張改秀,王 蕾,杜 建,胡東陽,張明襯,郭婷婷,張曉盼

(1山西省兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 030013；2山西醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)教研室；*通訊作者，E-mail：2651024846@qq.com)

?

兒童1型糖尿病血清T細(xì)胞亞群與胰島功能的相關(guān)性

張改秀1*,王 蕾1,杜 建1,胡東陽2,張明襯2,郭婷婷2,張曉盼2

(1山西省兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 030013；2山西醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)教研室；*通訊作者，E-mail：2651024846@qq.com)

目的 分析1型糖尿病初發(fā)患兒外周血T細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)變化特點(diǎn)；探討1型糖尿病初發(fā)患兒外周血T細(xì)胞亞群與胰島功能的關(guān)系。 方法 選擇2010-05～2013-12山西省兒童醫(yī)院確診的T1DM初發(fā)患兒43例，25例健康體檢兒童為對照組。采用流式細(xì)胞技術(shù)測定血清CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群，并對兩組結(jié)果進(jìn)行比較。對T1DM初發(fā)患兒T細(xì)胞亞群與糖化血紅蛋白、C肽(C-P)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果 T1DM組患兒外周血CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞明顯高于對照組(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T1DM患兒外周血CD4+T細(xì)胞與HbA1c呈正相關(guān)(r=0.261，P<0.05)，與C-P呈負(fù)相關(guān)(r=-0.270，P<0.05)；CD8+T細(xì)胞與HbA1c無明顯相關(guān)性(r=-0.156，P>0.05)，與C-P水平呈正相關(guān)(r=0.162，P<0.05)；CD4+/CD8+T細(xì)胞與HbA1c無明顯相關(guān)性(r=0.200，P>0.05)，與C-P水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.243，P<0.05)。 結(jié)論 T1DM的發(fā)病過程存在T淋巴細(xì)胞亞群失衡， CD4+T細(xì)胞異常激活、CD8+T細(xì)胞缺陷和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值增高。CD4+及CD4+/CD8+T細(xì)胞與C肽呈負(fù)相關(guān)，CD8+T細(xì)胞與C肽呈正相關(guān)。

1型糖尿??； T細(xì)胞亞群； 胰島功能； 糖化血紅蛋白； C肽

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于內(nèi)源性胰島素絕對或相對缺乏，導(dǎo)致血糖增高而引起的全身慢性代謝性疾病[1]。兒童期常見1型糖尿病(type 1 diabetes，T1DM)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為T1DM是在遺傳易感性基因的基礎(chǔ)上，受到病毒感染等外界環(huán)境因素的影響，引起自身免疫功能紊亂，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的損傷和破壞，最終引起胰島β細(xì)胞的功能衰竭而發(fā)病[2]。T淋巴細(xì)胞對胰島的浸潤和破壞是1型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。

本課題采用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞技術(shù)測定43例T1DM初發(fā)患兒(T1DM組)及25例正常兒童(對照組)血清T細(xì)胞亞群。對T1DM初發(fā)患兒T細(xì)胞亞群的變化與糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)、空腹胰島素(Fins)及空腹C肽(C-peptide，C-P)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在探討T1DM初發(fā)患兒T細(xì)胞亞群的變化特點(diǎn)及與胰島功能之間的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組 收集2010-05～2013-12山西省兒童醫(yī)院確診的T1DM初發(fā)患兒共43例，男19例，女24例，年齡1.5-15歲，平均年齡(7.65±3.87)歲，均參照1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，同時(shí)依據(jù)以下臨床特征作出診斷[4]：①起病年齡較小(<20歲)；②起病較急，“三多一少”癥狀明顯，可有脫水、循環(huán)衰竭或昏迷等酮癥酸中毒癥狀；③空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖或任意血糖≥ 11.1 mmol/L；④C肽反應(yīng)低下并依賴胰島素治療。排除原發(fā)性心、肝、腦、腎等疾病或自身免疫性疾病，未使用激素、免疫調(diào)節(jié)劑及胰島素治療。

