任勰珂，陳莉*，盧紅梅，高冰，賈青慧，王珍

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；4.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068）

薏仁米糠蛋白酶法提取工藝的優(yōu)化

任勰珂1，3，陳莉1，3*，盧紅梅1，3，高冰4，賈青慧2，3，王珍1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；4.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068）

為了研究酶法提取薏仁米糠蛋白的最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化薏仁米糠蛋白的提取條件。分析回歸方程確定薏仁米糠蛋白提取率的影響因子，確定最佳提取工藝為料液比1∶29（g∶mL），酶解溫度50℃，酶解時(shí)間1.5 h，酶解pH 9.8。在此最佳提取工藝條件下，薏仁米糠蛋白平均提取率79.66%，產(chǎn)品純度為73.42%。

薏仁米糠蛋白；提?。幻阜?；響應(yīng)面優(yōu)化

薏苡（Coix lacrymajobiL.）為禾本科（Gramineae），屬草本植物，其干燥成熟的種仁稱為薏苡仁，也俗稱為薏仁米、苡仁米、薏米等。貴州省薏仁米資源豐富，黔西南州興仁縣更是在2012年被中國糧食協(xié)會(huì)授予“中國薏仁米之鄉(xiāng)”的稱號(hào)，薏仁米蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過大米，多用于藥品和食品方面[1]。薏仁米糠是薏仁米在加工成精米過程中產(chǎn)生的黃粉，約占其總質(zhì)量的5%。薏仁米糠含有豐富的營養(yǎng)因子，營養(yǎng)成分與米糠相似[2]，其粗多糖、薏苡酯、黃酮等功能性成分均高于其胚乳[3]，目前主要在畜牧業(yè)中用作飼料[4]，國外研究證明米糠作為健康食品的原料加以深度開發(fā)利用，可增值60倍左右[5]。目前國內(nèi)外對(duì)薏仁米的研究主要集中在營養(yǎng)分析、加工利用、活性成分等方面，對(duì)薏仁米糠中蛋白提取的研究較少[6]。蛋白質(zhì)是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，植物蛋白資源豐富、廉價(jià)，并具有獨(dú)特的生理功能，對(duì)其開發(fā)利用已成為當(dāng)今的熱點(diǎn)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)以薏仁米糠為原料，采用酶法提取蛋白質(zhì)，優(yōu)化提取條件以提高薏仁米糠蛋白提取率，研究成果有利于拓寬薏仁米糠的利用價(jià)值，提高其附加值，促進(jìn)資源再利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

薏仁米糠：貴州興誠華英食品有限公司。粉碎后用石油醚振蕩脫脂，風(fēng)干后4℃保存?zhèn)溆?。纖維素酶（50 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、酸性蛋白酶（100 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

石油醚（沸程60～90℃）、硫酸鉀、氫氧化鈉、硼酸、濃鹽酸、濃硫酸（均為分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；ZD-2A自動(dòng)電位滴定儀：上海大普儀器有限公司；CJJ-781磁力加熱攪拌器：城西曉陽電子儀器廠；722S可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；SH220石墨消解儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；DHG-9140B恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 薏仁米糠蛋白提取工藝流程及操作要點(diǎn)

酶法提取：以蛋白提取率為指標(biāo)先確定試驗(yàn)用酶，確定酶種類后，在最佳提取條件下酶解，酶解過程中pH通過滴加10%NaOH溶液；

滅酶：恒溫水浴鍋85℃，滅酶10 min；

離心：4 000 r/min離心15 min，取上清液待用；

上清液等電點(diǎn)沉淀：用15%的鹽酸調(diào)上清液pH至4.20，待蛋白沉淀；

靜置、離心：靜置15 min，4 000 r/min離心15 min，取蛋白沉淀；

真空干燥：真空電熱干燥箱50℃，干燥12 h。

1.3.2 蛋白含量測(cè)定

原料中蛋白含量測(cè)定：參照國標(biāo)GB/T 5511—2008《谷物和豆類氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算凱氏法》[9]，上清液蛋白含量測(cè)定：采用雙縮脲法[10]。

1.3.3 酶的選擇

使用細(xì)胞破壁酶和蛋白酶對(duì)薏仁米蛋白進(jìn)行提取，以蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇最佳的提取用酶，在料液比1∶20（g∶mL），加酶量2%[11]，各酶最適宜條件下，恒溫水浴2h，85℃滅酶10min，4000r/min離心15min，測(cè)定上清液中蛋白含量，計(jì)算薏仁米糠蛋白提取率。同時(shí)做空白試驗(yàn)，除不加酶外，其他同上。試驗(yàn)所用酶種類及其反應(yīng)條件如下：

