戰(zhàn) 美 周家杰 吳琪聰 崔達華 劉艷秋

(大連醫(yī)科大學中西醫(yī)結合研究院(學院),大連,116044)

女貞子成分抗骨質(zhì)疏松的潛在作用靶點虛擬篩選

戰(zhàn) 美 周家杰 吳琪聰 崔達華 劉艷秋

(大連醫(yī)科大學中西醫(yī)結合研究院(學院),大連,116044)

目的:計算篩選女貞子的潛在作用靶點,探索女貞子抗骨質(zhì)疏松作用靶點的生物學意義。方法:采用ChemDraw、PharmMapper軟件對抗骨質(zhì)疏松潛在作用靶點進行虛擬篩選,Cytoscape軟件構建生物調(diào)控網(wǎng)絡模型。結果:女貞子5種成分(特女貞苷、女貞苷Gl3、女貞苷、紅景天苷、油女貞苷),能夠與骨質(zhì)疏松相關的多個靶點結合。其中,2個靶點包括GSK-3 beta和CK2-alpha與wnt途徑相關,6個靶點(CDPK2、APAF-1、CK2-alpha、DAP kinase 1、CASP-3、ITPK1)與凋亡途徑相關;5種成分中,一些成分能與多個抗骨質(zhì)疏松活性相關的靶點結合,且一些靶點能與多個成分結合。其中,特女貞苷、女貞苷、女貞苷Gl3共同的靶點是APAF-1,特女貞苷、女貞苷、油女貞苷共同的靶點是CK2-alpha。結論:通過女貞子成分靶點篩選,為女貞子成分通過wnt途徑、凋亡途徑促進骨形成,抑制骨吸收,抗骨質(zhì)疏松作用的多靶點整合調(diào)節(jié)機制提供線索。

女貞子;凋亡途徑;wnt途徑;靶點

女貞子為木樨科常綠喬木女貞子Ligustrum的成熟果實,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1],具有補益肝腎、清熱明目的功效,用于肝腎陰虛、頭昏目眩、耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白等癥。近幾十年來,國內(nèi)外學者對女貞子的研究取得了較大進展,發(fā)現(xiàn)了多種活性成分。女貞子的多種化學成分具有抗骨質(zhì)疏松、抗癌、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等作用。當前,國內(nèi)對女貞子化學成分與藥理作用的研究深度還較為有限,為更好的開發(fā)女貞子資源,仍有必要進一步開展針對女貞子作用機制的研究[2]。

網(wǎng)絡藥理學方法(Network Pharmacology)是從藥物、靶點與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā),采用復雜網(wǎng)絡模型表達和分析研究對象的藥理學性質(zhì),適合于反映中藥的多成分-多靶點作用關系,有望為中藥多成分作用機制研究及現(xiàn)代中藥創(chuàng)制帶來新突破。目前,網(wǎng)絡藥理學研究理念已被引入中藥領域,但研究實例報道較少。本文建立靶點預測模型,針對女貞子5個成分的分子結構預測其作用靶點,并據(jù)此構建了女貞子多成分-多靶點調(diào)控網(wǎng)絡[3]。

1 方法

1.1 Tripos mol2格式文件建立 利用ChemDraw軟件打開女貞子5種成分(紅景天苷,女貞苷,特女貞苷,女貞苷G13和油女貞苷)的化學結構圖。以CDX Molfile(.cdx)格式存儲。使用OpenBabel軟件導入上步建立的5個CDX Molfile(.cdx)格式文件,使用其convert功能,將CDX Molfile(.cdx)格式文件轉換成為Tripos mol2格式文件。

1.2 潛在作用靶點反向預測 利用PharmMapper軟件上傳方法1.1中得到的Tripos mol2格式文件,得到虛擬篩選結果。從中篩選出與抗骨質(zhì)疏松相關的可能靶點進行分析。

