王連平，方 麗，謝昀華，王漢榮

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛灰霉病病原學(xué)初步研究

王連平，方 麗，謝昀華，王漢榮*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

2013—2014年，從浙江樂清、新昌、建德、富陽、龍游等石斛產(chǎn)區(qū)采集感染灰霉病的鐵皮石斛病葉，從中分離純化出真菌分離物，對(duì)分離物的培養(yǎng)性狀和繁殖體特征進(jìn)行觀測(cè)。取10株分離物進(jìn)行離體和盆栽致病性試驗(yàn)，從盆栽致病植株上采集病葉，分離并觀測(cè)分離物。結(jié)果顯示，從產(chǎn)區(qū)采集的鐵皮石斛病葉上分離到的真菌分離物是灰葡萄孢霉(BotrytiscinereaPers.ex Fr.)，10株分離物均對(duì)離體和盆栽石斛葉片致病，從盆栽致病植株上采集的病葉能分離出與原接種分離物相同的真菌。根據(jù)科赫氏法則，石斛灰霉病的病原是灰葡萄孢霉，是一種石斛新病害。

鐵皮石斛； 灰霉?。?病原

鐵皮石斛(DeudrobiumofficinaleKimura et Migo)是一種名貴的蘭科中藥材?，F(xiàn)在鐵皮石斛野生資源極少，主要以人工栽培為主，特別是工廠化設(shè)施栽培，主要來源地有浙江、云南、安徽、貴州、江西等。據(jù)報(bào)道，石斛主要病害有炭疽病、黑斑病、軟腐病、自絹病、莖基腐病等[1-5]。近年來，灰霉病在浙江省主要石斛產(chǎn)區(qū)頻繁發(fā)生，一般葉發(fā)病率25%，有時(shí)可高達(dá)90%，是一種危害人工栽培石斛的重要病害。為明確該病的發(fā)病規(guī)律，進(jìn)而提出該病的防治方法，本文對(duì)該病害進(jìn)行了較系統(tǒng)的病原學(xué)研究，現(xiàn)將初步研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)樣采集

石斛灰霉病病樣采集于浙江樂清、新昌、建德、富陽、龍游等地；采樣后將標(biāo)樣稍作陰干，置于信封中帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

1.2 病原菌的分離純化

用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)組織分離，于25 ℃培養(yǎng)純化獲得菌株。人工接種后，采集病樣，經(jīng)相同方法分離獲得菌株[6]。

1.3 病原菌的培養(yǎng)性狀

選取分離物FD13-12，觀測(cè)其主要培養(yǎng)性狀。將分離物接種于PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)20 d，記錄菌落形態(tài)、顏色和子實(shí)體產(chǎn)生情況；測(cè)量100個(gè)分生孢子的大小，重復(fù)3次，計(jì)算平均值[6]。

1.4 致病性測(cè)定

選取FD13-12等10株分離物進(jìn)行致病性測(cè)定。各供試分離物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生分生孢子，用毛筆刷取孢子并與0.1% CMC-Na水溶液混合均勻制成菌懸液，用0.1% CMC-Na水溶液稀釋菌懸液至其含菌量為106·mL-1，該菌懸液是本試驗(yàn)用的接種體。

離體接種試驗(yàn)。摘取外觀健康的石斛中位葉(除去心葉及其下一位葉和末位葉)進(jìn)行試驗(yàn)。在直徑90 mm培養(yǎng)皿底墊3層用無菌水浸濕的濾紙，隨機(jī)取葉片排放在濾紙上，在每片葉的兩端蓋上濕的脫脂棉，每皿5葉。傷口接種試驗(yàn)處理在葉片中央用針頭穿刺1個(gè)小孔。在每張葉片中央滴加20 μL接種體菌懸液，每個(gè)分離物無傷口和有傷口接種試驗(yàn)均涂6個(gè)培養(yǎng)皿共30片葉；對(duì)照用清水涂布葉片。將接種處理培養(yǎng)皿置28 ℃、5 000 lx光照生化培養(yǎng)箱內(nèi)，觀察并記錄發(fā)病情況。

盆栽接種試驗(yàn)。取健康中位葉用印泥標(biāo)記作接種葉，用毛筆將接種體菌懸液均勻涂布在接種葉上，每個(gè)分離物無傷口和有傷口接種試驗(yàn)均涂100個(gè)葉片；對(duì)照用清水涂布葉片。接種處理的植株在濕布圍成的保濕棚中保濕48 h后移去保濕棚，7 d后觀察記錄發(fā)病情況。每個(gè)病原分離物接種處理均采3片病葉，采用1.2節(jié)方法分離病原物，采用1.3節(jié)方法對(duì)新分離物與原分離物進(jìn)行性狀對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀

灰霉病主要侵染鐵皮石斛的葉片及嫩莖。葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點(diǎn)，后小點(diǎn)漸漸擴(kuò)大，有時(shí)呈輪紋狀，病斑與綠色葉片的病健交界處常有褐色至深褐色的暈圈；病斑圓形或橢圓形，淡褐色至黑褐色，中間凹陷，最大病斑可達(dá)鐵皮石斛葉片的邊緣。深秋、冬季和早春石斛發(fā)病后葉片常發(fā)黃，或枯死，或脫落。發(fā)黃的石斛病葉常常帶有橘紅色，而其上病斑則呈淡褐色至黑褐色，病斑與發(fā)黃葉部交界處常常有或深或淺的綠色暈圈；病斑上，尤其是病斑中心常長(zhǎng)有灰褐色的霉層，即病原菌的分生孢子。這些發(fā)黃的石斛病葉輕輕碰觸，即可脫落。在深秋、冬季和早春田間濕度高時(shí)，葉片、嫩梢以及枯黃的葉片有時(shí)會(huì)出現(xiàn)大量水漬狀的濕腐，并在病斑上產(chǎn)生大量的灰褐色的霉層，即病原菌的分生孢子(圖1)。

