王東生，耿 強(qiáng)，周家海，江 凌*，黃 和

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009；3.中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所 生命有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；4.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

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海藻糖合成酶結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展

王東生1，耿 強(qiáng)2，周家海3，江 凌2*，黃 和4

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009；3.中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所 生命有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；4.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

海藻糖合成酶能夠以麥芽糖為底物，通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用，一步催化反應(yīng)生成海藻糖。綜述了國內(nèi)外海藻糖合成酶結(jié)構(gòu)和功能的最新研究進(jìn)展，列舉了已經(jīng)被克隆和表達(dá)的海藻糖合成酶及其酶學(xué)性質(zhì)，總結(jié)和比較了幾種已被解析的海藻糖合成酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理，指出了海藻糖合成酶的深入研究對(duì)海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)的重要意義。

海藻糖合成酶；晶體結(jié)構(gòu)；催化機(jī)制

海藻糖合成酶(trehalose synthase，簡稱TreS)能夠以麥芽糖為底物，催化分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用生成海藻糖，即將麥芽糖的α,α-1,4-糖苷鍵轉(zhuǎn)變?yōu)楹Ｔ逄堑摩?α-1,1-糖苷鍵。通過對(duì)不同來源TreS序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，TreS是糖基水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13，簡稱GH13)成員之一[1]。Tsusaki等[2]將其列為GH13的16亞族(GH13-16 subfamily，麥芽糖葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶亞族)和33亞族(GH13-33 subfamily，TreS亞族)。

由于海藻糖的特殊性質(zhì)，一般不能通過化學(xué)方法合成，大多采用生物法合成。目前，工業(yè)上常用酶催化、微生物抽提和發(fā)酵這3種方法大規(guī)模生產(chǎn)海藻糖[3]。但由于微生物抽提法工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高，發(fā)酵法轉(zhuǎn)化率低、發(fā)酵副產(chǎn)物多、提取精制困難等，因此這兩種方法都不適于海藻糖的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。通過酶催化生產(chǎn)海藻糖，產(chǎn)物成分明確，分離工藝相對(duì)簡單，可有效提高海藻糖得率。目前，酶催化生產(chǎn)海藻糖的途徑主要有5種[4]，其中TreS法生產(chǎn)路線最為簡單，TreS以麥芽糖為底物一步催化生成海藻糖。這種方法的關(guān)鍵在于TreS需具有高轉(zhuǎn)化率和強(qiáng)的溫度、pH值耐受性。但是TreS法也存在轉(zhuǎn)化率低，溫度、pH耐受性差，副產(chǎn)物得率高等缺點(diǎn)[1]。

通過對(duì)酶催化機(jī)理的深入了解可對(duì)酶分子的改造做出理性指導(dǎo)。因此，對(duì)TreS催化機(jī)理的深入研究十分重要。作者綜述了近年來關(guān)于TreS結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展，總結(jié)了TreS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和部分已知的催化機(jī)理。

1 海藻糖合成酶的酶學(xué)性質(zhì)

1996年，Nishimoto等[5-6]率先從脂肪桿菌(Pimelo-bactersp.R48)和水生棲熱菌(ThermusaquaticusATCC33923)中分離得到了TreS，并初步研究了其酶學(xué)特性。此后，更多不同來源的TreS被異源表達(dá)。來源于不同菌的TreS的基本性質(zhì)見表1。

表1不同來源的TreS信息統(tǒng)計(jì)

Tab.1 The information statistics of trehalose synthase from various bacteria

由表1可以發(fā)現(xiàn)，從基因的大小來看，來自嗜熱菌的TreS基因的核苷酸數(shù)在2 800個(gè)左右，而來自常溫菌的TreS基因的核苷酸只有1 800個(gè)左右。而且分子量大小與TreS的性質(zhì)有直接的關(guān)系。一般而言，分子量相對(duì)較大的TreS最適反應(yīng)溫度都在45 ℃以上，分子量小的TreS通常在20～35 ℃之間。

