瞿雋申，周 紅，潘志權(quán)

(武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430073)

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兩種新型席夫堿-Mn(Ⅱ)配合物-殼聚糖復(fù)合材料的合成表征及其SOD活性

瞿雋申，周 紅*，潘志權(quán)

(武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430073)

以二乙烯三胺、三乙烯四胺分別與間苯二醛反應(yīng)合成二乙烯三胺-間苯二醛席夫堿(L1)、三乙烯四胺-間苯二醛席夫堿(L2)，然后與醋酸錳反應(yīng)合成了兩種席夫堿-Mn(Ⅱ)配合物，進(jìn)而與殼聚糖凝膠反應(yīng)合成了兩種席夫堿-Mn(Ⅱ)配合物-殼聚糖復(fù)合材料L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖和L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、掃描電子顯微鏡(SEM)及X-射線光電能譜(XPS)表征，采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法測定兩種復(fù)合材料的SOD活性，并對它們的重復(fù)利用性進(jìn)行了測試。FTIR、SEM及XPS表征結(jié)果表明，配合物與殼聚糖成功交聯(lián)；L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖、L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖的IC50分別為3.40 μg·mL-1、6.15 μg·mL-1，都具有較好的SOD活性；兩種材料穩(wěn)定且具有較好的重復(fù)利用性。

席夫堿配合物；殼聚糖；SOD活性

而人體細(xì)胞由于某些原因如老化等，可能無法分泌足夠多的SOD與CAT。而外源性攝入SOD與CAT非常困難。因酶類屬于蛋白質(zhì)，它們難以通過細(xì)胞膜且對儲存環(huán)境要求極高，這使得研究酶模擬物顯得愈發(fā)重要[8-9]。

根據(jù)中心金屬離子不同，天然的SOD可以分為銅鋅SOD[10]、鐵SOD[11]、鎳SOD[12-13]與錳SOD。其中錳SOD因具有高活性與低毒性而受到廣泛關(guān)注，含錳配合物可能具有很高的SOD潛力以及相對的低毒性。殼聚糖具有天然的低毒性、高生物相容性，被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記[14]、傷口愈合[15]以及作為藥物載體[16],干粉狀的殼聚糖也被應(yīng)用于藥物領(lǐng)域[17]。而許多金屬配合物在水溶液環(huán)境中并不穩(wěn)定，基于以上考慮，作者結(jié)合錳配合物的高SOD活性和殼聚糖的高生物相容性與低毒性，設(shè)計(jì)并合成了兩種不同的席夫堿配合物，將它們與醋酸錳配合并與殼聚糖結(jié)合合成復(fù)合材料，并考察了它們的SOD活性和重復(fù)利用性。復(fù)合材料的合成路線如圖1所示。

圖1 兩種復(fù)合材料的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

二乙烯三胺、三乙烯四胺、間苯二醛、乙醇、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、核黃素(維生素B2)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、蛋氨酸(Met),均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其中二乙烯三胺與三乙烯四胺減壓重蒸后使用，其它試劑均直接使用；三聚磷酸鈉(TPP)，分析純，麥克林；殼聚糖(脫乙酰度95%)，武漢格奧化學(xué)試劑有限公司；氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)，阿法埃莎；來源于牛肝的SOD，Sigma公司，保存于-20 ℃冰箱中。

EL204型分析天平，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；DF-101S型恒溫磁力油浴鍋，鞏義予華儀器廠；DZF-6050型真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 二乙烯三胺-間苯二醛席夫堿(L1)/三乙烯四胺-間苯二醛席夫堿(L2)的合成

二乙烯三胺先用鈉絲處理數(shù)日，至搖晃時(shí)沒有明顯氣泡出現(xiàn)。小心地濾除二乙烯三胺中的鈉絲，加入40 g(每500 mL)無水氫氧化鈉顆粒，攪拌加熱2 h。減壓蒸餾，取沸點(diǎn)為156 ℃(0.05 atm下)的餾分作為備用試劑。重蒸后二乙烯三胺顏色明顯變淡，為透明略帶淡黃色液體。

三乙烯四胺處理方法與二乙烯三胺相似，其沸點(diǎn)略高，0.05 atm下約為165 ℃，重蒸后顏色明顯變淡，為透明澄清淡黃色液體。

取重蒸過的二乙烯三胺0.01 mol(1.031 g)溶于20 mL無水乙醇中，將其緩緩滴入40 mL溶有0.021 mol(2.82 g)間苯二醛的乙醇中，于1 h內(nèi)滴完。滴加完成后繼續(xù)反應(yīng)5 h，期間可見淡黃色沉淀緩緩生成。反應(yīng)結(jié)束后收集沉淀并用甲醇多次洗滌，于40 ℃真空干燥24 h，所得淡黃色粉末即配體L1，備用。

