蔣 萍， 穆攀偉， 李 靜， 蒙克嘎勒， 聶永梅， 谷曉艷， 吳桂霞△

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室, 新疆 烏魯木齊 830011； 2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌科， 廣東 廣州 510630)

miR-542-5p對1-磷酸鞘氨醇誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞增殖的抑制作用*

蔣 萍1， 穆攀偉2， 李 靜1， 蒙克嘎勒1， 聶永梅1， 谷曉艷1， 吳桂霞1△

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室, 新疆 烏魯木齊 830011；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌科， 廣東 廣州 510630)

目的： 觀察miR-542-5p對1-磷酸鞘氨醇(S1P)誘導(dǎo)的大鼠小腸隱窩上皮IEC-6細(xì)胞增殖的影響。方法: 建立穩(wěn)定表達(dá)鞘氨醇激酶1(SphK1)的IEC-6細(xì)胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)，Western blot檢測SphK1蛋白表達(dá)，放射性同位素示蹤法測定SphK1酶活性和S1P分泌，細(xì)胞計數(shù)繪制生長曲線觀察細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化，實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-542-5p表達(dá)。結(jié)果: 與對照細(xì)胞相比，細(xì)胞系SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2中SphK1蛋白表達(dá)顯著升高，SphK1酶活性升高，細(xì)胞內(nèi)外S1P濃度升高，細(xì)胞生長速度加快，細(xì)胞周期中S期細(xì)胞所占比例升高，miR-542-5p的表達(dá)量降低；在IEC-6細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入S1P (0.5～10 μmol/L)，能顯著抑制miR-542-5p表達(dá)；采用siRNA干擾降低IEC-6細(xì)胞的SphK1，可明顯升高miR-542-5p表達(dá)。升高SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2細(xì)胞中miR-542-5p水平，則可降低S期細(xì)胞比例，抑制細(xì)胞增殖。結(jié)論: S1P通過降低IEC-6細(xì)胞中miR-542-5p水平，引起細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖。

miR-542-5p； 1-磷酸鞘氨醇； 鞘氨醇激酶1； IEC-6細(xì)胞； 細(xì)胞增殖

神經(jīng)鞘脂類是一類廣泛存在于真核細(xì)胞膜上具有鞘氨基醇酰基的脂質(zhì)，其代謝產(chǎn)物鞘氨醇(sphingosine，Sph)被鞘氨醇激酶(sphingosine kinase, SphK)磷酸化而生成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1- phosphate，S1P)。目前已經(jīng)知道SphK有2個亞型：SphK1和SphK2。其中，SphK1/S1P信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、存活和凋亡的重要途徑之一[1-2]。SphK1過表達(dá)時，可以增加細(xì)胞內(nèi)S1P的含量，促進(jìn)細(xì)胞增殖[3-5]，是腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的因素[6-7]。但是對其具體機(jī)制仍了解不多。

MicroRNA是由19～24個核苷酸組成的高度保守的非編碼RNA，參與細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的調(diào)控[8]。miR-542-5p是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤組織中檢測到其表達(dá)降低，并且這一抑制效應(yīng)與腫瘤組織增生加劇、侵襲性升高等不良預(yù)后相關(guān)[9-12]。目前已經(jīng)明確microRNA和SphK1/S1P信號通路中的SphK1存在互相調(diào)控關(guān)系：SphK1是microRNA的作用靶點(diǎn)[13-14]，microRNA的活性又受SphK1的調(diào)控[15]。這就提示SphK1/S1P信號通路有可能通過miR-542-5p來發(fā)揮作用，但對此還未見有相關(guān)報道。因此，本研究擬建立穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系，增加S1P合成，來觀察miR-542-5p在S1P誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞株IEC-6購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購自HyClone。限制性內(nèi)切酶NotⅠ和T4 DNA連接酶購自寶生物工程有限公司。Opti-MEM培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000購自Invitrogen。RNeasy Mini Kit、miScriptⅡRT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、miR-542-5p、U6引物、mimic-miR-542-5p及陰性對照(scramble)購自QIAGEN。細(xì)胞周期檢測試劑盒購自貝博生物。c-Myc和GAPDH抗體購自Santa Cruz。SphK1抗體購自Cell Signaling Technology。蛋白定量試劑盒和RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司。SphK1 (NM_021972) cDNA Clone in pCMV6-AC 購自O(shè)riGene。陰性對照C-siRNA(5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCA-3’)及siSphK1(5’-AUCCUUUAAACUGAUGCUCACCG-3’)購自Invitrogen。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入0.05%的胰蛋白酶37 ℃消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞收縮變圓，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)，1 500 r/min離心5min，棄去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，1∶3的比例傳代，實(shí)驗(yàn)用4～6代細(xì)胞。

