李忠強(qiáng)　鄭偉　閆春梅　韓葉

摘 要 作為最具潛力的抗生素替代藥物，抗菌肽業(yè)已成為業(yè)界研究重點(diǎn)。為了解決抗菌肽因產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高而無法大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用的難題，研究人員適時引入了基因工程技術(shù)，人工構(gòu)建抗菌肽基因，進(jìn)而研發(fā)基因工程抗菌肽藥物。本文分析了抗菌肽基因工程化的研究歷程，為抗菌肽的深入研究及廣泛應(yīng)用添磚加瓦。

關(guān)鍵詞 抗菌肽；基因工程

中圖分類號 Q7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 2095-6363（2017）11-0027-02

基因工程技術(shù)在傳統(tǒng)生產(chǎn)中的應(yīng)用，生產(chǎn)高效低毒的新型抗生素是中國今后發(fā)展生物醫(yī)藥的重點(diǎn)之一?？咕氖巧矬w天然免疫的重要組成部分，是應(yīng)對病原物質(zhì)侵染而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答產(chǎn)物[1]，在生物體的整個防御體系中有著顯著的作用?？咕囊彩且环N新型的多肽藥物——一類膜活性多肽，同時具備抗霉菌、廣譜殺菌、抑病毒、抑殺腫瘤細(xì)胞等多重功效。作為一種最具潛力的新型抗生素，降低成本、提高產(chǎn)量是對抗菌肽研究及廣泛應(yīng)用的基本要求。目前廣大科研工作者致力于研究運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建新型抗菌肽基因，再經(jīng)微生物培養(yǎng)得到相應(yīng)抗菌肽，希望最終能得到新型基因工程抗菌肽型抗生素。另外，對抗菌肽基因工程改良動物或植物的研究早已展開，目前已獲得具有轉(zhuǎn)抗菌肽基因動植物，均具有較高抗病性。近期研究中，由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率高、成本低，也成為抗菌肽基因工程表達(dá)的良好方式。

1 抗菌肽基因表達(dá)

對于基因表達(dá)，較常用的方法包括原核表達(dá)和真核表達(dá)。目前原核表達(dá)多采用大腸桿菌工程菌（E.coli）；真核表達(dá)包括酵母表達(dá)、桿狀病毒表達(dá)等。針對抗菌肽基因表達(dá)研究，目前在原核表達(dá)和真核表達(dá)方面均有

開展。

1.1 原核表達(dá)

抗菌肽，因其對宿主菌E.coli有很強(qiáng)的殺傷力而不能直接表達(dá)[2]。目前為止，對抗菌肽的原核表達(dá)多采用先融合表達(dá)再裂解純化的方法。早在1994年，在E.coli中將鏈霉素枯草桿菌蛋白酶抑制物（SSI）與蜜蜂抗菌肽apidaecin 1b（AP1）融合表達(dá)，得出了SSI-AP1融合蛋白[3]。之后，以硫氧還蛋白作為載體，融合人源抗菌肽LL-37[4]、抗菌肽ranalexin[5]在E.coli中表達(dá)，均得到高表達(dá)量蛋白。除此之外，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST和泛素相關(guān)小蛋白修飾SUMO，均可作為載體，促進(jìn)抗菌肽在E.coli中進(jìn)行可溶性表達(dá)[6]。另外，類固醇異構(gòu)酶、PaP3.30、TAF12組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域和Purf片段等可促進(jìn)抗菌肽在E.coli中進(jìn)行包涵體

表達(dá)[7]。

1.2 在酵母中真核表達(dá)

采用酵母系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽基因是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的方法，1999年就有在釀酒酵母中表達(dá)出sarcotoxin 1A的報道，并成功檢測到與成熟sarcotoxin 1A分子量相近的肽[8]。2003年，劉忠淵等利用酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制性的新疆家蠶抗菌肽cecropin基因，抑菌圈達(dá)1.5cm[9]。2004年，張素芳等[10]成功構(gòu)建了分泌型重組酵母表達(dá)載體p PICZA-A-mag和p PICZA-A-CM，獲得了類似天然抗菌肽大小的magainin及cec A-mil蛋白。兩者對金黃色葡萄球菌及E.coli均有較好的抑殺性。2016年，陳騫等通過Infusion技術(shù)成功構(gòu)建了pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重組質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)化將線性化pPIC9K-CAMPs轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115基因組中，篩選高拷貝菌株GS-PK-CAMPs。再將線性化pPICZαA-CAMPs轉(zhuǎn)入重組酵母GS-PK-CAMPs中，篩選出高拷貝菌株GS-PKZ-CAMPs。最終成功獲得了GS-PKZ-CAMPs可誘導(dǎo)表達(dá)菌株[11]。

1.3 在桿狀病毒中表達(dá)