取重蒸過的三乙烯四胺0.01 mol(1.462 g)同法合成配體L2。

1.3 殼聚糖凝膠的制備[18]

將1.5 g 殼聚糖溶于500 mL 1%(m/V)乙酸溶液中，攪拌至完全溶解后靜置1 h使之穩(wěn)定。后經(jīng)蠕動泵(100 mL·min-1)將殼聚糖溶液泵入500 mL 0.5 mg·mL-1TPP溶液中，并劇烈磁力攪拌。泵完后繼續(xù)劇烈攪拌1 h，所得象牙白懸濁液靜置24 h后，經(jīng)高速離心(9 000 r·min-1，15 min)分離，并用超純水洗滌5次，保存于水中備用。

1.4 L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料的合成

取L1 0.0025 mol(0.836 g)于40 mL無水DMF中，加熱攪拌使之溶解，再將20 mL溶有0.0026 mol(0.6372 g)二水合醋酸錳的DMF緩緩滴入其中，滴完后繼續(xù)攪拌反應(yīng)5 h。將約1 g殼聚糖凝膠超聲分散于20 mL DMF中，傾倒入上述溶液中，反應(yīng)24 h。所得固體離心收集，并用乙醇與水各洗滌5次，每次洗滌時(shí)固體至少在乙醇或水中浸泡2 h，最終得到紅棕色凝膠，于 40 ℃真空干燥24 h，所得固體仔細(xì)研磨，得L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料。

取L2 0.0025 mol(0.9425 g)同法合成L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料。

分別用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、掃描電子顯微鏡(SEM)、X-射線光電能譜(XPS)對復(fù)合材料進(jìn)行表征。

1.5 L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料的SOD活性及重復(fù)利用性測試

實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先稱取12 mg復(fù)合材料分散在50 mL PBS溶液中，依照逐級稀釋法配制多種不同濃度的樣品溶液，備用。在測試時(shí)，精確量取1 mL樣品溶液以及4.99 mL 0.05 mol·L-1蛋氨酸、1 mL 1.16×10-3mol·L-1NBT、1 mL 8.50×10-5mol·L-1核黃素以及0.01 mL 2.55×10-6mol·L-1EDTA(反應(yīng)液中添加EDTA是為了掩蔽可能存在的微量金屬離子，避免對測試結(jié)果的干擾)。在反應(yīng)前，先向混合液中鼓入空氣并在黑暗條件下攪拌5 min，之后在光照條件下反應(yīng)10 min，測定樣品溶液吸光度Asample。用1 mL PBS溶液代替樣品溶液進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，測定吸光度Ablank。樣品的抑制率按下式計(jì)算：

對兩種復(fù)合材料進(jìn)行重復(fù)利用性測試。實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，配制溶液I(總體積為4 mL的PBS溶液中包括0.05 mol·L-1蛋氨酸、1.16×10-3mol·L-1NBT、8.50×10-5mol·L-1核黃素以及2.55×10-6mol·L-1EDTA)，向溶液Ⅰ中投入約2 mg樣品，在反應(yīng)開始前，向混合液中通入空氣在黑暗條件下攪拌5 min，接著在光照條件下反應(yīng)10 min。測定光照前(Aa)和光照后(Ab)混合液在560 nm處的吸光度，計(jì)算抑制率。然后將上述光照后的混合液標(biāo)記為溶液Ⅱ，向溶液Ⅱ中加入新制得的溶液Ⅰ，重復(fù)如上所述的實(shí)驗(yàn)步驟，循環(huán)5次。

2 結(jié)果與討論

2.1 L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料的表征

2.1.1 紅外光譜分析(圖2)

圖2 L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖(a)/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖(b)復(fù)合材料的紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of L1-Mn(Ⅱ)-chitosan(a) and L2-Mn(Ⅱ)-chitosan(b)

