裴祎 張曉晶 鄭珂 王巍 穆帥 薛峰 滕松齡 付勤

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/遼寧省腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，遼寧 沈陽(yáng) 110042

糖尿病是一種由于胰島素分泌不足或機(jī)體對(duì)胰島素利用效率低而引發(fā)的慢性疾病。糖尿病性骨質(zhì)疏松[1]是指糖尿病患者并發(fā)單位體積內(nèi)骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)改變、骨強(qiáng)度降低、脆性增加等易發(fā)生骨折的一種全身性、代謝性骨病。因此對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制及其防治的研究，已成為骨質(zhì)疏松癥基礎(chǔ)和臨床亟待解決的重大問(wèn)題。目前普遍認(rèn)為糖尿病性骨質(zhì)疏松是一種多病因疾病[2]，糖尿病發(fā)生后會(huì)引起全身骨痛，易發(fā)骨折，致殘致死率高，已經(jīng)證實(shí)長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)會(huì)影響三大物質(zhì)代謝障礙；同時(shí)胰島素缺乏使成骨細(xì)胞的分化和增殖減弱，數(shù)目減少、活性降低，抑制骨膠原合成[3]；同時(shí)還可抑制成骨細(xì)胞合成骨鈣素，從而導(dǎo)致骨吸收增多，骨量丟失增大[4]，降低骨轉(zhuǎn)化率等。因此，無(wú)論是探討發(fā)病機(jī)制還是解決臨床防治問(wèn)題，有效控制血糖、避免胰島素缺乏是提高骨骼質(zhì)量和預(yù)防糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)生的關(guān)鍵。

釩是人體必需的微量元素之一，具有降血糖、抗炎、抗癌、等多種生理功[5]。在體內(nèi)，釩有四價(jià)、五價(jià)等多種化合態(tài)，1980年Schecher等首先發(fā)現(xiàn)釩具有很好的體外胰島素樣活性。近年來(lái)許多學(xué)者亦通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，口服釩酸鹽無(wú)論對(duì)Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的血糖都能降至或接近正常的水平，這充分顯示了釩酸鹽的降糖作用[6]。從以往的研究中發(fā)現(xiàn)，釩酸鹽可以通過(guò)其類(lèi)胰島素作用改善大鼠因缺乏胰島素而導(dǎo)致全身高血糖狀態(tài)，而這種類(lèi)胰島素的降糖作用能否進(jìn)一步延緩、甚至阻止糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展？本研究的目的是通過(guò)檢測(cè)金屬釩治療前后糖尿病大鼠骨代謝指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，探明金屬釩對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松骨代謝及骨顯微結(jié)構(gòu)的作用。旨在為開(kāi)發(fā)和研制有效改善和治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的藥物提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：45只2月齡雄性Wistar大鼠，體重(225±25) g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2飼養(yǎng)環(huán)境：動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)地在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，其環(huán)境符合衛(wèi)生檢疫標(biāo)準(zhǔn)。室溫(20±1)℃、濕度為20%，照明晝夜明暗交替時(shí)間為1212，大鼠自由飲水、進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)狀態(tài)。

1.1.3藥物：佐鏈尿菌素，釩酸鹽(Betapharma有限公司。上海，中國(guó))。

1.1.4主要儀器：Micro-CT(SCANCO Medical AG, Switzerland )；高精度數(shù)顯光柵位移傳感器(Instron Corporation，AM)；阿波特300i化學(xué)分析儀(Abbott Diagnostics，Abbott Park， IL，USA)；Microscope(Olympus)；Zwick-Z010 生物力學(xué)檢測(cè)儀(Z010，Zwick GmbH， Ulm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

45只雄性Wistar大鼠被隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(n=15)、高血糖組(n=15)、高血糖+釩治療組(n=15)。首先對(duì)高血糖組、高血糖+釩治療組大鼠進(jìn)行I型糖尿病造模，對(duì)照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水作為對(duì)照組。以8 w齡Wistar雄性大鼠按45 mg/kg體重注射佐鏈尿菌素，制作糖尿病大鼠模型。造模后第3天、5天、7天尾靜脈采血測(cè)血糖，以3次血糖均值大于13 mmol/L為糖尿病造模成功鼠。對(duì)照組僅注射生理鹽水，不影響胰島細(xì)胞功能。若3次血糖值<13mmol/L，則認(rèn)定造模失敗。造模成功后，給予高血糖+釩治療組糖尿病大鼠應(yīng)用釩治療，每只大鼠按0.18 mg/(kg·d)釩計(jì)量喂養(yǎng)，每只大鼠通過(guò)灌胃治療，治療共持續(xù)12 w。對(duì)照組、高血糖組則以生理鹽水灌胃進(jìn)行對(duì)照。連續(xù)喂養(yǎng)12 w，每周分別對(duì)3組大鼠進(jìn)行體重、血糖監(jiān)測(cè)。喂養(yǎng)第12周結(jié)束以后，分別取3組大鼠脛骨、股骨進(jìn)行micro-CT檢測(cè)、組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)、生物力學(xué)檢測(cè)、骨礦含量檢測(cè)、評(píng)價(jià)鈣鹽含量等相關(guān)指標(biāo)。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目

