劉曉宇，鹿雙雙，池宏偉，郎紹輝，盧選成

(中國疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心，北京，102206)

流感病毒動物實驗生物安全實踐與探討

劉曉宇，鹿雙雙，池宏偉，郎紹輝，盧選成

(中國疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心，北京，102206)

流感病毒動物感染實驗具有一定生物危害風(fēng)險，對研究人員乃至公眾的健康都會造成威脅。不同型和亞型的流感病毒的危險度又有所不同，故本文梳理了國內(nèi)外有關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)及文獻資料并結(jié)合工作實踐，針對流感病毒動物感染實驗生物安全分級及生物安全管理進行探討。

流感病毒、動物實驗、生物安全管理

流感病毒因其變異快、傳播速度快、人群普遍易感、控制難度大等原因易發(fā)生世界范圍的大流行。20世紀(jì)至今發(fā)生的人類流感大流行就有1918年H1N1西班牙流感[1]、1957年H2N2亞洲流感[2]、1968年H3N2香港流感[3]以及2009年席卷全球的新型甲型H1N1流感[4,5]，流感大流行嚴(yán)重威脅人類健康、造成了重大經(jīng)濟損失和社會恐慌。除此之外，自1997 年我國香港暴發(fā)人感染H5N1高致病性禽流感疫情后[6]，禽流感病毒(AIV)跨種屬傳播也引起了高度重視，人感染禽流感的病例數(shù)和地區(qū)不斷增加。2013年我國暴發(fā)H7N9疫情[7,8]；同年5月，我國臺灣報道首例人感染H6N1禽流感病毒病例[9]；2013年底我國又出現(xiàn)H10N8感染人案例[10,11]；2014年我國四川和湖南首次發(fā)生H5N6感染人病例[12-14]。

為應(yīng)對可能發(fā)生的流感大流行、研究流感病毒致病機理、研發(fā)新型流感疫苗，世界范圍內(nèi)很多實驗室都在開展流感研究，其中流感病毒動物感染實驗是這些研究中不可或缺的組成部分。由于流感病毒動物感染實驗有一定風(fēng)險，對研究人員乃至公眾的健康都會造成威脅，故各國對從事不同型別及亞型流感病毒動物感染所需生物安全實驗室級別進行嚴(yán)格規(guī)定。本文梳理了國內(nèi)外有關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)及文獻資料，就流感病毒動物感染實驗生物安全分級及生物安全管理進行探討，供開展流感病毒感染性動物實驗的同行參考。

1 流感病毒概述

流感病毒(influenza virus)根據(jù)病毒顆粒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性的不同分可為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒對人類危害最大，是引起世界流感大流行的主要型別[15]。甲型流感病毒根據(jù)其表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)結(jié)構(gòu)及其基因特性的不同又分成多種亞型，曾認(rèn)為HA有16個亞型(H1～H16)，NA有9個亞型(N1～N9)，近年在蝙蝠體內(nèi)又發(fā)現(xiàn)了H17N10和H18N11流感樣病毒[16,17]。

禽流感病毒屬甲型流感病毒，主要引起禽類從呼吸系統(tǒng)到嚴(yán)重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病。根據(jù)對禽的致病性，禽流感分為高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(LPAI)[18,19]。目前發(fā)現(xiàn)的高致病性禽流感均為H5和H7亞型[19,20]。因HA受體不同，一般情況下禽流感病毒不能感染人，但由于病毒不斷變異，某些亞型禽流感病毒可通過跨種間傳播造成人的感染[19]。目前，已感染造成人類感染的禽流感病毒亞型包括H5N1、H5N2、H5N6、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7和H10N8[21-25]。

用于流感病毒動物感染實驗的動物主要有小鼠、大鼠、地鼠、雪貂和猴等[26-29]。雪貂在流感發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)方面與人類最為相似，且對流感病毒敏感，是研究流感病毒傳播最好的動物模型。但因雪貂缺乏近交系和無特殊病原體個體及價格過高等因素，一定程度上限制了其應(yīng)用。小鼠由于遺傳學(xué)背景清晰、易于飼養(yǎng)，目前是最常用的流感動物模型。鑒于小鼠上呼吸道缺乏α-2,6唾液酸受體，小鼠接種的多數(shù)毒株需經(jīng)過小鼠適應(yīng)的流感病毒毒株。但高致病性(如H5N1)和低致病性(如H9N2和H7N9)禽流感病毒可不經(jīng)過小鼠適應(yīng)而直接感染小鼠[26, 30-32]。

