香換玲，何艷梅，林峰，冉苒，陳志聰，王玲

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

菠蘿皮渣中乳酸菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性研究

香換玲，何艷梅，林峰，冉苒，陳志聰，*王玲

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

從3個(gè)不同種植基地來(lái)源的菠蘿皮中初步分離出10株疑似乳酸菌，經(jīng)觸酶試驗(yàn)、革蘭氏染色試驗(yàn)、溶鈣圈試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)鑒定，證實(shí)其中的2株菌B3和C3具備乳酸菌的基本特征，初步鑒定為乳酸菌；對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，2株菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期均為6～14 h，在22～47℃溫度范圍內(nèi)有良好的耐熱能性，在pH值2.5～6.5的環(huán)境中能良好生長(zhǎng)，說(shuō)明試驗(yàn)分離到的這2株乳酸菌對(duì)外界環(huán)境有良好的適應(yīng)能力。

菠蘿皮；乳酸菌；分離鑒定；生長(zhǎng)特性

0 引言

菠蘿是我國(guó)南方栽培面積較大、產(chǎn)量較多的大宗水果之一，成熟時(shí)色澤鮮艷、營(yíng)養(yǎng)豐富、味道清甜、氣味芳香，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。菠蘿水分含量高、不耐貯藏，產(chǎn)地收貨季節(jié)一般都就地加工成菠蘿罐頭、果醬、蜜餞、果干等產(chǎn)品[2]。在菠蘿果實(shí)的加工過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生占全果質(zhì)量50%～60%的皮渣副產(chǎn)物[3]。這些皮渣中含有大量的糖分、纖維素、半纖維素等碳水化合物及其他適宜微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分[4]。

目前，國(guó)內(nèi)利用果蔬加工副產(chǎn)物生產(chǎn)青貯飼料的研究比較熱門。將菠蘿皮渣粉碎后接種乳酸菌，可以生產(chǎn)適合家畜飼養(yǎng)的青貯飼料[5-6]，這種通過(guò)乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的青貯飼料，具有改善飼料的發(fā)酵品質(zhì)、增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、提高畜禽機(jī)體抵抗力、節(jié)省養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)成本等特點(diǎn)。但是，所使用的發(fā)酵乳酸菌菌種大部分都是購(gòu)買于一些大型的研究所，對(duì)青貯飼料的生產(chǎn)存在專一性不強(qiáng)、生產(chǎn)效率較低等問(wèn)題。

各種農(nóng)副產(chǎn)品加工下腳料都有自身的特性。有針對(duì)性地從菠蘿皮渣中分離乳酸菌，旨在為菠蘿皮渣生產(chǎn)青貯飼料提供更為高效專一的菌種，進(jìn)而提高菠蘿皮渣青貯飼料的品質(zhì)和利用效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菠蘿，采自湛江雷州3家不同種植園。

1.2 試劑

鹽酸、碳酸鈣、葡萄糖、過(guò)氧化氫酶、吐溫80，均為AR級(jí)。

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基、色氨酸培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、瓊脂粉、酵母提取物。

1.3 主要儀器

HPX-9162MB型恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；顯微鏡，OLYPUS公司產(chǎn)品；PHSJ-4A型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 乳酸菌的富集培養(yǎng)[7-15]

將成熟度為九成熟的菠蘿全果取下表皮并粉碎，取樣25 g置于裝有225 mL無(wú)菌水的錐形瓶中搖勻稀釋至10-1，再依次稀釋直至10-5，振蕩培養(yǎng)10 min后，分別吸取100 μL上清液轉(zhuǎn)入MRS培養(yǎng)基中，用無(wú)菌棒涂布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待菌落長(zhǎng)成后，選擇具有乳酸菌典型菌落特征的單個(gè)菌落進(jìn)一步劃線分離3次，顯微鏡觀察為純菌落后移植在MRS斜面上，在37℃條件下培養(yǎng)48 h，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 乳酸菌的鑒定

（1）過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。在載玻片上滴1滴過(guò)氧化氫溶液，挑取1環(huán)疑似菌株溶于過(guò)氧化氫溶液中，觀察菌體是否產(chǎn)生氣泡。

（2）革蘭氏染色試驗(yàn)。對(duì)疑似菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體的個(gè)體形狀和顏色。

（3）生理生化鑒定。①溶鈣圈試驗(yàn)。乳酸菌生長(zhǎng)時(shí)，乳酸的產(chǎn)生會(huì)將菌體周圍的鈣溶解掉，形成透明圈。在MRS固體培養(yǎng)基中加入2%的碳酸鈣制成平板，取1環(huán)疑似菌劃線接種于其上，在37℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基中鈣的溶解性。②糖發(fā)酵試驗(yàn)。在預(yù)先放有1支小導(dǎo)管的PY培養(yǎng)基中接種1～2環(huán)疑似菌株，搖勻后于37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的顏色和小導(dǎo)管是否浮起。③明膠液化試驗(yàn)。接種1環(huán)疑似菌株于明膠培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基凝固情況。④吲哚試驗(yàn)。接種1環(huán)疑似菌株于色氨酸培養(yǎng)基中，于37℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，加入2滴吲哚試劑，觀察培養(yǎng)基上層溶液顏色變化。⑤運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)。在MRS肉湯培養(yǎng)基中加入0.4%瓊脂粉制備半固體培養(yǎng)基，在其中接種1環(huán)疑似菌株，在37℃生化恒溫箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌體在半固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況。