纖維素酶（50 U/mg）最適pH為4.8，最適溫度50℃；酸性蛋白酶（50 U/mg）最適pH為3.5，最適溫度55℃；中性蛋白酶（100 U/mg）最適pH為7.0，最適溫度50℃；堿性蛋白酶（200 U/mg）最適pH為8.0，最適溫度55℃；復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）最適pH為6.0，最適溫度45℃。

1.3.4 酶法提取薏仁米糠蛋白單因素試驗(yàn)

確定了酶的種類為堿性蛋白酶后，選取加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））、酶解pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）、酶解溫度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）、酶解時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h）5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同因素對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取薏仁米糠蛋白

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)各影響因素加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)行全因素響應(yīng)面分析[12]，因素與水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 計(jì)算公式

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類的選擇

考察不同蛋白酶對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，未經(jīng)蛋白酶作用，薏仁米糠蛋白提取率為15.82%，加入各種蛋白酶后，薏仁米糠蛋白提取率明顯提高，不同種類蛋白酶對(duì)薏仁米糠蛋白提取率影響大小依次為堿性蛋白酶＞纖維素酶＞酸性蛋白酶＞中性蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶。因此，選取堿性蛋白酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同酶類對(duì)薏米糠蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of different enzymes on extraction rate of adlay bran protein

2.2 酶法提取薏仁米糠蛋白的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加酶量對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)加酶量0.5%～1.5%時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率隨著加酶量的增加而增加，這應(yīng)該是隨著加酶量的增大，酶與底物接觸充分，酶對(duì)不溶性蛋白的作用加強(qiáng)，提取率升高；當(dāng)加酶量為1.5%時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率最大，為80.41%；當(dāng)加酶量＞1.5%，薏仁米糠蛋白提取率有所降低，可能是由于過多的酶使蛋白質(zhì)水解過度，疏水性基團(tuán)暴露，使得蛋白空間結(jié)構(gòu)改變，蛋白溶解度降低，提取率下降[14]。因此，選擇堿性蛋白酶加酶量為1.5%。

圖2 堿性蛋白酶添加量對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of alkali protease addition on extraction rate of adlay bran protein

2.2.2 料液比對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

圖3 料液比對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of adlay bran protein

由圖3可知，當(dāng)料液比在1∶10～1∶25（g∶mL）范圍內(nèi)，薏仁米糠蛋白提取率隨料液比的增大而增大；當(dāng)料液比為1∶25（g∶mL）時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率最大，為65.36%；當(dāng)料液比＞1∶25（g∶mL）之后，薏仁米糠蛋白提取率隨之降低。這可能是因?yàn)樵诹弦罕容^低時(shí)，體系黏度較大，流動(dòng)性差，分子的擴(kuò)散速率受影響，體系混亂不均勻，阻礙了傳質(zhì)過程，酶作用效果差，蛋白提取率低[15]；當(dāng)料液比過大時(shí)，堿性蛋白酶被稀釋，濃度降低，與底物作用幾率降低，使蛋白提取率降低。因此，選擇酶解料液比為1∶25（g∶mL）。

2.2.3 酶解pH對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

由圖4可知，在pH在7.0～9.5范圍內(nèi)，薏仁米糠蛋白提取率隨著pH的增大迅速增大；在pH為9.5時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率最大，為83.05%；pH＞9.5之后，薏米糠蛋白提取率隨著pH的增大而降低。過高或過低的pH都會(huì)對(duì)蛋白酶活性造成影響，從而使提取率偏低。因此，選擇酶解pH值為9.5。

圖4 酶解pH對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH on extraction rate of adlay bran protein

2.2.4 酶解溫度對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

圖5 酶解溫度對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of adlay bran protein

由圖5可知，在酶解溫度為35～55℃時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率隨溫度的升高而增大，應(yīng)該是因?yàn)殡S體系溫度的升高，蛋白酶活性增強(qiáng)，對(duì)底物的作用隨之增強(qiáng)，蛋白提取率增大；當(dāng)酶解溫度為55℃時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率最大，為64.87%；當(dāng)酶解溫度＞55℃后，薏米糠蛋白提取率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，可能是隨著酶解溫度的繼續(xù)升高，酶活性受到影響，從而導(dǎo)致蛋白提取率降低。因此，選擇酶解溫度為55℃。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

