張 敏，張 俊，錢金秋，劉慶玉，邵明杰，尹思媛

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

磺胺二甲嘧啶對沼氣發(fā)酵過程中酶活性和微生物群落功能多樣性的影響

張 敏，張 俊，錢金秋，劉慶玉①，邵明杰，尹思媛

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，獸用抗生素作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，以促進畜禽生長和防病，導(dǎo)致畜禽糞便和抗生素污染總量增加。為了探討抗生素對沼氣發(fā)酵過程的影響，以豬糞和玉米秸稈為原料，研究磺胺二甲嘧啶(SMZ)對沼氣發(fā)酵過程中脲酶、脫氫酶以及微生物群落代謝的影響。結(jié)果表明，在沼氣發(fā)酵初期(3～6 d)，20 mg·kg-1SMZ和60 mg·kg-1SMZ處理(T1、T2處理)對脲酶活性有激活作用，隨著發(fā)酵時間的延長，SMZ對脲酶活性由促進變?yōu)橐种谱饔谩?20 mg·kg-1SMZ處理(T3處理)對脫氫酶活性表現(xiàn)為先抑制后促進作用。采用Biolog方法分析SMZ對沼氣發(fā)酵過程中微生物群落功能多樣性的影響，結(jié)果表明，T2和T3處理對平均顏色變化率(AWCD)具有先抑制后促進作用。對Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析表明，在沼氣發(fā)酵的啟動期(第6天)，SMZ能夠顯著降低微生物群落的功能多樣性和物種豐富度；隨著沼氣發(fā)酵時間的延長，在沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣下降期(第35天)，SMZ增加了微生物群落的功能多樣性和物種豐富度?？梢?，SMZ對豬糞沼氣發(fā)酵過程中水解酶活性和微生物群落功能多樣性的影響較大，在沼氣發(fā)酵不同時期，SMZ對水解酶活性和微生物群落多樣性的影響也不同。

磺胺二甲嘧啶；沼氣發(fā)酵；酶活性；微生物群落

獸用抗生素因其具有防病、促生長的作用而被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè),通過口服或肌肉注射進入動物體內(nèi)的抗生素很少被內(nèi)臟器官吸收利用,大部分以原藥和代謝產(chǎn)物的形式殘留在畜禽糞便中[1-3]。畜禽糞便既是污染源,同時也是一種可以再次利用的資源。沼氣發(fā)酵技術(shù)作為一項清潔生物質(zhì)能源技術(shù),近年來在畜禽糞便等農(nóng)業(yè)廢棄物處理方面得到了廣泛應(yīng)用[4]。然而,殘留在畜禽糞便中的抗生素會使沼氣發(fā)酵的產(chǎn)氣效率出現(xiàn)不同程度的下降[5-6]。沼氣發(fā)酵這一厭氧生物降解過程極其復(fù)雜,沼氣發(fā)酵是涉及多菌群相互作用的非線性復(fù)雜系統(tǒng),是厭氧微生物的新陳代謝活動,不同微生物菌群的代謝過程相互影響、相互制約,共同影響著厭氧的主要最終產(chǎn)物沼氣的產(chǎn)量[7]。沼氣發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及水解酶活性變化是影響沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣效率的關(guān)鍵因素。

磺胺類藥物(sulfonamides,SAs)是一種具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的合成抗菌藥物,主要用于預(yù)防和治療細菌感染性疾病。它具有抗菌譜廣、療效好、價格便宜等優(yōu)點,是我國生產(chǎn)量和使用量最大的獸藥之一,SAs可影響核蛋白的合成,從而抑制細菌的生長與繁殖[8-9]。近年來，我國學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn),磺胺類藥物抗生素在畜禽糞便中的殘留達到mg·kg-1級[10-11],其中，磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine,SMZ)是殘留在畜禽糞便中的一種主要磺胺類抗生素。目前,有關(guān)抗生素對土壤酶活性、微生物群落多樣性及抗性基因的研究較多[12-13],而有關(guān)磺胺類抗生素對于畜禽糞便沼氣發(fā)酵過程中酶活性及微生物多樣性的影響研究較少。筆者以在畜禽糞便中檢出率較高的SMZ為對象,研究添加不同濃度SMZ對豬糞沼氣發(fā)酵過程中脲酶、脫氫酶活性及微生物群落功能多樣性的影響,為殘留有抗生素的畜禽糞便沼氣發(fā)酵無害化處理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵原料