1.3.1Micro-CT：利用臺(tái)式micro-CT對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脛骨進(jìn)行檢測(cè)分析(SCANCO Medical AG，Switzerland )。沿著整個(gè)脛骨的長(zhǎng)軸，掃描600層，層厚40 μm，已通過(guò)脛骨近端部分的區(qū)域作為選定區(qū)域[7-8]，包括在內(nèi)的上下各100層進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。三維骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)可以直接測(cè)量出來(lái)：骨小梁體積(bone volume，BV)、被測(cè)樣品總體積(tissue volume，TV)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)。

1.3.2骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察參數(shù)：利用10%乙二胺四乙酸(EDTA)將股骨脫鈣，石蠟包埋后，縱切。利用顯微鏡上的投影描繪器和分析軟件(Image-Pro 4.0 analysis software)對(duì)組織形態(tài)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析。每個(gè)切片厚度為5 μm，均選擇10個(gè)松質(zhì)骨區(qū)域，放大200倍進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)區(qū)域中選擇組織3～5處切片位置，使實(shí)驗(yàn)更具有一致性，并減少誤差。

1.3.3大鼠離體股骨生物力學(xué)測(cè)試：應(yīng)用三點(diǎn)應(yīng)力載荷測(cè)量股骨機(jī)械強(qiáng)度。Zwick-Z010 testing systems(Z010，Zwick GmbH，Ulm)室溫條件下，股骨緩慢融化后，除去附著在骨上的軟組織，并將股骨遠(yuǎn)端浸潤(rùn)水泥，以防止發(fā)生旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)方向應(yīng)力，影響測(cè)量結(jié)果。將樣本放置在三點(diǎn)應(yīng)力測(cè)試器上，跨距為40 mm，2 mm/min 的速度勻速運(yùn)動(dòng)，直至樣本發(fā)生骨折。記錄骨折時(shí)，骨折載荷的最高值(牛頓，N)。

1.3.4骨礦物質(zhì)含量測(cè)定：為了測(cè)定骨礦含量，將股骨620°C，48 h條件下礦化并測(cè)重。礦化骨溶解于6 M鹽酸溶液中，比色法測(cè)定骨礦含量中鈣的含量(Pointe Scientific 標(biāo)準(zhǔn)試劑盒)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)收集在 Excel (Microsoft)文件里。Micro-CT 檢測(cè)所得骨小梁結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，組織形態(tài)測(cè)定所得數(shù)據(jù)，骨機(jī)械性能檢測(cè)所得數(shù)據(jù)以及骨礦物質(zhì)含量均進(jìn)行均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)。組間差異統(tǒng)計(jì)利用ANOVA和 Post hoc Tukey’s test 檢驗(yàn)用于組間差異統(tǒng)計(jì)。利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠體重變化

喂養(yǎng)12 w期間，每周末對(duì)3組大鼠體重的測(cè)量值，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，高血糖組和高血糖+釩治療組的大鼠體重明顯下降。前4 w，高血糖組、高血糖+釩治療組的體重差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，然而在第4周時(shí)，高血糖+釩治療組大鼠的體重開(kāi)始明顯增加，但與對(duì)照組比較，體重增加并沒(méi)有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)值，這些結(jié)果說(shuō)明，釩酸鹽能夠改善高血糖大鼠的體重指標(biāo)，但不足以使之達(dá)到正常喂養(yǎng)值。

圖1 大鼠12 w內(nèi)體重變化(a：與高血糖組比較，P<0.05)Fig.1 Body weight changes of rats in 12 weeks (a: P<0.05, compared to the diabetic group)

2.2 大鼠血糖變化

喂養(yǎng)12 w期間，每周末對(duì)3組大鼠血糖值進(jìn)行分析，見(jiàn)圖2。在治療1 w后，高血糖+釩治療組血糖值與高血糖組比較明顯降低(P<0.05)，但是血糖值并未達(dá)到正常值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明釩酸鹽能夠顯著降低糖尿病大鼠的血糖值(圖2)。

圖2 大鼠12 w內(nèi)血糖值變化(a：與高血糖組比較，P<0.05)Fig.2 Blood glucose changes in 12 weeks (a: P<0.05, compared to the diabetic group)