1.3 利用Cytoscape軟件構建網(wǎng)絡 利用Cytoscape軟件導入NCBI中的wnt途徑、凋亡途徑數(shù)據(jù)構建網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 女貞子中5種成分的潛在作用靶點 通過PharmMapper軟件獲得了女貞子的潛在作用靶點(表1)。結果發(fā)現(xiàn),紅景天苷可以作用于Cell division protein kinase 2和Vitamin D3 receptor,并且它與Cell division protein kinase 2的擬合指數(shù)更大,結合力更強;特女貞苷可以作用于Apoptotic protease activating factor-1、Glycogen phosphorylase,muscle form、Casein kinase II subunit alpha,且擬合指數(shù)依次降低,表明結合作用減弱;女貞苷Gl3可以作用于Glycogen synthase kinase-3 beta、Inosine-5-monphosphate dehydrogenase、Apoptotic protease-activating factor 1、Death-associated protein kinase 1,且擬合指數(shù)依次降低,表明結合作用依次遞減;女貞苷可以作用于Cathepsin k、Caspase-3、Inositol-tetrakisphosphate1-kinase、Inositol monophosphatase、Casein kinase II subunit alpha,且擬合指數(shù)依次降低,表明結合作用依次遞減;油女貞苷具有2個作用靶點,它與Casein kinase II subunit alpha的擬合指數(shù)更大,結合力更強。

2.2 女貞子的5種成分與靶點的對接能量 女貞子的5種成分與靶點的對接能量。見表2。其中女貞苷Gl3與Glycogen synthase kinase-3 beta的對接能量和靶點與已知的配體的對接能量相等,表示Glycogen synthase kinase-3 beta與兩者的親和力相同;紅景天苷、女貞苷Gl3、女貞苷、女貞苷與Cell division protein kinase 2、Death-associated protein kinase 1、Cathepsin k、Casein kinase II subunit alpha的對接能量都比靶點與已知的配體低,表明以上成分與靶點親和力高;紅景天苷、特女貞苷、、女貞苷Gl3、女貞苷、Oleonuezhenide與Vitamin D3 receptor、Apoptotic protease-activating factor 1、Glycogen phosphorylase,muscle form、Casein kinase II subunit alpha、Inosine-5′-monophosphate dehydrogenase、Apoptotic protease activating factor-1、Caspase-3、Inositol-tetrakisphosphate 1-kinase、Inositol monophosphatase 1、Casein kinase II subunit alpha、Ras-related protein Rap-2a的對接能量都比靶點與已知的配體高,表明成分與靶點親和力低。

表1 女貞子中5種成分的潛在作用靶點

2.3 女貞子成分作用靶點與wnt途徑、凋亡途徑相關性 通過分析女貞子靶點的生物信號途徑,發(fā)現(xiàn)女貞苷Gl3結合Glycogen synthase kinase-3 beta、特女貞苷結合Casein kinase II subunit alpha、女貞苷成分結合Casein kinase II subunit alpha、油女貞苷結合Casein kinase II subunit alpha與wnt途徑相關。見表3。紅景天苷結合Cell division proteinkinase 2、特女貞苷結合Apoptotic protease activating factor-1和Casein kinase II subunit alpha、女貞苷Gl3結合Death-associated protein kinase 1、女貞苷結合Caspase-3、Inositol-tetrakisphosphate 1-kinase與凋亡途徑相關。見表4。

利用cytoscape軟件構建女貞子成分抗骨質(zhì)疏松相關靶點網(wǎng)絡,如圖1,一些蛋白如Apoptotic protease activating factor-1、Caspase-3、Glycogen synthase kinase-3 beta等處于網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點,這些節(jié)點的連接數(shù)目較多,表明它們可能是通過wnt途徑、凋亡途徑抗骨質(zhì)疏松的關鍵靶點。

表2 5種成分及Substrate與靶點的對接能量

表3 女貞子成分作用靶點與wnt途徑相關性

表4 女貞子成分作用靶點與凋亡途徑相關性

3 討論

3.1 女貞子的研究現(xiàn)狀與骨質(zhì)疏松的機制 目前,研究發(fā)現(xiàn)女貞子化學成分主要有三萜類,包括脂溶性的齊墩果酸、熊果酸等;環(huán)烯醚萜類,包括女貞苷、特女貞苷等;黃酮類;苯乙醇苷類,包括紅景天苷等?，F(xiàn)代研究已表明女貞子乙醇提取物可增加血清PTH水平,升高血液1,25-(OH)2-VitD3含量,提高腸鈣吸收,改善鈣失衡狀態(tài),提高堿性磷酸酶活性縮短骨礦化時間,改善骨質(zhì)疏松[5];在分子水平上女貞子提取物可上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞的BMP-2和β-catenin的mRNA的表達,促進骨髓間充質(zhì)干細胞的骨向分化;動物實驗證實女貞子提取物增加去卵巢大鼠的骨無機質(zhì)、骨鈣含量,提升骨密度。女貞子水提物具有擬雌激素作用,通過雌激素受體信號通路對成骨細胞分化起作用,實驗表明其可促進成骨細胞系MC3T3-E1細胞增殖分化,增加了OPG/RANKL mRNA表達比率;在動物實驗中女貞子水提取物可對抗維甲酸或去卵巢導致的大鼠骨質(zhì)疏松[6]。包含有齊墩果酸和熊果酸的女貞子提取物促進了骨髓間充質(zhì)干細胞的骨向分化。由以上研究現(xiàn)狀可以看出女貞子在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化上有重要作用,但其中的活性成分和作用機制尚不清楚。