1.1.2 對照組 選取同期本院體檢的健康兒童25例，其中男11例，女14例，年齡1.5-14歲，平均年齡(6.84±3.60)歲。對照組均無糖尿病家族史，糖化血紅蛋白及空腹血糖檢測排除糖尿病。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 入院時(shí)詳細(xì)記錄患兒年齡、性別、病程、身高、體質(zhì)量、父母文化程度。

1.2.2 生化檢查 常規(guī)送檢空腹血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、C肽(C-P)水平、胰島素(Fins)。所有血樣均在早晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取。

1.2.3 外周血T細(xì)胞亞群(CD4+，CD8+，CD4+/CD8+)檢測 采用美國Beckman Coulter公司FC 500系列流式細(xì)胞分析儀及其提供的試劑等進(jìn)行T細(xì)胞亞群的檢測。實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用 EXPO32v1.2 Analysis 軟件分析CD4+T及CD8+T細(xì)胞的表達(dá)，從 FSC/SSC 雙參數(shù)散點(diǎn)圖中圈出T淋巴細(xì)胞群體設(shè)門并計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)所占T淋巴細(xì)胞的百分比得出結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

與對照組相比，T1DM組患兒年齡、病程、性別比例、體質(zhì)量指數(shù)等指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；患兒父母文化程度亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)，具有可比性。

表1 兩組研究對象一般情況比較

Table 1 Comparison of general clinical data between two groups

組別年齡(歲)病程(d)性別(男/女)體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)父母文化程度初中及以下高中大學(xué)及以上T1DM7．65±3．8739．37±1．1619/2420．2±0．51211012對照組6．84±3．6011/1419．1±0．741087

2.2 實(shí)驗(yàn)組與對照組CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T細(xì)胞比較

T1DM組CD4+T細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞較對照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

2.3 T1DM組T細(xì)胞亞群與胰島功能的相關(guān)性分析

T1DM組患兒CD4+T細(xì)胞與HbA1c呈正相關(guān)(r=0.261，P<0.05)，與C-P呈負(fù)相關(guān)(r=-0.270，P<0.05)；CD8+T細(xì)胞與HbA1c無明顯相關(guān)性(P>0.05)，CD8+T細(xì)胞與C肽水平呈正相關(guān)(r=0.162，P<0.05)；CD4+/CD8+T細(xì)胞與HbA1c無明顯相關(guān)性(r=0.200，P>0.05)，與C-P水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.243，P<0.05, 見表3)。

表2 對照組與T1DM組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的比較 (%)

Table 2 Comparison of CD4+, CD8+and CD4+/CD8+between control group and T1DM group (%)

組別CD4+CD8+CD4+/CD8+對照組 31．59±5．8428．44±2．981．22±0．36T1DM組36．39±8．4726．15±6．701．46±0．66t1．4131．5311．424P0．0370．0180．035

表3 CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T細(xì)胞與HbA1c及C肽的相關(guān)性分析

Table 3 Correlation analysis of CD4+T, CD8+T and CD4+/CD8+T cells with HbA1c and C peptide

指標(biāo)C?PHbA1crPrPCD4+-0．2700．0260．2610．031CD8+0．1620．108-0．1560．205CD4+/CD8+-0．2430．0460．2000．102

3 討論

1型糖尿病(T1DM)是自身免疫性疾病，遺傳因素和環(huán)境因素共同參與發(fā)病過程，兒童及青少年發(fā)病人數(shù)約占DM患者的5%[5]。我國兒童T1DM校正發(fā)病率為每年0.59/10萬，按全國人口年齡構(gòu)成的標(biāo)化發(fā)病率為每年0.57/10年，是世界上T1DM發(fā)病率最低的國家之一[6]。王克安等[5]對我國兒童T1DM發(fā)病率調(diào)查結(jié)果顯示：中國兒童1型糖尿病的發(fā)病率在逐年上升；發(fā)病率隨年齡的增長而增加；發(fā)病率在不同地區(qū)之間呈現(xiàn)明顯的南低北高現(xiàn)象。