2.3 Micro-CT檢測(cè)

釩酸鹽對(duì)大鼠脛骨顯微結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖3。高血糖組大鼠骨的骨小梁總量明顯降低，而高血糖+釩治療組明顯增加了小梁骨的比率。同時(shí)，高血糖+釩治療組對(duì)骨小梁顯微結(jié)構(gòu)也具有一定的改善作用，其骨小梁寬度與糖尿病組相比明顯增加(P<0.05)。然而，在骨小梁數(shù)量和骨小梁間隙方面，高血糖+釩治療組與高血糖組相比并未有明顯的改善(P>0.05)。

圖3 釩酸鹽對(duì)高血糖大鼠脛骨顯微結(jié)構(gòu)的影響。A：骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)；B：平均骨小梁寬度(Tb.Th)；C：平均骨小梁數(shù)量(Tb.N)；D：平均骨小梁間隙(Tb.Sp)。1：對(duì)照組，2：高血糖組，3：高血糖+釩治療組。與高血糖組比較，*P<0.05Fig.3 Effect of vanadium treatment on trabecular microarchitectural parameters. A: Percentage of total bone volume occupied by trabecular bone (BV/TV); B: Mean trabecular thickness (Tb.Th); C: Mean trabecular number (Tb.N); D: Mean trabecular separation (Tb.Sp). Data are expressed as mean±SD. *P<0.05, significant difference from diabetic rats. 1: Control group, 2: Diabetic group, 3: Vanadium group

2.4 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察參數(shù)

釩酸鹽治療組骨組織的組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4A實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明高血糖組大鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說(shuō)明高血糖狀態(tài)能夠抑制骨吸收，圖4B顯示，高血糖組成骨細(xì)胞表面與對(duì)照組相比明顯減少，這說(shuō)明高血糖在抑制骨吸收的同時(shí)，也抑制了骨形成。通過(guò)釩酸鹽治療，破骨細(xì)胞數(shù)量并沒(méi)有提高，但成骨細(xì)胞表面明顯提高，結(jié)果說(shuō)明，釩酸鹽治療不能改善骨吸收，但能夠促進(jìn)骨形成。

圖4 釩酸鹽對(duì)高血糖大鼠組織形態(tài)學(xué)的影響。A：破骨細(xì)胞數(shù)量；B：成骨細(xì)胞表面。1：對(duì)照組，2：高血糖組，3：高血糖+釩治療組。與高血糖組比較，*P<0.05Fig.4 Effect of vanadium treatment on bone histomorphometry. A: Mean number of osteoclasts per square millimeter section; B: Percentage of trabecular bone perimeter occupied by osteoblasts. Data are expressed as mean±SD. *P<0.05, significant difference from diabetic rats. 1: Control group, 2: Diabetic group, 3: Vanadium group

2.5 大鼠離體股骨生物力學(xué)測(cè)試

12 w后對(duì)3組大鼠股骨進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試見(jiàn)表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病鼠的骨骼質(zhì)量比較差，抗壓力、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、質(zhì)量強(qiáng)度都明顯下降，而釩酸鹽治療組最大負(fù)荷載力明顯比高血糖組提高。然而，結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、質(zhì)量強(qiáng)度與高血糖組相比，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 骨礦物質(zhì)含量測(cè)定

與高血糖組相比，釩治療組顯著提高骨組織的骨礦含量。糖尿病平均骨鈣、磷含量分別為(94.53±6.18) mg/g和(44.37±3.16) mg/g，然而釩治療組鈣磷含量為(91.56±8.94) mg/g和(55.65±4.35) mg/g。結(jié)果說(shuō)明，釩主要增加骨骼中磷的含量，然而對(duì)鈣含量的增加無(wú)顯著作用。

表1 各組生物力學(xué)檢測(cè)Table 1 Biomechanical properties in each group

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，與高血糖組比較，#P<0.05。

表2 各組骨礦含量檢測(cè)Table 2 Bone mineral content in each group

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，與高血糖組比較，#P<0.05。

3 討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，釩酸鹽確實(shí)能夠降低I型糖尿病大鼠的高血糖狀態(tài)，并且隨著大鼠的血糖下降，體重逐漸升高。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，體重的增加滯后于血糖的下降，滯后時(shí)間約2 w，而且隨著血糖值的穩(wěn)定，體重值穩(wěn)步上升，這些結(jié)果說(shuō)明，降低大鼠血糖值對(duì)于改善體重有重要意義。

評(píng)價(jià)骨骼強(qiáng)度的高低，最直接的方法就是測(cè)量骨的生物力學(xué)強(qiáng)度。之前的研究已經(jīng)證明，無(wú)論體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，釩的許多復(fù)合物都有類(lèi)胰島素作用[9-11]，而且隨著血糖值的升高，影響骨骼強(qiáng)度的相關(guān)指標(biāo)會(huì)明顯降低[12-13]。從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高血糖組大鼠的最大負(fù)荷載力、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、能量吸收值均明顯降低。通過(guò)釩酸鹽12 w的喂養(yǎng)，最大負(fù)荷載力明顯提高，但是結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、能量吸收值的變化并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明釩酸鹽治療可使受損的最大負(fù)荷載力得到改善。