發(fā)酵原料玉米秸稈取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地,自然風(fēng)干后剪短至3～5 cm,經(jīng)粉碎機粉碎成粉末;沼氣發(fā)酵供試糞便采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬場育成期豬 (豬體重40～80 kg)收集的新鮮豬糞。接種物污泥取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)“中國東北寒冷地區(qū)綜合能源示范基地”豬糞正常沼氣發(fā)酵后的活性污泥,其總固體含量w(TS) 為8%,經(jīng)測定不含抗生素。SMZ購自購自德國Dr. Ehrenstorfer公司(純度w為97%)。試驗材料基本性質(zhì)見表1。

表1 試驗材料基本性質(zhì)

Table 1 Basic parameters of experiment materials

試驗材料w(全碳)/(g·kg-1)w(全氮)/(g·kg-1)w(全鉀)/(g·kg-1)w(全磷)/(g·kg-1)C/N比豬糞398.6525.3215.4011.8615.74玉米秸稈388.466.2811.831.8861.86

1.2 試驗裝置

試驗裝置為自制排水集氣法簡易發(fā)酵裝置,主要由2.5 L發(fā)酵瓶、2 L集氣瓶和2 L排水瓶3部分組成。發(fā)酵瓶置于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi),發(fā)酵瓶與集氣瓶瓶口用膠塞塞緊,各部分用乳膠管連接,所有接口處均用石蠟和凡士林密封。

1.3 試驗設(shè)計

試驗設(shè)計取預(yù)處理完成的玉米秸稈和豬糞,試驗豬糞與秸稈質(zhì)量比例為2∶1,取新鮮豬糞400 g,碎秸稈200 g加入到發(fā)酵瓶中,根據(jù)2種原料含水率以及C/N比,加水調(diào)節(jié)總固體w為8%,C/N比為25∶1,接種沼液30%(以濕重計)。共設(shè)置4個處理,SMZ添加量(占干豬糞的比例) 依次為:0(CK)、20(T1)、60(T2)和120 mg·kg-1(T3),將SMZ溶液與原料充分混勻裝入發(fā)酵罐內(nèi),密封在暗處進行發(fā)酵,每個處理重復(fù)3 次。

1.4 樣品采集

分別在沼氣發(fā)酵的3、6、9、12、15、18、21、24、27、35、45、50 d對沼氣發(fā)酵沼渣沼液混合物進行采樣(采樣前晃動發(fā)酵罐混勻),4 ℃冰箱冷藏,用于酶活性的測定。

1.5 樣品測定

1.5.1 酶活性的測定

水解酶活性測定方法參照關(guān)松蔭[14]的方法。脲酶活性采用比色法測定，以24 h后1 g樣品中生成NH3-N的質(zhì)量表示，mg·g-1·d-1；脫氫酶活性以1 h 后1 g 樣品中生成2,3,5-三苯基甲腙(TF) 的質(zhì)量表示，μg·g-1·h-1。

1.5.2 沼氣發(fā)酵不同時期微生物群落功能多樣性測定

Biolog測定方法參見文獻[15]。具體操作步驟如下:分別從第6天(啟動期) 、第18天(產(chǎn)氣穩(wěn)定期)、第35天(產(chǎn)氣下降期)的各個沼氣發(fā)酵瓶中取沼液,用w=0.85%無菌生理鹽水稀釋500倍。在超凈工作臺上,分別吸取150 μL 菌懸液接種于ECO 微平板中的每一個小孔,將接好種的Biolog-ECO 板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)240 h,并每隔24 h在Biolog 讀數(shù)儀上讀取590 nm波長處吸光值。

1.6 相關(guān)指標的計算

平均顏色變化率(average well colour development,DAWC)的計算公式[16-18]為

DAWC=∑(Ci-R)/n。

(1)

式(1)中,Ci為第i個非對照孔的吸光值;R為對照孔(A1)的吸光值;Ci-R計算中記為0;n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù),該研究中為31。

采用培養(yǎng)96 h后的數(shù)據(jù)來表征BIOLOG 板中的微生物碳源代謝功能多樣性特征,微生物群落Shannon 多樣性指數(shù)(H′)計算公式為

H′=-∑Pi×lnPi。

(2)

式(2)中,Pi為第i個非對照孔的吸光值與所有非對照孔吸光值總和的比值。

Simpson指數(shù)(D)又稱優(yōu)勢度指數(shù),是對多樣性方面即集中性的度量。

D=1-∑Pi2。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2003軟件進行統(tǒng)計分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1SMZ對脲酶活性的影響