T淋巴細(xì)胞包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩個(gè)功能亞群，在T1DM發(fā)病過程中發(fā)揮十分重要的作用。CD4+細(xì)胞是胰島β細(xì)胞早期主要的浸潤細(xì)胞，Th1/Th2主要通過自身或其他免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行自我調(diào)節(jié)和相互調(diào)節(jié)，以維持機(jī)體免疫平衡[7]。當(dāng)Th1和Th2兩種細(xì)胞功能失衡時(shí)，主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)基因編碼的Ⅱ類抗原HLA-DR3，DR4與胰島β細(xì)胞抗原相結(jié)合，與T細(xì)胞表面受體(T cell receptor，TCR)構(gòu)成“抗原-HLA Ⅱ類抗原-TCR復(fù)合物”，激活Th1細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞浸潤胰島，對胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，從而引起胰島β細(xì)胞的損傷和衰竭[8]。施畢渂[9]對37例T1DM外周血T細(xì)胞亞群等分子的表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果提示患者外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)明顯增加，CD8+T細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.01)。鄒曉蕾等[10]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的T1DM模型小鼠血清CD4+Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ水平明顯高于正常對照小鼠，認(rèn)為T1DM發(fā)病過程中存在CD4+Th1細(xì)胞優(yōu)勢分化，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2等對胰島β細(xì)胞發(fā)揮直接毒性效應(yīng)。支滌靜等[11]研究表明，病程<2年的T1DM患兒IFN-γ水平高于病程>2年者，認(rèn)為Th細(xì)胞的反應(yīng)與病程密切相關(guān)，并隨著T1DM病程的進(jìn)展，殘留胰島β細(xì)胞的減少，Th1細(xì)胞的表達(dá)也趨于穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T1DM初發(fā)患兒的外周血CD4+值與正常健康兒童相比，其CD4+T細(xì)胞所占百分比明顯增加(P<0.01)，說明Th1細(xì)胞在T1DM發(fā)病初期中被異常激活，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本組病例均為T1DM初發(fā)患兒，對于Th1細(xì)胞是否隨病程發(fā)展而趨于穩(wěn)定，尚不能得出結(jié)論。

CD8+T細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過MHC-Ⅰ類限制性的方式識別靶細(xì)胞表面的多肽抗原，代表抑制性T細(xì)胞(suppressor T cell，Ts)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)[12]。Ts細(xì)胞主要抑制CD4+T細(xì)胞增殖活化，維持自身免疫耐受；CTL能特異性殺傷靶細(xì)胞，在抗病毒感染和抗腫瘤免疫中起到重要作用[13]。有報(bào)道表明，CD4+T細(xì)胞等通過Fas/FasL通路誘導(dǎo)了胰島β細(xì)胞凋亡的起始，而CD8+T細(xì)胞識別胰島β細(xì)胞表面的MHC-I類蛋白后，通過分泌穿孔素、Fas/FasL的相互作用等途徑，貫穿于胰島β細(xì)胞凋亡的整個(gè)過程[14]。一般認(rèn)為，Ts細(xì)胞減少或失活，引起免疫失衡，進(jìn)一步誘導(dǎo)Th細(xì)胞對胰島β細(xì)胞免疫的損傷作用，促進(jìn)T1DM的發(fā)生和發(fā)展；CTL激活并介導(dǎo)對胰島β細(xì)胞的直接殺傷作用，則加速T1DM的發(fā)生[15]。喬凌燕等[16]對23例兒童1型糖尿病患兒研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細(xì)胞減少，其原因可能是CD8+毒性T淋巴細(xì)胞因介導(dǎo)胰島β細(xì)胞的破壞而大量消耗，或免疫功能調(diào)節(jié)不平衡所致。本研究檢測結(jié)果顯示，T1DM初發(fā)患兒的CD8+T細(xì)胞所占百分比明顯降低(P<0.01)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，CTL參與胰島β細(xì)胞的直接殺傷作用被大量消耗，最終引起CD8+T細(xì)胞的減少。