TreS在溶液中呈活性狀態(tài)時(shí)，通常都是以多聚體的形式存在。來源于彎曲高溫單孢菌(Thermomonosporacurvata)的TreS在活性狀態(tài)下是由3個(gè)大小為60 kDa的單體組成的同源三聚體蛋白[4]；來源于嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)的TreS在活性狀態(tài)下是由4個(gè)大小為61 kDa的單體組成的同源四聚體蛋白[25]；來源于恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)的TreS在活性狀態(tài)下是由6個(gè)大小約為400 kDa的單體組成的同源六聚體蛋白[11]；Wang等[26]發(fā)現(xiàn)來源于抗輻射奇異球菌(Deinococcusradiodurans)的TreS在活性狀態(tài)下是分子量約為120 kDa的同源二聚體蛋白；Roy等[27]發(fā)現(xiàn)來源于結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的TreS在活性狀態(tài)下是同源四聚體蛋白。雖然不同TreS在活性狀態(tài)下的聚合形式、單體分子量大小都不一樣，但是它們的生物學(xué)功能都是一樣的。

2 海藻糖合成酶結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

2.1 TreS已解析結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)

目前，已經(jīng)有來源于3種不同菌株分別包括母體、突變體和復(fù)合物的TreS結(jié)構(gòu)，通過X-射線衍射法被解析出來，已解析出的TreS結(jié)構(gòu)的基本信息統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 TreS結(jié)構(gòu)信息統(tǒng)計(jì)

Tab.2 The information statistics of trehalose synthase structure

注：*括號(hào)內(nèi)數(shù)值為最高分辨率殼層的數(shù)據(jù)。

2.2 TreS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

已解析出的TreS結(jié)構(gòu)，從宏觀上主要被分為4個(gè)部分，分別命名為結(jié)構(gòu)域A、B、C、D(圖1)。正如GH13家族其它的酶一樣，每個(gè)TreS單體主要包括一個(gè)catalytic(β/α)8barrel組成的結(jié)構(gòu)域D，一個(gè)C-terminalsandwich (大約有90個(gè)氨基酸殘基)組成的結(jié)構(gòu)域C[16,26]。結(jié)構(gòu)域D是由(β/α)8barrel組成的核心區(qū)域，TreS的活性中心就在這塊區(qū)域中[16,26]；結(jié)構(gòu)域 C是由2個(gè)反向平行的β-sheets和2個(gè)β-strands組成的，這個(gè)區(qū)域通過一個(gè)由氫鍵和疏水作用力形成的廣泛的相互作用網(wǎng)絡(luò)緊緊地與(β/α)8barrel連接。結(jié)構(gòu)域C相對(duì)來說有其特色，例如：DrTS和MtTS有50%的序列相似性，但它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)域C僅有25%的序列相似性[26]。

圖1 TreS的晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 Crystal structure of trehalose synthase

另外兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的形成是通過TreS結(jié)構(gòu)內(nèi)部α螺旋、β折疊等和(β/α)8barrel之間的擠壓盤繞形成的，它們分別被稱為結(jié)構(gòu)域A和B。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都是loop-rich結(jié)構(gòu)，因此結(jié)構(gòu)柔性相對(duì)較大。結(jié)構(gòu)域A(大約含有80個(gè)氨基酸殘基)與GH13家族的酶一樣，由一個(gè)短的α螺旋和2個(gè)或3個(gè)反向平行的β-strands[16,26]組成。結(jié)構(gòu)域A與(β/α)8barrel有著強(qiáng)烈的相互作用，它們之間能夠形成10～20個(gè)氫鍵和大量的疏水作用力。另一方面，結(jié)構(gòu)域B在TreS中是比較特別的，其中包括一個(gè)短的α螺旋，除α螺旋外其它部分沒有表現(xiàn)出明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)，呈無規(guī)則的loop狀態(tài)。結(jié)構(gòu)域D不但包括(β/α)8barrel還包括一個(gè)催化區(qū)域，催化區(qū)域的組成包括催化三聯(lián)體Asp-Glu-Asp 和許多保守的底物結(jié)合殘基[26,28]。結(jié)構(gòu)域B和C與二聚體的形成有關(guān)。結(jié)構(gòu)域A中的一部分loop區(qū)域?qū)τ诨钚圆课坏某ㄩ_和閉合充當(dāng)了一個(gè)可開關(guān)的“門”的作用[26]。