脲酶是氮循環(huán)的一種關(guān)鍵性酶,能促進含氮有機物的水解,分析脲酶活性變化對于了解沼氣發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)等含氮有機物的分解具有重要意義[19]。由圖1可知,各處理脲酶活性基本呈先升高后降低的趨勢,在沼氣發(fā)酵初期(3～6d),T1和T2處理脲酶活性顯著高于CK處理(P<0.05),T3處理脲酶活性與CK處理差異不顯著(P>0.05),表明在沼氣發(fā)酵初期添加中低濃度SMZ促進了脲酶活性。

CK、T1、T2和T3分別指ρ(磺胺二甲嘧啶)為0、20、60和120 mg·kg-1。

各處理脲酶活性均在第9天達最大值,在第9～15天添加SMZ各處理脲酶活性顯著低于CK處理 (P<0.05),可能是SMZ發(fā)揮了累積毒性作用,減弱了脲酶活性;在沼氣發(fā)酵18 d后,各處理之間脲酶活性差異均不顯著(P>0.05),可能是隨著SMZ在沼氣發(fā)酵過程中的不斷降解,其對微生物抑制作用減弱,各處理脲酶活性逐漸恢復(fù)到CK水平。

2.2 SMZ對脫氫酶活性的影響

脫氫酶在厭氧發(fā)酵的能量循環(huán)和物質(zhì)循環(huán)中扮演重要角色,脫氫酶活性能直接用于表示生物細胞對其基質(zhì)降解能力的強弱,是微生物降解有機污染物、獲得能量的必需酶[20-21]。由圖2可知,CK、T1、T2和T3各處理厭氧發(fā)酵液中脫氫酶活性均呈先升高后降低趨勢。

CK、T1、T2和T3分別指ρ(磺胺二甲嘧啶)為0、20、60和120 mg·kg-1。

在沼氣發(fā)酵的第3～12天,T2和T3處理脫氫酶活性顯著低于T1和CK處理(P<0.05),T3處理脫氫酶活性最低,表明在沼氣發(fā)酵前期中高濃度的SMZ顯著抑制脫氫酶活性;在沼氣發(fā)酵的第15～21天,各處理之間脫氫酶活性差異不顯著(P>0.05);24 d以后,T3處理脫氫酶活性顯著高于其他處理(P<0.05),而CK、T1和T2各處理之間差異不顯著。

2.3 沼液微生物群落代謝平均顏色變化率(DAWC)

DAWC是反映微生物代謝活性的重要指標,體現(xiàn)了不同微生物對相同碳源利用的差異性,DAWC越大，則碳源利用程度越高,表示微生物活性也越高[22]。由圖3可看出,隨著培養(yǎng)時間的延長，DAWC不斷增大,在24 h前各處理DAWC很小,說明在24 h之內(nèi)碳源基本未被利用,24 h之后DAWC迅速升高進入對數(shù)增長期直至144 h。

CK、T1、T2和T3分別指ρ(磺胺二甲嘧啶)為0、20、60和120 mg·kg-1。

由圖3可見,在沼氣發(fā)酵啟動期(第6天),T2和T3處理DAWC在培養(yǎng)72 h后顯著低于CK處理(P<0.05),隨著SMZ濃度的增高，其相應(yīng)的DAWC不斷降低,表明在沼氣發(fā)酵啟動期中高濃度SMZ抑制了DAWC。在沼氣發(fā)酵的產(chǎn)氣下降期(第35天),T2和T3處理DAWC在培養(yǎng)72 h以后顯著高于CK處理(P<0.05),表明在沼氣發(fā)酵中后期中高濃度SMZ提高了DAWC。在沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣穩(wěn)定期(第18天),各處理之間DAWC差異不顯著(P>0.05)。同時,在沼氣發(fā)酵的不同階段DAWC變化趨勢不同,從大到小依次為啟動期、產(chǎn)氣穩(wěn)定期和產(chǎn)氣下降期,說明沼氣發(fā)酵不同階段微生物對碳源的利用能力也不同。

2.4 沼氣發(fā)酵過程中微生物群落多樣性指數(shù)變化

沼氣發(fā)酵過程中微生物群落功能多樣性是衡量沼液微生物群落狀態(tài)與功能的指標,反映沼液中微生物的生態(tài)特征。Shannon多樣性指數(shù)(H′)表示群落的豐富度,一般來說,物種數(shù)多且較均勻的群落,Shannon 指數(shù)較高,當物種數(shù)量或均勻度下降時,Shannon 指數(shù)也下降[22]。Biolog 微平板中能被利用的碳源,即物種數(shù)越多且利用強度越大,則Shannon 指數(shù)也越大。Simpson指數(shù)較多地反映了群落中最常見的物種,表示某個物種的優(yōu)勢度,數(shù)值越大表明得到同一物種的概率越大,因而微生物多樣性越低[23]。選取培養(yǎng)96 h時的數(shù)據(jù)對沼液中微生物群落功能多樣性進行分析(表2)。