由圖2可知，在未與殼聚糖交聯(lián)前，配體在1 641 cm-1與1 639 cm-1處可見明顯的吸收峰，為C=N振動吸收峰，該峰的存在表明在合成L1與L2時(shí)形成了C=N。同時(shí)，在1 692 cm-1與1 693 cm-1處可見清晰吸收峰，該吸收峰為C=O振動吸收峰，說明在合成席夫堿的同時(shí)，L1與L2分子中仍存在未反應(yīng)的醛基，后續(xù)反應(yīng)是可以進(jìn)行的。在與殼聚糖交聯(lián)后，L1的1 692 cm-1處與L2的1 693 cm-1處的吸收峰消失，只剩下1 654 cm-1處的吸收峰，該吸收峰為C=N振動吸收峰，表明L1、L2成功與殼聚糖交聯(lián)。

2.1.2 XPS分析(圖3)

圖3 L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖(a,b)/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖(c,d)復(fù)合材料的XPS全掃描和Mn 2p分峰圖Fig.3 XPS full scan and Mn 2p core-level spectra of L1-Mn(Ⅱ)-chitosan(a,b) and L2-Mn(Ⅱ)-chitosan(c,d)

由圖3a可知，L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料中含Mn、C、O、N 4種元素，其表層原子含量分別為Mn 16.12%、C 23.45%、N 5.50%、O 54.93%。進(jìn)一步對Mn元素進(jìn)行分峰，可見Mn的結(jié)合能裂分為2p1/2與2p3/2兩個(gè)峰(圖3b)，其能量分別為652.6 eV與640.5 eV。

由圖3c可知，L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料中也含Mn、C、O、N 4種元素，其表層原子含量分別為Mn 22.72%、C 18.61%、N 5.04%、O 55.63%。Mn 2p分峰圖(圖3d)中，Mn的結(jié)合能裂分為2p1/2與2p3/2兩個(gè)峰，其能量分別為652.9 eV與640.5 eV。

與文獻(xiàn)報(bào)道的醋酸錳中Mn元素的結(jié)合能2p1/2653.7 eV、2p3/2641.8 eV相比，兩種復(fù)合材料中Mn元素的結(jié)合能均有明顯的不同。L1的2p1/2與2p3/2的結(jié)合能分別減少了1.1 eV和1.3 eV，L2的2p1/2與2p3/2的結(jié)合能分別減少了0.8 eV與1.3 eV，這種結(jié)合能的減少是由N與Mn的配位引起的。在制備過程中樣品經(jīng)過多次超聲、離心、洗滌、浸泡，表面不含游離的金屬離子，可以初步判斷Mn與配體發(fā)生了配合。

2.1.3 SEM分析(圖4)

a.殼聚糖凝膠 b.干燥并研磨的殼聚糖凝膠 c.未干燥的L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖 d.干燥并研磨的L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖

Fig.4 SEM images of chitosan gel and composites

由圖4可見，干燥前，殼聚糖呈單個(gè)顆粒凝膠狀且每個(gè)凝膠顆粒由多個(gè)更小的顆粒聚合而成(圖4a)；干燥并研磨后，殼聚糖表面呈粗糙且富有裂痕的狀態(tài)(圖4b)。而未干燥的復(fù)合材料呈明顯的交聯(lián)狀態(tài)，殼聚糖不再是一顆顆單獨(dú)的膠粒狀態(tài)而是被交聯(lián)成一種不規(guī)則的凝膠狀(圖4c、e)；在干燥后，復(fù)合材料的表面均呈光滑且較少龜裂的狀態(tài)(圖4d、f)。這種形態(tài)上的明顯不同可進(jìn)一步說明配體對殼聚糖的交聯(lián)作用。表明，已成功合成L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料。

2.2 L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料的SOD活性(圖5)

圖5 L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖(a)/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖(b)復(fù)合材料的SOD活性Fig.5 SOD like activities of L1-Mn(Ⅱ)-chitosan(a) and L2-Mn(Ⅱ)-chitosan(b)

由圖5可知，L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖的IC50為3.40 μg·mL-1，而L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖的IC50為6.15 μg·mL-1。

在相同條件下測定了不添加EDTA時(shí)天然酶(1 500 U·mg-1)的IC50，為0.7015 μg·mL-1。所合成復(fù)合材料的酶活性可達(dá)到天然酶的約20%與10%。相比于其它復(fù)合材料，如一種席夫堿金屬配合物-白蛋白氨基酸復(fù)合材料，其IC50報(bào)道為0.1 μmol·L-1，換算結(jié)果約為6.643 μg·mL-1。與之相比，所合成的復(fù)合材料SOD活性明顯較優(yōu)。

2.3 重復(fù)利用性結(jié)果(表1)