2 流感病毒實驗室生物安全風(fēng)險評估依據(jù)

流感病毒不僅型別多、亞型多，不同病毒危險度也有所不同。除此之外，流感病毒基因還易發(fā)生變異，人群對新的毒株沒有免疫能力。

世界衛(wèi)生組織(WHO)在《實驗室生物安全手冊(第3版)》中劃分1級、2級、3級和4級(危險度由低至高)危險度的依據(jù)為：感染性微生物可能對個體和群體造成的危險[33]。同時要求各國(地區(qū))按照危險度等級，并考慮微生物的致病性、傳播方式和宿主范圍、當(dāng)?shù)鼐邆涞挠行ьA(yù)防措施以及當(dāng)?shù)鼐邆涞挠行е委煷胧┑人膫€因素制定各自的微生物分類目錄。我國根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對個體或群體的危害程度，將病原微生物分為一類、二類、三類和四類病原微生物(危險性由高至低)，其中一類和二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物[34]。各國在對不同型別/亞型的流感病毒進行危險度分級(分類)時，基本也遵照以上原則。美國和加拿大病原微生物危險度分級制度與WHO一致，分為1級、2級、3級和4級。

針對危險度1～4級微生物，WHO提出不同等級生物安全水平實驗室所應(yīng)具備的最低要求的指南和建議。我國《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[34]則對一級、二級、三級和四級生物安全實驗室能開展的活動進行了明確規(guī)定。

感染性動物實驗由于存在較高的生物風(fēng)險，包括涉及高濃度病原微生物、易產(chǎn)生氣溶膠、存在動物抓咬風(fēng)險及動物逃逸等危險因素，故開展感染性動物實驗所需生物安全實驗室(ABSL)級別通常與從事病毒培養(yǎng)所需實驗室(BSL)級別一致。

3 流感病毒動物感染實驗所需生物安全實驗室級別比較

在我國，從事某種病原微生物實驗活動所需生物安全實驗室級別主要遵照2006年發(fā)布的《人間傳染的病原微生物名錄》(簡稱《名錄》)[35]。如擬開展實驗活動的病原不在《名錄》范圍內(nèi)(如新發(fā)傳染病)，則依據(jù)病原危險性，由國家或所在單位生物安全專家委員會召開風(fēng)險評估會議，規(guī)定其危害程度分類并對實驗活動所需生物安全實驗室級別。

在美國，主要依據(jù)為由美國衛(wèi)生和公共服務(wù)部出版的《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全手冊》(第5版)[36]。

在加拿大，主要依據(jù)為加拿大公共衛(wèi)生署發(fā)布的《病原體安全數(shù)據(jù)單》[37]。

下表將列舉中、美、加三國主要型別/亞型流感病毒動物感染實驗所需生物安全實驗室級別的情況(表1)。

表1 三國主要型別/亞型流感病毒動物感染實驗所需生物安全實驗室級別

注：①美國和加拿大關(guān)于生物安全實驗室級別的規(guī)定未明確到每種亞型，僅為原則性規(guī)定。②2009年新型H1N1流感剛出現(xiàn)時，國家衛(wèi)計委將其定為二類病原；隨后，新型H1N1流感轉(zhuǎn)變?yōu)榧竟?jié)流感后，衛(wèi)計委重新定位其為三類病原。

值得進一步強調(diào)的是，以上流感病毒危險性分類及實驗活動所需實驗室級別并不是永久性的。隨著某種流感病毒在人群中免疫情況的變化、病毒進一步變異、或隨著研究的深入、出現(xiàn)有效疫苗或治療方法等，其危險性分類及相應(yīng)的實驗室級別要求都可能發(fā)生變化。