另外，GH13家族的許多酶都包含金屬離子，Kobayashi等[29]發(fā)現(xiàn)金屬離子的參與可能涉及到維持酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來源于人類腸道菌Bacteroidesthetaiotaomicron的α-淀粉酶和MsTS都存在一個(gè)鎂離子和一個(gè)鈣離子[30]。例如：Wang等[26]在DrTS中發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)相似的可以結(jié)合鎂離子的位點(diǎn)，鎂離子的結(jié)合位點(diǎn)包括Asp24、Asp26、Asp28、Asp32的側(cè)鏈和Lys30的主鏈O原子，形成了這樣一個(gè)序列DXNXDGXGD。在一些其它的GH13家族成員中同樣發(fā)現(xiàn)了這樣一個(gè)位置，例如在Rhizobiumsp.中的MX-5Sucrose isomerase和酵母中的isomaltase就有相似的鈣離子結(jié)合部位[31-32]。另一方面，鈣離子的結(jié)合部位會(huì)被結(jié)合位點(diǎn)上的部分氨基酸殘基(Asn、Asp、Glu、Tyr、Leu)調(diào)整。許多α-淀粉酶都有一個(gè)相似的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)都會(huì)有一個(gè)保守的Asp殘基[33]。

2.3 TreS底物結(jié)合及構(gòu)象的變化

根據(jù)部分已解析的GH13家族酶的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：底物結(jié)合模塊插入到(β/α)8barrel中，其移動(dòng)可以覆蓋甚至封閉活性部位的入口[26]。雖然NpAS的結(jié)構(gòu)與XaSH的序列一致性只有36%，但當(dāng)它們結(jié)合Tris、葡萄糖、蔗糖和麥芽七糖時(shí)，卻能夠表現(xiàn)出一個(gè)相似的構(gòu)象[34]。然而，Skov等[35]發(fā)現(xiàn)apoD.radioduransAS(DrAS)表現(xiàn)出了一個(gè)顯著不同的構(gòu)象，它有著一個(gè)更加開放的活性位點(diǎn)。此外，Ravaud等[31]發(fā)現(xiàn)RhSI結(jié)合Tris、葡萄糖、蔗糖和抑制劑時(shí)，表現(xiàn)出了一個(gè)相似的封閉結(jié)構(gòu)，ScIM的晶體結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出了一個(gè)幾乎封閉的構(gòu)象，其底物與活性位點(diǎn)的結(jié)合機(jī)制目前還不清楚[32]。由于ScIM與RhSI有38%的序列一致性和高的結(jié)構(gòu)同源性，推測(cè)它們形成這樣的封閉構(gòu)象有可能跟結(jié)構(gòu)域A和底物結(jié)合模塊有關(guān)，特別是結(jié)構(gòu)域A和(β/α)8barrel中靠近活性中心的兩段loop，這兩段loop可能涉及到活性位點(diǎn)的開與關(guān)[26]。

Wang等[26]通過結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，DrTS、MsTS和MtTS的晶體結(jié)構(gòu)顯示出不同酶的結(jié)構(gòu)差異，主要是結(jié)構(gòu)域之間的相對(duì)方向不同。但是在XaS-sucrose、NpAS-maltoheptaose和DrTS-Tris的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中結(jié)構(gòu)域A的相對(duì)方向是一致的，特別是在活性中心正上方的一段loop都有著一個(gè)相似的空間位置，而且apo XcSH、apo DrAS、MsTS和MtTS的結(jié)構(gòu)域A也有一個(gè)相似的走向，可能是因?yàn)門reS與這些酶有較高的結(jié)構(gòu)同源性，特別是相似的活性部位和結(jié)構(gòu)域A。

在GH13家族的很多酶中已經(jīng)證實(shí)，Tris作為一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑能夠抑制蔗糖與TreS的結(jié)合[31,34]，其抑制效果也已經(jīng)被證實(shí)[1,17]。例如Wang等[26]在DrTS-Tris復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)，活性中心附近的殘基之間形成鹽橋和氫鍵封閉了活性中心的入口，結(jié)構(gòu)域A中的3個(gè)氨基酸(Ile150、Phe151、Phe173)和S7中的4個(gè)氨基酸(His318、Asp319、Glu320、Glu324)都構(gòu)成活性口袋的一部分[26]，這意味著底物與這些殘基的相互作用將會(huì)使這兩個(gè)子域相互靠近形成一個(gè)關(guān)閉的構(gòu)象。Wang等還證明了DrTS野生型和N253A突變體的晶體結(jié)構(gòu)除了Glu324的側(cè)鏈走向外基本上是完全相同的。在N253A突變體中，Asn253和Glu324相互作用的破裂導(dǎo)致Glu324側(cè)鏈的移動(dòng)，其側(cè)鏈的移動(dòng)是為了給活性中心創(chuàng)造一個(gè)小的溶劑進(jìn)入的孔洞。這就是N253A突變體有約11%的異構(gòu)酶活性和約180%的水解活性的原因。與N253A相似，R148A突變體表現(xiàn)為約12%的異構(gòu)酶活性和約150%的水解活性，這表明當(dāng)148位的Arg被Ala代替時(shí)，也有可能形成了一個(gè)小的可以讓水分子進(jìn)入的孔洞[26]。