糖化血紅蛋白(HbA1c)與血糖水平的高低及持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)，通?？煞从矰M患者近2-3個(gè)月血糖的綜合平均濃度，是判斷和衡量DM患者長期血糖控制情況的金標(biāo)準(zhǔn)[17]。有研究表明，T1DM初發(fā)期CD4+/CD8+比值與HbA1c呈正相關(guān)(P<0.05)，也有學(xué)者將T1DM患兒的IFN-γ、IL-4值與HbA1c進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為T1DM患兒CD4+T細(xì)胞免疫狀態(tài)與血糖控制程度無相關(guān)性[18]。本研究對CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與HbA1c水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CD4+與HbA1c呈正相關(guān)(r=0.261，P<0.05)，而CD8+、CD4+/CD8+與HbA1c水平無明顯相關(guān)性。研究表明CD4+T細(xì)胞免疫活性增強(qiáng)促進(jìn)了患兒血糖水平的升高，而CD8+T細(xì)胞的免疫狀態(tài)與患兒血糖水平無明顯相關(guān)性。

C-P是反應(yīng)胰島β細(xì)胞功能的有力指標(biāo)[19]。本研究顯示CD8+T細(xì)胞與C-P水平呈正相關(guān)，CD4+、CD4+/CD8+T細(xì)胞與C-P水平呈負(fù)相關(guān)。C-P反映胰島β細(xì)胞的儲備和分泌功能，C-P水平越低，胰島β細(xì)胞的儲備將越少，分泌功能也越弱，而CD8+T細(xì)胞的Ts及CTL以自身消耗為代價(jià)介導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡過程，CD8+T細(xì)胞的減低間接反映了胰島β細(xì)胞的進(jìn)一步減少。因此，我們認(rèn)為CD8+與C肽水平在一定程度上呈正相關(guān)性。CD4+Th1細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，可直接促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)CD8+T細(xì)胞分化成熟，介導(dǎo)對胰島β細(xì)胞的損傷作用，故CD4+及CD4+/CD8+T與C-P水平呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，T1DM患兒血清T細(xì)胞亞群的變化及其與胰島功能的相關(guān)性涉及內(nèi)容廣泛且復(fù)雜。T淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子具有多效性、網(wǎng)絡(luò)性的特點(diǎn)，一種細(xì)胞因子不是單一起作用，而與其他細(xì)胞因子相互聯(lián)系起到協(xié)同或拮抗作用。深入研究每一種細(xì)胞、細(xì)胞因子及它們相互作用的機(jī)制，進(jìn)一步揭示T細(xì)胞與胰島功能的關(guān)系，將為明確1型糖尿病的免疫學(xué)機(jī)制，為T1DM的治療提供新的思路和策略。

[1] 李蘊(yùn),趙文明. 1型糖尿病發(fā)病及防治的免疫學(xué)研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2004, 32(1):43-47.

[2] 李敏,宋陸軍,秦新裕. 1型糖尿病(T1DM)的細(xì)胞免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,39(5):525-530.

[3] World Health Organization. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complication: report of a WHO consultation[DB/DL]. WHO, 1999. [2011-11-26]. http://www.staff.ncl.ac.uk/philip.home/who dmg.pdf.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會.中國1型糖尿病診治指南(節(jié)選)[J]. 糖尿病天地·臨床：下旬,2013,7(3):108-114.

[5] 王克安,李天磷,李新華,等. 中國兒童1型糖尿病發(fā)病率的研究[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志,1999,15(1):3-7.

[6] Knip M,Siljander H. Autoimmune mechanisms in type 1 diabetes[J]. Autoimmun Rev,2008,7(7):550-557.

[7] 唐晴琴,秦保東,仲人前.microRNA調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞分化與成熟的機(jī)制研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2016,32(1):125-128.

[8] Noble J A,Erlich H A. Genetics of type 1 diabetes[J]. Cold Spring Harb Perspect Med,2012,2(l):a007732.

[9] 施畢渂.1型糖尿病免疫病理機(jī)制的探討[D].蘇州:蘇州大學(xué)，2002.

[10] 鄒曉蕾,向明. CD4+/CD8+T細(xì)胞分型及T-bet/GATA3基因表達(dá)與1型糖尿病相關(guān)性研究[D].武漢:華中科技大學(xué),2008.