表2 沼氣發(fā)酵不同階段微生物多樣性指數(shù)

Table 2 Diversity and evenness indices for microbial communities of Biogas slurry microbial

指數(shù)處理啟動期穩(wěn)定期下降期H'CK3.68±0.03a3.62±0.02a3.50±0.03aT13.63±0.02b3.59±0.04ab3.51±0.02aT23.58±0.01c3.61±0.03a3.56±0.02bT33.52±0.02d3.60±0.03a3.59±0.01cDCK0.98±0.01a0.96±0.02a0.89±0.03aT10.93±0.02b0.95±0.03a0.91±0.04abT20.91±0.03b0.94±0.04ab0.96±0.02cT30.88±0.02c0.97±0.01a0.99±0.01d

CK、T1、T2和T3分別指ρ(磺胺二甲嘧啶)為0、20、60和120 mg·kg-1;H′為Shannon多樣性指數(shù)；D為Simpson指數(shù)。同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示各處理間Shannon或Simpson指數(shù)差異顯著(P<0.05)。n=3。

在沼氣發(fā)酵啟動期(第6天),CK處理Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)最高,與T1、T2和T3處理之間差異顯著(P<0.05),表明在沼氣發(fā)酵的初始階段,SMZ能夠顯著降低微生物群落的功能多樣性和物種豐富度;在沼氣發(fā)酵的產(chǎn)氣穩(wěn)定期(第18天)各處理之間Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異不顯著(P>0.05),而在沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣下降期(第35天),T2和T3處理Shannon和Simpson指數(shù)顯著大于CK處理(P<0.05),且隨著SMZ濃度的增加而增加。

3 討論

沼氣發(fā)酵過程同時也是酶促反應(yīng)的過程,沼氣發(fā)酵原料的發(fā)酵產(chǎn)氣都是在微生物作用下逐步進行酶促反應(yīng)的結(jié)果[24]。近年來研究發(fā)現(xiàn),畜禽糞便中殘留的抗生素會影響沼氣發(fā)酵過程中水解酶活性和微生物多樣性[20],進而影響沼氣發(fā)酵效能。水解類酶活性決定著整個發(fā)酵過程的速度,脲酶是沼氣發(fā)酵過程中一種重要的水解酶。在沼氣發(fā)酵初期,中低濃度SMZ對脲酶活性有激活作用,隨著發(fā)酵時間的延長,SMZ對脲酶活性有抑制作用。該結(jié)果與已有文獻研究結(jié)論類似,如陳智學(xué)等[25]研究發(fā)現(xiàn),在堆肥前期,土霉素刺激脲酶活性,隨著堆肥時間的延長,土霉素對脲酶活性的影響由刺激變?yōu)橐种谱饔?國彬等[9]研究磺胺類獸藥對土壤脲酶活性的影響發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)前期低濃度時為激活,高濃度時為抑制作用,培養(yǎng)后期低、高濃度時均為抑制作用;張凱煜等[26]發(fā)現(xiàn)在堆肥前期SMZ對脲酶活性無顯著影響,而在堆肥腐熟期SMZ對脲酶活性有抑制作用,且抑制作用隨抗生素含量的增加而增加。