表1 L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料的重復(fù)利用性結(jié)果

Tab.1 Reusability data of L1-Mn(Ⅱ)-chitosan and L2-Mn(Ⅱ)-chitosan

由表1可看出，L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料均有良好的重復(fù)利用性，在重復(fù)利用5次后仍保持較高的SOD活性。

2.4 殼聚糖與可能存在的游離金屬離子對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

因殼聚糖本身就具有良好的染料吸附性能，而甲瓚是一種藍(lán)色染料。故為排除殼聚糖自身吸附對結(jié)果造成的影響，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。取0.2 g新鮮制備的殼聚糖凝膠，超聲分散于10 mL PBS溶液中，取1 mL作為樣品，測定SOD活性。結(jié)果表明，濃度為20 μg·mL-1的殼聚糖凝膠因其吸附所產(chǎn)生的SOD 活性(以抑制率表示)為4.25%，而所合成的復(fù)合材料在達(dá)到50%抑制率時(shí)濃度均小于20 μg·mL-1，所以可以排除殼聚糖凝膠吸附甲瓚對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

因Mn(Ⅱ)本身就具有很強(qiáng)的SOD活性，為了排除實(shí)驗(yàn)中可能存在的游離Mn(Ⅱ)對結(jié)果造成的影響，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。分別取2 mg L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖與L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖，超聲45 s分散于10 mL PBS溶液中，所得懸濁液靜置24 h后于9 000 r·min-1離心15 min，共計(jì)3次，所得上清液視為0.2 mg·mL-1溶液。小心取出上清液，將其稀釋至20 μg·mL-1、10 μg·mL-1與1 μg·mL-1，測定SOD活性，結(jié)果均未檢出SOD活性。表明復(fù)合材料中沒有游離Mn(Ⅱ)，復(fù)合材料的SOD活性均來源于復(fù)合材料本身。

3 結(jié)論

以二乙烯三胺、三乙烯四胺分別與間苯二醛反應(yīng)合成二乙烯三胺-間苯二醛席夫堿(L1)、三乙烯四胺-間苯二醛席夫堿(L2)，然后與醋酸錳反應(yīng)合成了兩種席夫堿-Mn(Ⅱ)配合物，進(jìn)而與殼聚糖凝膠反應(yīng)成功合成了L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖/L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖復(fù)合材料。XPS結(jié)果表明Mn(Ⅱ)與配體生成了配合物，F(xiàn)TIR、 SEM結(jié)果表明，配合物與殼聚糖產(chǎn)生了交聯(lián)。NBT法測定L1-Mn(Ⅱ)-殼聚糖與L2-Mn(Ⅱ)-殼聚糖的IC50分別為3.40 μg·mL-1與6.15 μg·mL-1，均具有良好的SOD活性和重復(fù)利用性。兩種復(fù)合材料合成簡單，在醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

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Synthesis，Characterization of Two Novel Schiff Base Manganese(Ⅱ) Complex-Chitosan Composites and Their SOD Like Activity

QU Jun-shen，ZHOU Hong*,PAN Zhi-quan

(SchoolofChemistryandEnvironmentalEngineering,WuhanInstituteofTechnology,Wuhan430073,China)

Using diethylenetriamine,triethylenetetramine,andp-phthalaldehyde as raw materials,we synthesized two novel Schiff base ligands(L1,L2),then synthesized L1/L2-manganese(Ⅱ) complexes with manganese acetate,and further synthesized L1/L2-manganese(Ⅱ)-chitosan composites with chitosan through sol-gel reaction.Moreover,we characterized the structures of the composites by Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR),scanning electron microscopy(SEM),and X-ray photoelectron spectroscopy(XPS),and measured their SOD like activities by a nitrobluetetrazolium (NBT) method and reusability.The results showed that the crosslinking of complexes and chitosan were successful,L1/L2-manganese(Ⅱ) complex-chitosan composites had good SOD like activities with IC50of 3.40 μg·mL-1and IC50of 6.15 μg·mL-1,respectively.Two composites were stable,and had good reusability.

Schiff base complex；chotisan；SOD like activity

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21171135)

2017-03-22

瞿雋申(1989-)，男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：功能配合物合成與性質(zhì)，E-mail：625797595@qq.com；通訊作者：周紅，教授，E-mail：hzhouh@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.005

O625.632

A

1672-5425(2017)07-0024-07

瞿雋申，周紅，潘志權(quán).兩種新型席夫堿-Mn(Ⅱ)配合物-殼聚糖復(fù)合材料的合成表征及其SOD活性[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(7)：24-30.