4 重組流感病毒實驗活動風(fēng)險評估原則

隨著近年來科學(xué)界對流感病毒尤其是高致病性禽流感病毒如何傳播、新型病毒亞型如何出現(xiàn)、致病性如何變化等問題的研究逐步升溫，以及反向遺傳學(xué)技術(shù)使得在實驗室重組流感病毒成為可能，評估重組流感病毒危險性、規(guī)定從事實驗活動相應(yīng)的生物安全實驗室級別顯得尤為重要。

美國威斯康星-麥迪遜大學(xué)和荷蘭伊拉斯謨醫(yī)學(xué)中心的科研團隊通過雪貂適應(yīng)性傳代、借助基因工程技術(shù)，驗證了H5N1病毒HA上的幾個氨基酸的變化就使病毒具有了在雪貂中傳播的能力[31, 38]；我國有研究將H5N1型禽流感病毒與2009年引發(fā)全球流感大流行的H1N1型病毒進行混合，發(fā)現(xiàn)一些雜交病毒能夠感染并可通過空氣在雪貂中有效傳播[39]。雪貂受流感病毒影響的方式與人類相似，因此雪貂感染實驗及雪貂傳代適應(yīng)的病毒，具有人際傳播的風(fēng)險[38, 40,41]。以上研究雖然對闡明流感病毒跨種間傳播機制及致病力機理具有重要意義，但其存在的生物安全風(fēng)險往往也是事前無法準(zhǔn)確預(yù)見的。WHO也意識到該問題的嚴(yán)重性，于2012年召開會議專題討論重組流感病毒研究的問題[40,41]。目前各界對于重組流感病毒風(fēng)險評估的原則基本上為：對重組病毒感染性和致病力未知時，應(yīng)采取較高生物安全水平實驗室(BSL3或BSL4)從事實驗活動。

當(dāng)然，重組技術(shù)也可以將高致病性病毒降為低致病性病毒[40,41]。Samadhan等將高致病性禽流感改造為低致病性禽流感，便于在BSL-2實驗室開展原本需要在BSL-3實驗室開展的病毒診斷及疫苗研究[28]。

綜上所述，鑒于流感病毒型別多、甲型流感病毒亞型多，流感病毒自身易發(fā)生變異，且人為實驗室重組流感病毒隨時發(fā)生，開展流感病毒動物感染實驗前必須進行生物安全風(fēng)險評估。故建議，針對國家已有規(guī)定的型別或亞型，研究人員必須嚴(yán)格按照國家要求在相應(yīng)生物安全水平的設(shè)施中開展實驗；針對新發(fā)的或尚無規(guī)定的，必須依據(jù)其致病性、傳播途徑、穩(wěn)定性、易感性、對人體或群體危害程度、防治措施等生物安全關(guān)鍵指標(biāo)，由生物安全委員會或相關(guān)機構(gòu)或組織專家進行生物安全風(fēng)險評估，確定其生物安全等級。對于研究尚未明確的流感病毒亞型，建議相關(guān)實驗活動應(yīng)從嚴(yán)管理，隨后根據(jù)該病毒的最新研究進展，進行動態(tài)風(fēng)險評估。

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Practice and exploration of biosafety management in animal experiments on influenza virus

LIU Xiao-yu, LU Shuang-shuang, CHI Hong-wei, LANG Shao-hui, LU Xuan-cheng

Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China

Animal experiment on influenza virus infection carries certain biohazard risk, with a threat to the health of researchers and public health. The risk levels differ by influenza virus types and subtypes. This article combs the domestic and national laws and rules, and explores the biosafety management of animal study on influenza virus.

Influenza virus, Animal experiments, Biosafety management

國家重點研發(fā)計劃“生物安全關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)”重點專項“國家生物安全監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)集成技術(shù)研究”(2016YFC1200800)。

劉曉宇(1979-)，女,副研究員，博士，研究方向：病原生物學(xué)，實驗動物科學(xué)E-mail:liuxy1004@163.com。

盧選成(1977-)，男，副研究員，研究方向：生物安全，實驗動物科學(xué)，博士，E-mail: luxc@chinacdc.cn。

經(jīng)驗交流

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0068-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.014

2016-11-11