Biolog 微平板技術(shù)因無需分離純種微生物、操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生物群落的研究中。DAWC及沼氣發(fā)酵微生物代謝功能多樣性指數(shù)在一定程度上可以反映沼氣發(fā)酵微生物的活性及多樣性[32-33]。在沼氣發(fā)酵啟動期,添加中質(zhì)量含量(60 mg·kg-1)和高質(zhì)量含量(120 mg·kg-1)SMZ對DAWC具有抑制作用,說明這期間SMZ對沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中微生物活性起抑制作用;而沼氣發(fā)酵的產(chǎn)氣下降期,中高濃度SMZ對DAWC有促進作用,可能是因為隨著沼液中SMZ的不斷降解,被SMZ抑制的微生物數(shù)量及活性有所恢復(fù),提高了微生物整體活性,筆者研究結(jié)果與張凱煜等[26]的研究結(jié)果相似。在沼氣發(fā)酵不同時期SMZ對微生物群落功能多樣性影響不同,在沼氣發(fā)酵的啟動期,SMZ對沼液中微生物群落的功能多樣性和物種豐富度具有顯著抑制作用;隨著沼氣發(fā)酵時間的延長,在沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣下降期(第35天),添加中質(zhì)量含量(60 mg·kg-1)和高質(zhì)量含量(120 mg·kg-1)SMZ處理增加了微生物群落的功能多樣性和物種豐富度,這與陳智學(xué)等[25]的研究結(jié)果一致。原因可能在于在沼氣發(fā)酵初期,SMZ對微生物的生長有抑制作用,從而導(dǎo)致微生物群落多樣性降低;隨著發(fā)酵時間的延長,SMZ誘導(dǎo)產(chǎn)生了具有顯著優(yōu)勢度的抗藥性菌群,微生物群落的功能多樣性增高。Biolog法最初僅被用于菌種鑒定,1991年GARLAND等[34]首次將Biolog方法應(yīng)用于分析微生物群落特征,近年來Biolog法被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生物群落的研究中。但是,Biolog微平板法僅能檢測可培養(yǎng)的微生物,不能全面反映微生物的群落組成結(jié)構(gòu)信息[33],如果要深入研究沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系,還需結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、高通量測序等[35]一些分子生物學(xué)方法來進一步深入分析微生物群落功能多樣性。

4 結(jié)論

SMZ對豬糞沼氣發(fā)酵過程中水解酶活性和微生物群落功能多樣性的影響較大,在沼氣發(fā)酵不同時期,SMZ對水解酶活性和微生物群落功能多樣性的影響也不同。添加中低濃度SMZ處理對沼氣發(fā)酵過程中脲酶活性呈現(xiàn)先激活后抑制作用,而添加高濃度SMZ處理對脫氫酶活性表現(xiàn)為先抑制后促進作用。添加中高濃度SMZ對沼氣發(fā)酵過程中平均顏色變化率(AWCD)和微生物群落的功能多樣性具有先抑制后促進作用。

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(責(zé)任編輯： 陳 昕)

Effects of Sulfamethazine on Enzyme Activities and Microbial Community Functional Diversity During Biogas Fermentation.

ZHANGMin，ZHANGJun,QIANJin-qiu，LIUQing-yu,SHAOMing-jie,YINSi-yuan

(College of Engineering, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

With the development of livestock and poultry breeding industry, veterinary antibiotics are widely used as feed additives in domestic animal farming, either to improve the growth performance or to prevent infection， resulting in an increase in the total amount of livestock fecal contamination as well as antibiotic contamination. In order to investigate the effect of veterinary antibiotics on biogas fermentation， an experiment was designed to study the effects of sulfamethazine (SMZ) addition in the pig manure on enzyme activities and microbial community functional diversity in the biogas fermentation process with pig manure and corn stalks as raw materials. The results show that T1 treatment (20 mg·kg-1) and T2 treatment (60 mg·kg-1) would promote the urease activities in the initial stage of biogas fermentation(from day 3 to day 6)， since then on， it was decreased． The dehydrogenase activity in T3 treatment (120 mg·kg-1) was inhibited at the beginning of the composting process and then was promoted. The effect of sulfamethazine addition on microbial community functional diversity during biogas fermentation was assayed with Biolog method． The results show that AWCD (average well color development) values in T2 and T3 treatment was inhibited at the beginning of the composting process and then was promoted. Shannon index and Simpson index results suggest that the sulfamethazine addition could significantly reduce the functional diversity of microbial communities in the initial stage of the biogas fermentation (in the first 6 days)， in contrast， it could increase the functional diversity of microbial communities in the first 35 days． It is obvious that sulfamethazine has significant effect on hydrolytic enzyme activities and microbial community functional diversity in the pig manure biogas fermentation process. The effect of sulfamethazine on hydrolytic enzyme activities and microbial community functional diversity are also different in the different stages of biogas fermentation.

sulfamethazine； biogas fermentation； enzyme activity； microbial community

2016-08-16

國家自然科學(xué)基金(31400442)；遼寧省自然科學(xué)基金(2014027012)

X705

A

1673-4831(2017)07-0653-07

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.07.010

張敏(1978—)，女，遼寧朝陽人，講師，博士，主要從事農(nóng)業(yè)固體廢棄物的治理和綜合利用方面的教學(xué)及研究工作。E-mail： minzhang412@163.com

① 通信作者E-mail: qyliu@126.com