難。這就是斯拉特里堅持使用科羅拉多州森特尼爾市BioCollective公司研制的BioCollector取樣器材的原因。BioCollector可以方便地掛在坐便器蓋上，并在使用后自動密封?！斑@就像一個糟糕的禮物，”斯拉特里說，“你不需要看到它?！?/p>

2015年成立的BioCollective公司，為愿意提供糞便樣本的人和想要研究糞便的科學家建立了一種不尋常的合作關系。糞便捐贈者花費39.95美元購買一個BioCollector，在收集樣本并寄出后，他們的腸道微生物會用rRNA基因測序進行盡可能精確的鑒定。之后，捐贈者會得到BioCollective將樣本賣給研究者10%的利潤。對于研究者來說，他們可以輕松、高效、低成本地獲取不同的糞便樣本以及捐贈者數(shù)據(jù)，例如捐贈者服用過的抗生素或他們?nèi)棠偷膲毫Φ?。BioCollective公司的CEO及創(chuàng)始人瑪莎·卡爾林（Martha Carlin）甚至希望通過幾個健康樣本的混合，開發(fā)一種“標準”糞便樣本。

除去以上的優(yōu)勢，BioCollective公司可以提供特定病情或特定飲食的捐贈者樣本。例如，位于威斯康星州沃瓦托撒市農(nóng)業(yè)生物科學公司的生物化學家諾亞·齊默爾曼（Noah Zimmerman）希望研究多酚（蔬果中多彩及有益的成分）對腸道微生物的影響。為了幫助齊默爾曼，BioCollective公司召集了在提供樣本前愿意保持高多酚飲食一個月的捐贈者。

在研究者得到樣本后，他們不必自己進行樣本的基因分析，有許多的研究組織愿意幫助研究者進行基因測序和分析，例如馬里蘭州洛克威爾市的CosmosID公司、德克薩斯州休斯頓市的Diversigen公司和加利福尼亞州南舊金山市的Second Genome Solutions公司。

對于凈化過的微生物，研究者可以直接對基因組或轉錄組進行序列分析以鑒定基因表達模式。CosmosID公司副總經(jīng)理及研發(fā)部門主管諾爾·哈桑（Nur Hasan）表示，僅僅這些簡單分析就可以為研究者提供許多信息。該公司可以對客戶提供的凈化過的菌簇進行測序，然后進行生物信息學分析，以提供如該樣本在微生物演化樹中的位置、該微生物具有何種抗藥性和該微生物具有何種毒力因子等信息。

Diversigen的市場銷售部門經(jīng)理簡-菲利普·萊恩（Jean-Philippe Laine）表示，對于培養(yǎng)微生物用于食物或藥物的公司來說，掌握所涉微生物的完整序列至關重要。

MinlON裝置可以收集多個長而有持續(xù)性的數(shù)據(jù)，對于組裝完整的微生物基因組格外有幫助，例如來自新型長頸鹿病原體的微生物基因組。

長頸鹿疣

盡管Diversigen公司使用的新一代測序機依然人氣不減，羅德斯所使用的由牛津納諾珀爾科技有限公司生產(chǎn)的MinION自2015年成為另一個選擇。MinION透過薄膜上的納米孔隙提供DNA鏈，同時通過這些孔隙輸送電流。當腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤穿過孔隙時會對電流產(chǎn)生不同的改變，使得MinION可以讀取相關序列。

這個比USB稍大的設備可以通過多個孔隙同時讀取多重DNA鏈，并且擅長收集長而有持續(xù)性的數(shù)據(jù)，這使得MinION特別有助于組裝完整的微生物基因組。

來自南非和丹麥動物園的獸醫(yī)們在長頸鹿的臉上發(fā)現(xiàn)了奇怪的病變，于是他們向比利時魯汶大學的分子病毒學家發(fā)送了一些樣本。 MinION在這時候派上了大用場。皮耶特·瑪耶斯（Piet Maes）和他的小組愿意將更多樣本投入到他們經(jīng)常使用的傳統(tǒng)的新一代測序機中，他們寧愿等待，直至等到能夠提供40到160個樣本。然而，瑪耶斯實驗室急于得到長頸鹿樣本結果的博士生博爾特·范梅赫倫（Bert Vanmechelen）選擇了MinION。他解釋道：“MinION讓我們可以在自己的電腦上測序，今天準備樣本，明天就能出結果。”在如此短的時間內(nèi)，范梅赫倫成功對一種新型乳頭瘤病毒的基因完成測序，后被研究人員命名為“長頸鹿鹿豹座乳頭瘤病毒1號”。瑪耶斯說：“這種病毒鏈無法治愈，因此長頸鹿需手術摘除臉部病變區(qū)域。但是至少我們知道感染并不是其他更嚴重的情況?！?/p>