由圖6可知，提取時(shí)間在1.0～1.5 h內(nèi)，薏仁米糠蛋白提取率變化平穩(wěn)，應(yīng)該是由于時(shí)間短，酶與底物未充分接觸，使得酶發(fā)揮的作用較??；提取時(shí)間在1.5～2.0 h內(nèi)，薏仁米糠蛋白提取率迅速增大，隨著時(shí)間的進(jìn)行，酶與底物充分接觸，并且體系中未溶出的蛋白質(zhì)較多，酶促反應(yīng)底物濃度較大，酶解反應(yīng)不斷進(jìn)行，蛋白提取率增大；提取時(shí)間在2.0 h時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率最大，為62.57%；提取時(shí)間＞2.0 h后，蛋白質(zhì)得到最大限度的釋放，底物不斷減少，酶與未溶出蛋白的作用機(jī)會(huì)減少，蛋白提取率逐漸降低，并且酶解時(shí)間過長，酶活性也會(huì)受到一定程度的制約。因此，選擇酶解時(shí)間為2.0 h。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on extraction rate of adlay bran protein

2.3 酶法提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化及方差分析

2.3.1 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiments

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取影響較為明顯得4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及方差分析[13]，以蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得料液比（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解pH（D）的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=82.08+1.74A+1.13B-0.44C+ 2.98D-3.79AB-4AC+0.43AD+2.18BC-2.10BD+0.27CD-6.44A2-2.67B2-2.50C2-4.26D2

由表3可知，在本試驗(yàn)所涉及范圍內(nèi)，模型的P值=0.0005，模型極顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義；失擬項(xiàng)P值=0.2893＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型與試驗(yàn)擬合度良好，此方法合理可行。酶解pH影響極顯著（P＜0.01），料液比、酶解溫度影響顯著（P＜0.05）；在交互作用中，料液比、酶解溫度交互作用極顯著（P＜0.01），料液比、酶解時(shí)間交互作用顯著（P＜0.05），其他交互作用均不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)中，料液比、酶解pH影響極顯著（P＜0.01），酶解溫度、酶解時(shí)間影響顯著（P＜0.05）。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析預(yù)測(cè)

利用響應(yīng)面分析對(duì)試驗(yàn)因素進(jìn)行最優(yōu)化處理，以確定4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率的影響，響應(yīng)面圖見圖7。由圖7可知，響應(yīng)面分析圖的曲面開口向下，說明二次回歸方程存在最大值。由Design-Expert8.0.6軟件分析得出提取率最佳工藝條件：料液比1∶28.74（g∶mL），酶解溫度50.19℃，酶解時(shí)間1.5 h，酶解pH 9.8。在此優(yōu)化條件下，理論蛋白提取率為83.48%。為了便于實(shí)際操作，將優(yōu)化工藝條件修正為：料液比1∶29（g∶mL），酶解溫度50℃，酶解時(shí)間1.5 h，酶解pH 9.8。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件下薏仁米糠蛋白平均提取率為79.66%。

圖7 酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH和料液比交互作用對(duì)蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between enzymolysis temperature,time,pH and solid-liquid ratio on extraction rate of adlay bran protein

3 結(jié)論

選用堿性蛋白酶，通過酶法提取薏仁米糠中的蛋白質(zhì)，通過對(duì)料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH四個(gè)因素的單因素試驗(yàn)確定最佳水平，同時(shí)用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，通過用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定最佳酶法提取工藝為：料液比1∶29（g∶mL），酶解溫度50℃，酶解1.5 h，酶解pH 9.8，理論蛋白提取率達(dá)83.48%。此優(yōu)化條件下，平均蛋白質(zhì)提取率為79.66%，產(chǎn)品純度達(dá)73.42%。

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Optimization of extraction technology of adlay bran protein by enzymatic method

REN Xieke1,3,CHEN Li1,3*,LU Hongmei1,3,GAO Bing4,JIA Qinghui2,3,WANG Zhen1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550003,China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 4.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

In order to research the optimum extraction technology of adlay bran protein by enzymatic method,on the basis of single factor experiments,the extraction conditions of adlay bran protein were optimized by Box-Benhnken experiments design and response surface methodology.The influence factors on adlay bran protein extraction rate were analyzed by regression equation,and the optimum extraction technology conditions were identified as solid-liquid ratio 1∶29(g∶ml),enzymolysis temperature 50℃,time 1.5 h and pH 9.8.Under the optimum extraction conditions,the average extraction rate of adlay bran protein was 79.66%and purity of the products was 73.42%.

adlay bran protein;extraction;enzymatic method;response surface optimization

TS213

0254-5071（2017）07-0167-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.036

2017-04-27

貴州省科技合作計(jì)劃（LH[2015]7668）

任勰珂（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

*通訊作者：陳莉（1981-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槲⑸铩?/p>