2.4 TreS與小分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)

Roy等[27]解析出了M.tuberculosisTreS的晶體結(jié)構(gòu)。通過超速離心分析方法得知此酶在溶液中是形成四聚體，通過X-ray小角散射發(fā)現(xiàn)，TreS連同Pep2形成了一個(gè)異八聚體的絡(luò)合物，而且Roy等證明了這個(gè)絡(luò)合物的形成能夠顯著地提高Pep2的麥芽激酶的活性，此絡(luò)合物的生成可能在糖基轉(zhuǎn)移酶GlgE途徑中充當(dāng)一個(gè)調(diào)控機(jī)制，它的存在能夠避免代謝途徑中中間產(chǎn)物毒素的積累。

Pan等[36]發(fā)現(xiàn)TreS表現(xiàn)出α-淀粉酶的活性，能被α-葡糖苷酶的抑制劑阿卡波糖有效地競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Cancer等[16]獲得了分辨率為1.84 ?的TreS-acarbose復(fù)合物結(jié)構(gòu)，出人意料的是，阿卡波糖并沒有結(jié)合在TreS的活性部位上，而是結(jié)合在了離TreS活性部位大約40 ?遠(yuǎn)的一個(gè)界限清晰的表面口袋上(圖2a)，阿卡波糖形成一個(gè)彎曲的構(gòu)象(圖2b)。在結(jié)合部位內(nèi)有一個(gè)由Trp476、 Met480、 Phe577、Trp579這幾個(gè)氨基酸構(gòu)成的一個(gè)疏水區(qū)域負(fù)責(zé)與阿卡波糖的結(jié)合。Laskowski等[37]分析表明，結(jié)合口袋是由位于C端結(jié)構(gòu)域與(β/α)8barrel中的1個(gè)α螺旋之間相鄰的13個(gè)氨基酸殘基組成的，而且配體在連接時(shí)形成了6個(gè)氫鍵。另外，蛋白結(jié)合界面覆蓋面積為505 ?2，或者說是覆蓋面積占了阿卡波糖分子總面積的63%。通過這個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的獲得也說明了以前的一些猜測(cè)：許多GH13家族成員都有這樣一個(gè)區(qū)域作為碳水化合物結(jié)合模塊。事實(shí)上，在糖苷水解酶中這種輔助的模塊對(duì)于碳水化合物的連接是非常常見的[38]。

a.阿卡波糖與TreS的結(jié)合位點(diǎn)離活性中心有40 ?的距離 b.阿卡波糖與TreS結(jié)合部位的詳細(xì)結(jié)構(gòu)

3 海藻糖合成酶催化作用機(jī)理研究進(jìn)展

TreS屬于糖基水解酶GH13家族，一個(gè)典型的(β/α)8桶狀催化結(jié)構(gòu)域是該家族酶共有的結(jié)構(gòu)特征[39]，研究者幾乎一致認(rèn)為它們的催化機(jī)制是相似的。

Nishimoto等[9]證明TreS以麥芽糖為底物催化生成海藻糖的過程不是分子間的反應(yīng)，而是一個(gè)分子內(nèi)的兩個(gè)單糖的重排過程。Koh[40]用放射性同位素標(biāo)記的方法，通過分析反應(yīng)物和不同產(chǎn)物的組成，進(jìn)一步說明了TreS催化的反應(yīng)是一種分子內(nèi)的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。在酶分子內(nèi)先是麥芽糖的α-1,4-糖苷鍵斷裂生成葡萄糖和葡萄糖基，然后再形成α-1,1-糖苷鍵，從而生成海藻糖，而在第二步水分子作為親和試劑攻擊葡萄糖基時(shí)會(huì)生成副產(chǎn)物葡萄糖。Wang等[26]在研究DrTS時(shí)發(fā)現(xiàn)，此酶狹窄且封閉的活性中心區(qū)域能夠在水中保護(hù)葡萄糖基酶中間物不被水解，而且為了完成分子內(nèi)異構(gòu)化反應(yīng)會(huì)在活性位點(diǎn)把雙糖分解為葡萄糖或果糖，最后重新攻擊共價(jià)的中間物。