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨組織微結構破壞進,導致骨脆性和骨折危險性增加為特征的疾病。其主要發(fā)病機制是由成骨細胞的骨形成作用不能夠平衡破骨細胞介導的骨吸收,導致骨量減少,骨密度減低。

圖1 女貞子成分-靶點相關網(wǎng)絡

注：APAF-1：Apoptotic protease-activating factor 1;CASP-3：Caspase-3;GSK-3 beta：Glycogen synthase kinase-3 beta。

3.2 抗骨質(zhì)疏松的作用機制與Wnt信號通路 Wnt信號途徑是一種對細胞增殖和分化具有重要調(diào)節(jié)作用的信號傳導系統(tǒng),包括信號啟動、分子傳遞、靶基因轉錄活化等幾個主要環(huán)節(jié),是一個由多種分子參與、相互影響、相互制約和協(xié)的途徑?？构琴|(zhì)疏松的作用機制可分為2大類,即抗骨吸收和促骨形成。Wnt/ catenin信號通路作為促進骨形成機制的核心,也成為重要的治療靶點。通過促進成骨細胞的增殖、分化及增強其細胞活性,促進骨的合成代謝。經(jīng)典的Wnt/ catenin信號通路在成骨細胞的生成及骨形成過程中起了至關重要的作用[7]。女貞子的5種成分中,與wnt途徑相關聯(lián)的是Casein kinase II subunit alpha、glycogen synthase “kinase 3” beta。它們是通過不同的分子作用于不同的蛋白整體激活wnt途徑從而達到抗骨質(zhì)疏松的作用。

Glycogen synthase kinase-3 beta是一個多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶,作為糖代謝的激素控制的負調(diào)節(jié)因子,調(diào)控Wnt信號通路。β-catenin的降解復合體解散主要由GSK3B等組成[8]。Wnt信號通路中形成多聚復合物,GSK3B導致其降解蛋白。Glycogen synthase kinase-3 beta能與女貞苷Gl3結合,擬合指數(shù)為4.562。最近,Glycogen synthase kinase-3 beta一直被看作是由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥的參與多種人類腫瘤治療的一個可行的目標,Glycogen synthase kinase-3 beta是人類許多疾病的一個治療靶點。Casein kinase II subunit alpha[9]的組成性激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物磷酸化大量含有酸性殘基的C-末端的絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化底物的催化亞基。通過磷酸化調(diào)節(jié)Wnt。Casein kinase II subunit alpha能與特女貞苷、女貞苷和油女貞苷相結合,但與女貞苷的結合能力最強,與油女貞苷的結合力最弱。

隨著Wnt信號通路對于骨形成[10]的重要作用得到證實,參與此通路的眾多調(diào)控蛋白也成為促骨合成治療骨質(zhì)疏松的潛在靶點,帶來了治療骨質(zhì)疏松的新希望。

3.3 抗骨質(zhì)疏松的作用機制與細胞凋亡 研究證實,骨量的快速丟失所造成的低骨量是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的最主要因素。骨量丟失取決于兩方面的因素,其一,是成骨細胞的形成減少和成骨功能的減退,其二,是破骨細胞的形成和募集增加,破骨作用增強。成骨細胞凋亡與骨質(zhì)疏松:骨細胞存在于骨表面，來源于局部的間充質(zhì)細胞。成骨細胞分泌類骨質(zhì)，進而鈣化為新骨。成骨細胞活性降低，成骨功能減退，是產(chǎn)生骨質(zhì)疏的一個方面。成骨細胞的凋亡可能與Fas/Fas—L系統(tǒng)有關。KawakaIni等“發(fā)現(xiàn)人的成骨細胞可以表達Fas抗原。并與外用血中單核細胞經(jīng)細胞因子刺激昕產(chǎn)生的Fas L結合導致成骨細胞的凋亡。女貞子的5種成分中,與凋亡途徑相關聯(lián)的是Cell division protein kinase 2、Apoptotic protease activating factor-1、Casein kinase II subunit alpha、Death-associated protein kinase 1、Caspase-3、Inositol-tetrakisphosphate 1-kinase。它們是通過不同的分子作用于不同的蛋白整體激活凋亡途徑從而達到抗骨質(zhì)疏松的作用。