[11] 支滌靜,王曉川,沈水仙,等.兒童1型糖尿病Th1/Th2免疫應(yīng)答狀況研究[J].中華兒科雜志,2001,39(3):148-150.

[12] Umeshappa CS,Huang H,Xie Y,etal. CD4+Th-APC with acquired peptide/MHC class I and II complexes stimulate type 1 helper CD4+and central memory CD8+T cell responses[J]. J Immunol,2009,182(1):193-206.

[13] Haseda F,Imagawa A,Murase-Mishiba Y,etal. Low CTLA-4 expression in CD4+helper T-cells in patients with fulminant type 1 diabetes[J]. Immunol Lett,2011,139(1-2):80-86.

[14] Hamilton-Williams EE,Palmer SE,Charlton B,etal. Beta cell MHC class Ⅰ is a late requirement for diabetes[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(11):6688-6693.

[15] Mallone R,van Endert P. T cells in the pathogenesis of type 1 diabetes[J]. Curr Diab Rep,2008,8(2):101-106.

[16] 喬凌燕,陳志紅,田飛,等.23例1型糖尿病初發(fā)患兒免疫學(xué)改變與胰島β細(xì)胞功能的關(guān)系[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,5(11) :922-925.

[17] 覃彥平.糖化血紅蛋白檢測及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,9(1):48-49.

[18] 王學(xué)通,劉禮樂,蔡亦斌. 糖化血紅蛋白在糖尿病診治中的應(yīng)用研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(12):16-17.

[19] 繆海韜,張娟娟,顧彬,等.年輕1型糖尿病患者殘余β細(xì)胞功能的預(yù)測[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志, 2016, 32(9):728-733.

Relationship between the serum levels of T cell subgroup and pancreatic islet function in children with type 1 diabetes

ZHANG Gaixiu1*， WANG Lei1， DU Jian1，HU Dongyang2， ZHANG Mingchen2，GUO Tingting2，ZHANG Xiaopan2

(1DepartmentofEndocrinology,Children’sHospitalofShanxiProvince，Taiyuan030013，China；2DepartmentofPediatrics,ShanxiMedicalUniversity；*Correspondingauthor，E-mail:2651024846@qq.com)

ObjectiveTo investigate the changes of T lymphocyte subsets (CD4+, CD8+, CD4+/CD8+) in peripheral blood of untreated children with type 1 diabetes mellitus, and to explore its relationships with islet function.MethodsForty-three children with T1DM in Shanxi Children’s Hospital from May 2010 to December 2013 were selected as experimental group, and 25 healthy children were chosen as control group. The expression of CD4+, CD8+, and CD4+/CD8+T cell subsets in two groups was measured by flow cytometry, and the results were compared. Correlation between T cell subsets and glycated hemoglobin, C peptide levels in T1DM children was analyzed.ResultsThe levels of CD4+T cells and CD4+/CD8+T cells in peripheral blood were significantly higher in T1DM group than in control group (t=1.413, 1.424,P<0.05), while the level of CD8+T cells was significantly lower(t=1.531,P<0.05). The level of CD4+T cells in peripheral blood was positively correlated with HbA1c (r=0.261,P<0.05), but negatively correlated with C-P (r=-0.270,P<0.05). The level of CD8+T cells was not significantly correlated with HbA1c (r=-0.156,P>0.05), but positively correlated with C-P (r=0.162,P<0.05). The level of CD4+/CD8+T cells was not significantly correlated with HbA1c(r=0.200,P>0.05), but negatively correlated with C-P(r=-0.243,P<0.05).ConclusionT lymphocyte subsets imbalance,such as abnormal activation of CD4+T cells, CD8+T cell deficiency and the increase of CD4+/CD8+T cell, is involved in the process of the onset of T1DM. CD4+and CD4+/CD8+T cells are negatively correlated with C-P, and CD8+T cells are positively correlated with C-P.

type 1 diabetes； T cell subset； pancreatic islet function； glycosylated hemoglobin； C peptide

張改秀，女，1966-05生，博士，副主任醫(yī)師， E-mail： 2651024846@qq.com

2017-03-06

R587.1

A

1007-6611(2017)06-0615-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.023