Chen等[14]研究來自P.torridus的TreS時(shí)發(fā)現(xiàn)His106、Asp203、Glu245、His310、Asp311等5個(gè)氨基酸殘基與酶的催化活性緊密相關(guān)。通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)氨基酸在TreS和部分GH13家族酶中是高度保守的，如分別來自T.curvata、M.smegmatis、D.radiodurans、Pimelobactersp.R48、T.Aquaticus等的TreS。當(dāng)把這5個(gè)氨基酸分別突變后，突變體酶活幾乎完全喪失。Zhang等[28]通過分析研究來自M.smegmatis的TreS機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其與糖基水解酶家族有著一個(gè)相似的兩步雙取代機(jī)制(two-step,double-displacement mechanism)，并發(fā)現(xiàn)在M.smegmatis中與上述相同的5個(gè)保守氨基酸中，Asp230是作為催化親核試劑(catalytic nucleophile)，Glu272是常規(guī)的酸/堿催化(general acid/base catalyst)，His341和Asp342是保守的氨基酸(conserved carboxylic acid)。

4 展望

通過TreS生產(chǎn)海藻糖是當(dāng)前海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)的有效且廉價(jià)的途徑。由于TreS生產(chǎn)海藻糖所體現(xiàn)出來的優(yōu)勢(shì)，以及TreS本身性質(zhì)的部分缺陷，最近幾年對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)和功能的研究逐漸深入。目前，TreS的結(jié)構(gòu)和功能的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展和成果，但還有諸多問題有待于解決，如在酶的反應(yīng)過程中糖苷鍵的斷裂和生成的具體機(jī)制還有待確定等。我們相信，隨著對(duì)TreS結(jié)構(gòu)的了解和研究的逐漸深入，對(duì)此酶作用機(jī)制的詳盡闡明，將為該酶的后續(xù)改造提供理論基礎(chǔ)，以期達(dá)到提高酶的熱穩(wěn)定性、提高海藻糖的轉(zhuǎn)化率和降低副產(chǎn)物葡萄糖得率的目的，從而為TreS的工業(yè)化應(yīng)用創(chuàng)造更好的條件。

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Research Progress in Structure and Function of Trehalose Synthase

WANG Dong-sheng1，GENG Qiang2，ZHOU Jia-hai3，JIANG Ling2*，HUANG He4

(1.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering，NanjingTechUniversity，Nanjing210009，China；2.CollegeofFoodScienceandLightIndustry，NanjingTechUniversity，Nanjing210009，China；3.StateKeyLaboratoryofBioorganicandNaturalProductsChemistry，ShanghaiInstituteofOrganicChemistry，ChineseAcademyofSciences，Shanghai200032，China；4.CollegeofPharmacy，NanjingTechUniversity，Nanjing210009，China)

Trehalose synthase can catalyze maltose into trehalose in one step by intermolecular transglycosylation.We summarized the latest research progress of structure and function of trehalose synthase,and enumerated trehalose synthase which had been cloned and expressed,and their enzymatic properties.We also summarized and compared the structures and catalytic mechanisms of several trehalose synthases which had been resolved,and pointed out the importance of in-depth study of trehalose synthase to the industrial production of trehalose.

trehalose synthase；crystal structure；catalytic mechanism

中國科學(xué)院上海生命有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(SKLBNPC15429)，國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(21506101)，國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1603112)，江蘇省第十二批六大人才高峰計(jì)劃項(xiàng)目(2015-JY-009)，2016年度省級(jí)環(huán)?？蒲姓n題(2015053)

2017-03-08

王東生(1996-)，男，安徽亳州人，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程和酶工程；通訊作者：江凌，博士，副教授，E-mail：jiangling@njtech.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.002

Q784

A

1672-5425(2017)07-0006-06

王東生，耿強(qiáng)，周家海，等.海藻糖合成酶結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(7)：6-11，16.