Apoptotic protease activating factor-1是線粒體凋亡途徑中的重要因子。Apaf-1導致凋亡體的形成,然后激caspase-9水解。激活的caspase-9能使caspase的下游信號開放執(zhí)行細胞程序性死亡。在凋亡發(fā)生過程中,許多蛋白質(zhì)直接或間接的與Apaf-1發(fā)生相互作用,Apaf-1實質(zhì)上是構成凋亡的核心成份。Apaf-1能與特女貞苷和女貞苷Gl3結合,與特女貞苷的結合能力更強。Caspase-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用,在細胞凋亡啟動時,116 kD的PARP在Asp216-Gly217之間被caspase-3剪切成31 kD和85 kD 2個片段,經(jīng)過一系列反應,裂解核小體間的DNA,引起細胞凋亡。caspase-3還可以剪切PKCd和PKCq,過量表達PKCd和PKCq均可以引起細胞凋亡,說明它們都參與了細胞凋亡的誘導。Caspase-3能夠與女貞苷相結合,擬合指數(shù)為5.06。Cell division protein kinase 2磷酸化CTNNB1、usp37、p53、TP53、NPM1、CDK7、Rb1,BRCA2基因,在策劃一個微妙的平衡之間的細胞增殖,細胞死亡的關鍵作用。Cell division protein kinase 2能與紅景天苷結合,擬合指數(shù)為4.5。Death-associated protein kinase 1在機體中廣泛參與由多種信號介導的細胞死亡過程;DAPK1作為細胞凋亡正調(diào)控因子,可通過上調(diào)p53基因的表達而促使細胞進人工型細胞凋亡程序,也可與非 p53依賴的經(jīng)典凋亡途徑發(fā)生關聯(lián)它是一類與細胞死亡有關的酶。Death-associated protein kinase 1能夠與女貞苷Gl3結合,擬合指數(shù)為4.528。Casein kinase II subunit alpha調(diào)節(jié)許多細胞過程,如細胞凋亡,也可以負調(diào)節(jié)細胞凋亡。還需要p53/TP53基因介導的細胞凋亡。Casein kinase II subunit alpha與特女貞苷、女貞苷和油女貞苷相關聯(lián)。其中與女貞苷的結合能力最強,與油女貞苷的結合力最弱。Inositol-tetrakisphosphate 1-kinase是一種酶、異構酶、激酶、轉移酶。通過干擾TNFRSF1A相關死亡結構域激活TNF-α誘導的細胞凋亡改變。Inositol-tetrakisphosphate 1-kinase能與女貞苷結合,擬合指數(shù)是4.975。

張明發(fā)等研究發(fā)現(xiàn),女貞子及其活性成分紅景天苷等具有抗骨質(zhì)疏松作用,可通過促進維生素D3生物合成以及維生素D受體和鈣結合蛋白表達,促進腸Ca吸收,抑制尿Ca排泄,提高骨密度等驗證了我們的結果[11]。孫為等[12]研究表明二至丸治療12周后,可以通過Wnt/LRP5/β-catenin信號通路發(fā)揮抗下頜骨骨質(zhì)疏松的作用,Wnt3a、lrp5、β-catenin的 mRNA表達升高,DKK1的 mRNA表達下降。此外,二至丸可以調(diào)節(jié)牙槽骨的Wnt/β-catenin信號通路中Lrp5和DKK-1的量[13]。前期實驗結果已經(jīng)證明了二至丸的抗骨質(zhì)疏松活性,與女貞子配伍的墨旱蓮旁區(qū)內(nèi)減毒,推測了女貞子的抗骨質(zhì)疏松活性,通過實驗證實女貞子確實是中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥中的主要基本藥物,其成分能起到抗凋亡、減毒的作用。以上都為我們的結果提供了依據(jù)并起到驗證作用。