利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽也是當(dāng)前抗菌肽基因工程表達(dá)研究中應(yīng)用較廣泛的方法。2001年，趙東紅利用Bac to Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在甜菜夜蛾蟲體中成功表達(dá)出了中國家蠶抗菌肽人工合成類CMIV基因[12]。2008年，趙昆等在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中成功表達(dá)了?？咕腂ac7-Bac5-β defense串聯(lián)基因，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)座載體，轉(zhuǎn)化DH10 Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒穿梭載體，最終獲得了具有抑菌活性的重組蛋白[13]。2013年，劉暉等也采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了含家蠅抗菌肽attacin重組桿狀病毒表達(dá)載體[14]。

2 轉(zhuǎn)抗菌肽基因動物

2.1 昆蟲

現(xiàn)階段下，在我國國內(nèi)關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物的研究已經(jīng)如火如荼，如何將具有抗病性的抗菌肽基因轉(zhuǎn)化到動物體內(nèi)，用以提高動物體的抗病力成為國內(nèi)外研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)，經(jīng)多年研究，業(yè)已取得了一些進(jìn)展。早在1998年，Possani LD 等成功構(gòu)建了一種轉(zhuǎn)抗菌肽基因蚊子，利用蚊子腸道合成并分泌shiva 3抗菌肽基因，用來控制瘧疾的傳播，取得了一定的成效[15]。

2001年，趙東紅等構(gòu)建了轉(zhuǎn)抗菌肽基因甜菜夜蛾幼蟲，在蟲體內(nèi)檢測到有類CMIV mRNA的存在，并在蟲體血淋巴中檢測到抗菌活性[12]。

2.2 鼠

在國內(nèi)外，鼠類是研究轉(zhuǎn)基因動物最常實驗的動物模型。為了提高整合效率，在外源基因的兩端加上具有隔離作用的MAR序列和微衛(wèi)星序列，與染色體上的微衛(wèi)星序列同源重組，已達(dá)到預(yù)期效果?？梢园丫幋a抗菌肽的基因轉(zhuǎn)入到指定的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

董銳選用豬源抗菌肽PR39構(gòu)建了表達(dá)載體pCMS-EGFP-PR39，經(jīng)原核顯微注射法，制備了8只F0代轉(zhuǎn)PR39基因小鼠，通過人工感染豬胸膜肺炎放線桿菌，比較了轉(zhuǎn)PR39基因小鼠與其同窩的野生型小鼠之間的抑菌能力差異。證明了轉(zhuǎn)基因表達(dá)PR39可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小鼠對細(xì)菌的抵抗力[16]。

3 轉(zhuǎn)抗菌肽基因植物

植物轉(zhuǎn)基因的研究方法日趨成熟。抗菌肽被應(yīng)用于培育抗病新品種，如抗菌煙草、水稻抗白葉枯病等。另外，抗菌肽轉(zhuǎn)入植物具有明顯的殺蟲作用。韋鵬飛以轉(zhuǎn)抗菌肽D基因的中華獼猴桃抗性芽為材料，通過誘導(dǎo)生根和移栽獲得獼猴桃盆栽苗。對盆栽苗進(jìn)行PCR和RT-PCR鑒定表明，抗菌肽D基因已經(jīng)整合到獼猴桃基因組中，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。對盆栽苗葉片中的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性分析結(jié)果表明，在噴施獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌的條件下，轉(zhuǎn)基因植株的CAT和POD活性比未轉(zhuǎn)基因植株明顯降低，PAL活性比未轉(zhuǎn)基因植株明顯升高[17]。

4 抗菌肽基因改造前景

抗菌肽基因分子量小，其表達(dá)產(chǎn)物容易降解，檢測和純化都有一定困難，即使融合蛋白的表達(dá)量較高，目的蛋白的表達(dá)策略也很準(zhǔn)確，但要獲取表達(dá)量較高的目的蛋白仍然非常困難。當(dāng)高拷貝基因串聯(lián)時，基因之間必須首尾同向相連，否則會引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定，同時導(dǎo)致反向基因表達(dá)的蛋白錯誤，這將會很大程度上提高串聯(lián)構(gòu)建的難度性。目前，國內(nèi)外學(xué)者逐步致力于從分子角度改造抗菌肽并優(yōu)化抗菌肽的表達(dá)[18]。諸如氨基酸殘基設(shè)計[19]、肽片段拼接設(shè)計[20]、肽鏈環(huán)合設(shè)計[21]、靶向設(shè)計[22]、多基因共表達(dá)[23]等。均獲得了一定的科研成果，為抗菌肽基因工程化改造注入了新鮮活力。隨著科學(xué)研究手段和方法的日趨完善，抗菌肽基因改造也勢必迎來廣闊的發(fā)展空間，為提高動植物的抗病力提供強(qiáng)大的科技支撐。

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