1.4.3 乳酸菌生長(zhǎng)特性研究

（1）乳酸菌的生長(zhǎng)曲線。將疑似菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)，每隔2 h取樣，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)OD值，觀察培養(yǎng)時(shí)間與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系，繪制生長(zhǎng)曲線。

（2）乳酸菌產(chǎn)酸能力測(cè)試。按照上述1.4.3（1）中的培養(yǎng)方法，在37℃的培養(yǎng)條件下，每隔2 h取樣測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液的pH值，觀察疑似菌株的產(chǎn)酸能力。

（3）乳酸菌耐受性試驗(yàn)。乳酸菌耐受性試驗(yàn)包括耐熱性、耐酸性試驗(yàn)等。①乳酸菌耐熱性試驗(yàn)。將疑似菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別置于17，22，27，32，37，42℃溫度下培養(yǎng)48 h，每株菌每個(gè)溫度下重復(fù)試驗(yàn)3次，設(shè)置1個(gè)對(duì)照，觀察菌株的生長(zhǎng)情況。②乳酸菌耐酸性試驗(yàn)。用HCl溶液調(diào)節(jié)MRS肉湯培養(yǎng)基的酸度，使其pH值分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，接種疑似菌株到各酸度梯度的MRS肉湯培養(yǎng)基中，每個(gè)株菌在同一酸度條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，設(shè)置1個(gè)對(duì)照，于37℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

按1.4.1中的方法進(jìn)行操作，將各稀釋度的樣品稀釋液均勻涂布在MRS固體培養(yǎng)基表面，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。菌落長(zhǎng)成后，根據(jù)乳酸菌的菌落特征及顯微鏡下的個(gè)體形態(tài)特征，初步分離到10株疑似乳酸菌。

乳酸菌分離結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乳酸菌分離結(jié)果

由表1可以看出，菌落顏色大多以白色、乳白色、表面白色、底部淡黃色為主，外形以圓形為主，表面光滑、濕潤(rùn)，質(zhì)地均勻，容易挑?。伙@微鏡下觀察其個(gè)體形態(tài)有細(xì)長(zhǎng)桿狀或成鏈、兩端鈍圓、球狀或卵球狀，不具運(yùn)動(dòng)性，無(wú)芽孢。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)

過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)是乳酸菌的一個(gè)重要鑒定試驗(yàn)。乳酸菌一般不會(huì)分泌過(guò)氧化氫酶，不能將過(guò)氧化氫溶液分解代謝生成水和氧氣。根據(jù)1.4.2（1）中描述的試驗(yàn)方法及步驟，對(duì)挑選出的10株疑似乳酸菌進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。

疑似乳酸菌的過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 疑似乳酸菌的過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，10株疑似乳酸菌與過(guò)氧化氫溶液接觸后，A1，A2，B1，B2，B4，C1，C2，D1均呈陽(yáng)性反應(yīng)，不符合乳酸菌的生理特性；B3和C3呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，符合乳酸菌的生理特性。因此，可以初步判斷A1，A2，B1，B2，B4，C1，C2，D1均不是乳酸菌，B3和C3留待后續(xù)繼續(xù)鑒定。

2.2.2 革蘭氏染色試驗(yàn)

對(duì)B3和C32株疑似菌進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的染色情況和菌體細(xì)胞的個(gè)體形態(tài)，結(jié)果B3和C32株菌均為紫色，形態(tài)為球狀或桿狀，成對(duì)或成鏈排列，具備乳酸菌的基本特征。

2.2.3 生理生化鑒定

根據(jù)1.4.2（3）生理生化鑒定描述的試驗(yàn)步驟，對(duì)B3和C32株疑似乳酸菌菌株分別進(jìn)行溶鈣圈試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)等。

疑似乳酸菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 疑似乳酸菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

由表3中可以看出，B3和C3菌株均具備乳酸菌該有的生理生化特性，結(jié)合以上試驗(yàn)，基本可以確定為乳酸菌。

2.3 乳酸菌的生長(zhǎng)特性

2.3.1 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線

按照1.4.3（1）中的方法，按5%的接種量將疑似菌株B3和C3分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)，每隔2 h取樣，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)OD值，觀察培養(yǎng)時(shí)間與菌株生長(zhǎng)的關(guān)系，繪制生長(zhǎng)曲線。

乳酸菌的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線

從圖1可以看出，乳酸菌B3在0～8 h的生長(zhǎng)遲緩期內(nèi)菌體數(shù)量增加比較小，曲線緩慢上升；在之后的8～14 h，菌體生成量明顯增多，為該菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期；14 h后，菌體生成量變化不大，乳酸菌的生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期。乳酸菌C3生長(zhǎng)的遲緩期在0～6 h，6～14 h為其生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，14～20 h為其穩(wěn)定期。因此，B3和C32菌株均能在MRS肉湯培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)，但C3比B3能較早進(jìn)入對(duì)數(shù)期，且對(duì)數(shù)期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。