MinION同時也擁有現(xiàn)場能力，在非洲疫情期間用于監(jiān)測埃博拉病毒的演化，甚至還被發(fā)射到國際空間站。

由微至宏

羅德斯和范梅赫倫各有單個微生物來測序，但微生物群的情況更為復雜。位于洛克威爾市Synthetic Biologic公司的研究部門副經(jīng)理希拉·康奈利（Sheila Connelly）說：“微生物學家似乎從簡單用rRNA基因鑒別微生物種類轉變到更深度的完整基因組測序?！笨的卫_始研究抗生素對豬的腸道微生物改變有何影響，這種影響和改變是否會加劇像艱難梭狀芽胞桿菌這一類感染的發(fā)生，這是一個重要的醫(yī)療問題?？的卫x擇了與CosmosID公司合作研究。這對合作者使用了宏基因組學方法，對康奈利所有的豬糞樣本DNA進行了鳥槍法測序。測序結果提供了一份對微生物群中細菌種類及其相對數(shù)量預測的清單，以及可能整體存在于該群落中的抗生素基因清單。哈桑表示，CosmosID公司能夠為其客戶提供這些數(shù)據(jù)（微生物群中的細菌種類及細菌鏈等）都要歸功于他們精心整理的標準微生物基因組數(shù)據(jù)庫。從這些數(shù)據(jù)中，康奈利和她的同事不僅確定了抗生素對豬腸道細菌分布的影響,也觀察到了細菌群落對抗生素的耐藥性。康奈利表示，這可以解釋為何抗生素頭孢曲松的使用允許對多種藥物似乎有抗藥性的微生物接近。

這項研究幫助Synthetic Biologics公司推出了他們的主要產(chǎn)品之一——ribaxamase,一種可以保護健康腸道微生物免受某些靜脈注射抗生素擾亂侵害和阻止更多有害微生物進入腸道的口服藥物。這種藥物會停留在胃腸道，降解任何抵達腸道的靜脈注射抗生素，但不干擾其在身體其他部位的正常藥效。在人體臨床試驗中，ribaxamase已證實降低了艱難梭狀芽孢桿菌的感染。

Second Genome公司的首席商務官莫漢·萊爾（Mohan Lyer）表示，如同 Synthetic Biologics 公司，Second Genome公司也旨在將微生物基因組變成藥物。比如，Second Genome公司將微生物與其功能進行比較，分別分析加重潰瘍性結腸炎患者、控制型結腸炎患者和健康人的胃腸活檢。通過基因組和轉錄組測序，研究人員確定了在健康和發(fā)炎的腸道中哪些微生物是存在的，哪些基因是表達的。從這個結果，研究人員可以得出結論：哪些由細菌組成的分子是會促進或阻擋炎癥的。Second Genome公司正在研發(fā)一款平復炎癥的藥物，目前處于人體試驗第一階段。

“FishTaco”計算方法

像Second Genome，CosmosID和Diversigen這樣的公司可以完成各項工作，從樣本準備、測序到生物信息學分析，這使得科學家即使缺乏專業(yè)知識仍然能夠探測微生物基因組。但是，那些擁有專業(yè)知識及興趣的研究人員自主研發(fā)了新型的工具并與大家共享。

位于西雅圖的華盛頓大學的計算生物學家阿爾哈南·伯倫斯坦（Elhanan Borenstein）表示，大部分的分析工具都會提出下列問題：“樣本中有哪些微生物群？”或者“這個微生物群中有什么基因？”這兩個問題就像兩塊拼圖，而整合這兩個數(shù)據(jù)庫并不容易。這其中的問題在于：不同的分類群組在不同人的微生物群中發(fā)揮著相似的作用。伯倫斯坦的實驗室最近提出了一個解決方案，被稱為“功能轉移分類學貢獻者”的計算方法，簡稱 FishTaco。

對初學者，F(xiàn)ishTaco方法將調(diào)查微生物樣本中的所有群組，根據(jù)已知的基因組推測宏基因組測序中的哪些基因與哪些微生物有關聯(lián)。同時，當某個微生物的基因組不可獲得時，這種方法也可以推測哪些基因組屬于哪些種類。接著，這些信息便可以幫助科學家判斷：哪些物種或種群對正在比較的宏基因組和微生物群之間的關鍵差異負責。例如，伯倫斯坦和他的同事對Ⅱ型糖尿病患者和健康人的腸道微生物排序數(shù)據(jù)進行了比較。宏基因組數(shù)據(jù)顯示在糖尿病患者樣本中有幾種糖分傳遞基因過量，然而，是哪個細菌導致了過多的糖分攝入？FishTaco方法確定了欸西氏菌屬對其中一個種類糖分的輸送負責，而雙歧桿菌的分子對另一種糖分的輸送負責。

伯倫斯坦說：“這類信息可以幫助科學家通過重新平衡執(zhí)行所需功能的物種，例如通過抗生素或益生菌治療以改善健康。這將為個體化和專門干預手段打開大門?！?/p>

位于德克薩斯州休斯敦市的兒童微生物研究中心及貝勒醫(yī)學院的微生物生態(tài)學家艾米莉·霍利