另一項(xiàng)評(píng)價(jià)骨骼強(qiáng)度指標(biāo)是對(duì)骨顯微結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)。Bauer等[14]發(fā)現(xiàn)了骨的顯微參數(shù)能夠用來(lái)評(píng)價(jià)骨的生物力學(xué)強(qiáng)度。Link等[15]發(fā)現(xiàn)了骨的顯微結(jié)構(gòu)與骨的生物力學(xué)有關(guān)。進(jìn)一步的示例中證明，骨的顯微結(jié)構(gòu)能夠揭示骨的強(qiáng)度，以及骨折的危險(xiǎn)度[16-18]。從骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.Sp)的結(jié)果來(lái)看，高血糖組和高血糖+釩治療組骨小梁數(shù)量明顯減少，骨小梁間隙明顯增大，骨質(zhì)疏松程度更加嚴(yán)重。骨小梁主要由細(xì)胞外基質(zhì)(礦物和膠原)組成，糖尿病會(huì)影響膠原合成及礦化。長(zhǎng)期高葡萄糖濃度會(huì)增加糖基化終末產(chǎn)物的量，大量的終末產(chǎn)物在骨膠原蛋白上堆積，影響了膠原上鈣鹽的沉積及礦化。因此，骨小梁數(shù)量減少和缺乏更緊湊的骨小梁間隙的原因可能是沒(méi)有足夠的膠原蛋白補(bǔ)充。然而，在釩酸鹽治療組中，骨小梁厚度明顯增加(P<0.05)。這說(shuō)明釩酸鹽主要是通過(guò)增加骨小梁厚度，改善骨骼強(qiáng)度。釩酸鹽通過(guò)降低高血糖狀態(tài)，減少糖基化終末產(chǎn)物在膠原蛋白上堆積，進(jìn)一步增加了成骨細(xì)胞在膠原蛋白上的黏附作用，因而改變了成骨細(xì)胞的功能及其分化和增殖作用，促進(jìn)骨形成并進(jìn)一步提高骨礦鹽含量。實(shí)驗(yàn)研究表明，釩酸鹽治療組的骨礦含量和磷含量的增加，但是組織的礦物質(zhì)鈣含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

shyng等[19]研究者發(fā)現(xiàn)，在I型糖尿病模型中，成骨細(xì)胞的數(shù)量和骨形成大大降低了，糖尿病大鼠破骨細(xì)胞的數(shù)量也在減少[20]。在糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中，已經(jīng)被證實(shí)的是骨轉(zhuǎn)換的降低，而不是過(guò)度的骨吸收[21]。在本研究中，釩酸鹽對(duì)糖尿病大鼠股骨組織中的成骨細(xì)胞數(shù)量增加，而破骨細(xì)胞數(shù)量值沒(méi)有明顯改變。體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，金屬元素釩可以增加成骨細(xì)胞數(shù)量[22-23]。釩可以提高成骨細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)，以增加其活性，并可以促進(jìn)骨形成增加[24-25]。破骨細(xì)胞已證實(shí)有胰島素受體，但不受胰島素響應(yīng)，所以破骨細(xì)胞對(duì)釩的類(lèi)胰島素作用無(wú)反應(yīng)。因此，釩酸鹽治療可以改善糖尿病大鼠的促成骨細(xì)胞骨形成作用。然而，僅僅對(duì)觀察性研究和動(dòng)物模型得出的結(jié)論仍然是不夠充分的。Facchini等[26]研究證實(shí)，釩化合物可能會(huì)增加破骨細(xì)胞的活性。因此，不能排除釩對(duì)破骨細(xì)胞作用的可能性、釩還可能直接作用于破骨細(xì)胞并促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性、加快糖尿病大鼠骨的快速重構(gòu)。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)高血糖狀態(tài)對(duì)骨的生物力學(xué)、骨形成、骨顯微結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生消極的影響，給予釩酸鹽治療后，可以糾正糖尿病骨代謝狀態(tài)，可促進(jìn)骨形成，進(jìn)一步提高骨代謝率，并能改善骨顯微結(jié)構(gòu)。糖尿病性骨質(zhì)疏松是一個(gè)復(fù)雜的骨代謝疾病，在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有多種因素參與，各個(gè)因素之間的相互關(guān)系以及它們?cè)诖x過(guò)程中所起的作用還沒(méi)完全了解，因此還需要在以后的工作中更加系統(tǒng)、深入的研究。