左上圖為褐色至深褐色的暈圈；右上圖為或深或淺的綠色暈圈；左下圖為水漬狀的濕腐；右下圖為分生孢子圖1 鐵皮石斛灰霉病為害癥狀

2.2 病原菌的形態(tài)及培養(yǎng)性狀

培養(yǎng)基上菌落圓形、白色，營養(yǎng)菌絲半透明、稀疏，氣生菌絲較少。培養(yǎng)4 d后菌落直徑達(dá)到45 mm，培養(yǎng)11 d左右中間部位呈現(xiàn)灰色，后期出現(xiàn)黑色不規(guī)則菌核。

該菌較易產(chǎn)生分生孢子，其產(chǎn)孢量較大。分生孢子單胞，圓形或橢圓形，無色至淡灰褐色，大小7.5～10.8 μm ×4.8～9.6 μm，成簇聚生于分生孢子梗末端的膨大部。分生孢子梗叢生，直立或稍彎曲，大小192.5～387.6 μm×9.7～13.4 μm，淡褐色有隔膜。經(jīng)鑒定，該真菌屬半知菌亞門叢梗孢目叢梗孢科葡萄孢屬灰葡萄孢霉(BotrytiscinereaPers.ex Fr.)。

2.3 致病性

從2013—2014年采自溫州樂清、紹興新昌、杭州建德、杭州富陽、衢州龍游等病樣分離物中，選取10株分離物進(jìn)行離體試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)測(cè)定其致病性。離體接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，10株供試分離物均對(duì)石斛葉片致病，無傷口接種的葉發(fā)病率86.7%～96.7%，有傷口接種的葉發(fā)病率90.0%～100%。采集自不同地區(qū)的分離物致病性有一定差異(表1)。

表1 浙江各石斛產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢霉分離物 致病力測(cè)定(離體試驗(yàn))

盆栽接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，10株供試分離物均對(duì)石斛葉片致病，無傷口接種的葉發(fā)病率80%～91%，有傷口接種的葉發(fā)病率84%～100%，有傷口接種的葉發(fā)病率高于無傷口接種，采集自不同地區(qū)的分離物致病性有一定差異(表2)。每個(gè)分離物接種處理均采3片病葉，從中均能分離到灰葡萄孢霉。該灰葡萄孢霉分離物與原用于接種的灰葡萄孢霉分離物在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀和繁殖體形態(tài)特征相同，說明2種分離物是同一分離物。

3 小結(jié)與討論

3.1 石斛灰霉病的分離物鑒定

根據(jù)對(duì)石斛灰霉病分離物的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀測(cè)，參照魏景超等[7-9]的描述，石斛灰霉病的分離物被鑒定為灰葡萄孢霉，屬半知菌亞門、叢梗孢目、叢梗孢科、葡萄孢屬。

表2 浙江各石斛產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢霉分離物 致病力測(cè)定(盆栽試驗(yàn))

3.2 石斛灰霉病的病原確定

從石斛灰霉病病樣中分離到灰葡萄孢霉，用該分離物成功誘發(fā)出灰霉病，從誘發(fā)出灰霉病的病樣中分離到與原分離物形態(tài)特征一致的灰葡萄孢霉。根據(jù)柯赫氏法則，石斛灰霉病的病原為灰葡萄孢霉。據(jù)報(bào)道，該病原的寄主范圍極為廣泛，幾乎可以寄生所有的雙子葉植物[8-9]，但在鐵皮石斛上尚未見明確的報(bào)道。

3.3 石斛灰霉病發(fā)生原因探討

石斛需要溫暖潮濕、散射光等生長(zhǎng)條件，而這些條件也是多數(shù)病害發(fā)生的適宜條件，在自然狀態(tài)下，由于植株密度小，灰霉病發(fā)生相對(duì)較少、較輕；但在人工栽培條件下，灰霉病則多發(fā)、重發(fā)。人工栽培石斛灰霉病多發(fā)、重發(fā)的原因可能有以下3個(gè)方面：1)人工栽培石斛密度遠(yuǎn)高于自然狀態(tài)；2)人工栽培相對(duì)密閉的環(huán)境及增濕等栽培措施有利于形成灰霉病發(fā)生所需的高濕和結(jié)露的條件；3)人工栽培所采用的增肥等促進(jìn)石斛快速生長(zhǎng)的栽培措施很可能降低植株對(duì)灰霉病的抗病性。

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(責(zé)任編輯：侯春曉)

2017-04-24

樂清院士工作站和院地合作項(xiàng)目(wz20130006)；浙江省特色農(nóng)產(chǎn)品全產(chǎn)業(yè)鏈安全風(fēng)險(xiǎn)管控項(xiàng)目(201303088)

王連平(1965—)，男，副研究員，從事植保技術(shù)研究工作，E-mail:wlp8843@163.com。

王漢榮，E-mail: wanghrg@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170626

S567.23+9

A

0528-9017(2017)06-0990-03

文獻(xiàn)著錄格式：王連平，方麗，謝昀華，等. 鐵皮石斛灰霉病病原學(xué)初步研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(6)：990-992.