體外實驗發(fā)現(xiàn)紅景天苷通過其抗氧化作用,顯著對抗H2O2引起的成骨細胞系MC3T3-E1細胞存活率下降和堿性磷酸酶活性下降,促進骨沉積以及堿性磷酸酶和骨鈣素的基因轉錄表達[14]。紅景天苷還降低MC3T3-E1細胞內(nèi)活性氧生成和破骨細胞分化誘導因子(如H2O2誘導的RANKL)和IL-6的生成[15],認為紅景天苷至少是部分通過抑制骨重吸收遞質(zhì)的釋放和對抗骨形成細胞的氧化損傷,進而緩解骨丟失。

國際上,許多藥物公司及專家寄希望于發(fā)現(xiàn)及開發(fā)多靶點的抗骨質(zhì)疏松藥物,比較單靶點西藥,從中藥中發(fā)現(xiàn)調(diào)控骨重建平衡,即抑制骨吸收的同時增強骨礦化的雙功能、多靶點藥物有非常廣闊的前景。近年來,中藥復方如二至丸等,在防治骨相關疾病包括骨質(zhì)疏松方面已經(jīng)顯示出一定優(yōu)勢,進一步揭示中藥防治骨質(zhì)疏松的作用機制是當前中藥研究人員面臨的機遇與挑戰(zhàn)。本文預測出的女貞子潛在作用靶點得到文獻藥理數(shù)據(jù)的印證,所建立的女貞子多成分-多靶點網(wǎng)絡能夠反映中藥“多成分、多靶點”特點。這一方法可望用于虛擬篩選中藥有效物質(zhì)并發(fā)現(xiàn)其作用靶點。另一方面,通過中藥成分與靶點的對接計算,分析并優(yōu)化網(wǎng)絡靶點及成分組合物,有利于抗骨質(zhì)疏松的創(chuàng)新中藥研制。因此,建立并發(fā)展適合于中藥多成分、多靶點整合調(diào)節(jié)特色的新的分子網(wǎng)絡模型,將為基于化學分子網(wǎng)絡-靶點網(wǎng)絡的創(chuàng)新中藥創(chuàng)制提供啟示和方法學借鑒。

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(2016-10-10收稿 責任編輯：王明)

Virtual Screening of Potential Anti-osteoporosis Targets for Compounds From Fructus Ligustri Lucidi

Zhan Mei, Zhou Jiajie, Wu Qicong, Cui Dahua, Liu Yanqiu

(Institute(College)ofIntegrativeMedicine,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Objective:To perform computational screening of potential target compounds from Fructus Ligustri Lucidi and to explore the biological significance of these targets which has anti-osteoporotic effect. Methods:ChemDraw and PharmMapper software were used to screen target components that were active against osteoporosis in the virtual world. Cytoscape software was used to establish a biological regulation network model. Results:Five components of Fructus Ligustri Lucidi (specnuezhenide, ligustroflavone G13, ligustroflavone, salidroside and oleonuezhenide) were able to bind different target proteins related to osteoporosis. Two targets, Glycogen synthase kinase (GSK)-3 beta and Casein kinase (CK)2-alpha, were related to the Wnt signaling pathway. Six targets (Cell division protein kinase [CDPK]-2, Apoptotic protease-activating factor [APAF]-1, CK2-alpha, Death-associated protein [DAP] kinase 1, Caspase[CASP]-3 andInositol-tetrakisphosphate 1-kinase[ITPK1]) were related to apoptosis pathways. Among the 5 binding components, some had multiple targets while some targets could be associated with different components. Specnuezhenide, ligustroflavone and ligustroflavone G13 were able to combine with APAF-1; specnuezhenide, ligustroflavone and oleonuezhenide shared CK2-alpha. Conclusion:Through screening of Fructus Ligustri Lucidi target components, we found that some components promote bone formation and inhibit bone resorption through alteration of Wnt and apoptosis pathways. It is helpful to understand the multiple target mechanisms of Fructus Ligustri Lucidi components and their anti-osteoporosis effects.

Fructus Ligustri Lucidi; Apoptosis pathway; Wnt pathway; Target

國家自然科學基金項目(81473545);大連醫(yī)科大學本科創(chuàng)新人才培養(yǎng)教學改革項目基金(2016111506010203;400006)

戰(zhàn)美(1996.03—),女,本碩連讀在讀,研究方向:臨床醫(yī)學,E-mail:953024934@qq.com

劉艷秋(1978.10—),女,博士,副教授,研究方向:中西醫(yī)結合基礎,Tel:(0411)86110192,E-mail：yqliu@dmu.edu.cn

R245.31

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.07.053