2.3.2 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線

根據(jù)1.4.3（2）乳酸菌的產(chǎn)酸能力測(cè)定方法，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下B3和C3在培養(yǎng)基中酸度的變化情況。

乳酸菌的產(chǎn)酸曲線見(jiàn)圖2。

圖2 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線

由圖2可以看出，乳酸菌B3和C3在前5 h的酸度變化均不明顯，培養(yǎng)液處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；在5～14 h，pH值明顯下降，乳酸菌大量繁殖，培養(yǎng)液中總酸含量增高；14 h后，2株菌的pH值均變化不大，均保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平；在20 h時(shí)，B3和C3的pH值都穩(wěn)定在3.5左右。由此可見(jiàn)，2株菌都具備較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

2.3.3 乳酸菌的耐熱性

按1.4.3（3）①中描述的方法，將乳酸菌B3和C3接種到MRS肉湯培養(yǎng)基后，放置在17，22，27，32，37，42℃共6個(gè)溫度梯度下培養(yǎng)48 h，取出觀察細(xì)菌培養(yǎng)液的渾濁度和試管底部沉淀物，判斷其生長(zhǎng)情況。

乳酸菌在不同溫度下的培養(yǎng)情況結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 乳酸菌在不同溫度下的培養(yǎng)情況結(jié)果

由表4可以看出，乳酸菌B3和C3的生長(zhǎng)能力受溫度的影響比較明顯。在17℃的低溫條件下，乳酸菌B3和C3不生長(zhǎng)；從22℃開始，隨著溫度的逐漸上升，細(xì)菌的生長(zhǎng)逐漸變得活躍，菌液濃度不斷增大；到42℃時(shí)，2株試驗(yàn)菌表現(xiàn)出了最強(qiáng)的生長(zhǎng)能力；但在47℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量又降低了。說(shuō)明乳酸菌B3和C3在一定的溫度范圍內(nèi)有良好的耐熱性。2.3.4乳酸菌的耐酸性

按1.4.3（3）②中描述的方法，將乳酸菌B3和C3分別按8%的接種量接種到pH值2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌液濃度和試管底部的沉淀物，判斷細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

乳酸菌在不同pH值中的培養(yǎng)情況見(jiàn)表5。

表5 乳酸菌在不同pH值中的培養(yǎng)情況

由表5可以看出，乳酸菌B3和C3能在pH值2.5～6.5的環(huán)境中生長(zhǎng)，說(shuō)明試驗(yàn)所篩選2株乳酸菌的酸度耐受范圍比較廣，對(duì)外界酸度環(huán)境有良好的適應(yīng)能力。

3 結(jié)論

（1）從不同種植基地來(lái)源的菠蘿果皮中初步分離出10株疑似乳酸菌，經(jīng)觸酶試驗(yàn)、革蘭氏染色試驗(yàn)、溶鈣圈試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)鑒定，證實(shí)其中的2株菌B3和C3具備乳酸菌的基本特征，判斷為乳酸菌。

（2）乳酸菌B3和C3在MRS肉湯培養(yǎng)基中于37℃條件下能良好生長(zhǎng)，其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期均為6～14 h；2株乳酸菌在22～47℃溫度范圍內(nèi)有良好的耐熱能性；在pH值2.5～6.5的環(huán)境中能良好生長(zhǎng)，對(duì)外界環(huán)境有良好的適應(yīng)能力。

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Study of Isolation，Identification and Growth Characteristics of Lactic Acid Bacteria from Pineapple Peel

XIANG Huanling，HE Yanmei，LIN Feng，RAN Ran，CHEN Zhicong，*WANG Ling
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

Ten strains of suspected lactic acid bacteria which are initially isolated from pineapple peel that came from three different pineapple planting base.The experiments include catalase test，gram staining，calcium dissolving test，sugar fermentation test，gelatin liquefaction test，indole test，motile test.It is confirmed that the two strains of bacteria（B3and C3）have the basic characteristics of lactic acid bacteria and is judged as lactic acid bacteria though the identification of biochemistry experiments.The research of grow characterization of this two strains of bacteria showed that the logarithmic period is 6～14 h，having good heat tolerance between temperature range from 22～47℃and growing well within pH 2.5～6.5 range.In short，two strains of lactic acid bacteria which are isolated from this experiment have highly adaptability to environment.

pineapple peel；lactic acid bacteria；isolation and identification；grow characterization

TQ914.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.013

1671-9646（2017）06a-0041-04

2017-05-03

廣東海洋大學(xué)2016年地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目資助（CXXL2016008）。

香換玲（1995—），女，本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通訊作者：王玲（1965—），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)槭称芳庸ぜ夹g(shù)及食品微生物學(xué)方面的教學(xué)與研究。