2.2 SphK1重組質(zhì)粒構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶NotI從pCMV6-AC-SphK1質(zhì)粒切下SphK1 cDNA，克隆入pCMV6-Neo質(zhì)粒NotI位點(diǎn)，PCR篩選后用SacI和BamH I雙酶切鑒定克隆方向，經(jīng)雙向測序鑒定讀框無誤后，提取重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1。SphK1上游引物為5’-TGAACCTGCTGTCTCTGC- AC-3’，下游引物為5’-CAGGTGTCTTGGAACCCACT-3’。PCR條件： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 45 s， 52 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)； 72 ℃ 10 min。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

Figure 1.The SphK1 was cloned into an expression vector pCMV6-Neo.

圖1 SphK1 cDNA在表達(dá)載體pCMV6-Neo中嵌入的模式圖

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立 轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的IEC-6細(xì)胞用胰酶消化，接種于60 mm培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)12～16 h，細(xì)胞密度達(dá)70%～90%時，按照LipofectamineTM2000使用手冊的指示，將pCMV6-Neo-SphK1轉(zhuǎn)染至IEC-6細(xì)胞內(nèi)，按照同樣的程序轉(zhuǎn)染pCMV6-Neo空載體(vector)作為空載體對照；再用非篩選性培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，以600 mg/L的G418選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，適時挑選抗性克隆，24孔板、6孔板和25 mL培養(yǎng)瓶逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)SphK1蛋白的細(xì)胞系。Western blot檢測SphK1的表達(dá)，最終挑出2個穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)及vector細(xì)胞系用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 S1P分泌量及SphK1酶活性分析 據(jù)文獻(xiàn)[16]的描述，采用放射性同位素示蹤法檢測SphK1細(xì)胞系S1P合成以及SphK1酶活性。簡單描述如下： 1.5 μmol/L 0.45 μCi D-erythro-[3-3H]鞘氨醇37 ℃孵育10 min用以標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)鞘氨醇，之后用堿性苯酚-甲醇提取培養(yǎng)液及細(xì)胞內(nèi)的S1P。用每mg蛋白釋放多少pmol的S1P為單位計算細(xì)胞內(nèi)外S1P的量，SphK1的酶活性以單位時間S1P的釋放量為單位。

2.5 細(xì)胞生長曲線的記錄 將SphK1-IEC-C1、SphK1-IEC-C2及vector細(xì)胞以每孔1.5×104接種于12孔板，每個樣本做4個復(fù)孔，每天以細(xì)胞計數(shù)板計算每孔細(xì)胞數(shù)，直至細(xì)胞融合，繪制細(xì)胞生長曲線。

2.6 Mimic-miR-542-5p的瞬時轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的SphK1-IEC-C1、SphK1-IEC-C2及vector的細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書配制轉(zhuǎn)染液：無血清、無雙抗的Opti-MEM培養(yǎng)液中混合適量mimic-miR-542-5p和Lipofectamine 2000，室溫放置20 min，每孔轉(zhuǎn)染50 nmoL/L的mimic-miR-542- 5p，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后，更換普通培養(yǎng)基，48 h后進(jìn)行細(xì)胞周期分布分析。同時設(shè)立隨機(jī)序列陰性對照組(scramble組)。

2.7 Western blot法檢測蛋白表達(dá) RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞，收集提取液，勻漿后4 ℃ 14 000 r/min離心10 min，取上清液，按蛋白定量試劑盒操作說明測定蛋白濃度。蛋白濃度測定后，進(jìn)行SDS-PAGE，上樣量為30 μg，電印跡轉(zhuǎn)移法將凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%牛血清白蛋白組分的TBST溶液室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBST 溶液洗脫3次，每次10 min，再與Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 溶液洗脫3次，每次10 min，之后與ECL試劑反應(yīng)2 min，使用ProteinSimple公司的Flour Chem E型凝膠成像系統(tǒng)曝光、成像，以ImageJ圖像處理軟件測定感光區(qū)帶的感光密度。

2.8 細(xì)胞周期分布檢測 收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書所述步驟對DNA進(jìn)行染色。簡述如下：冰PBS沖洗細(xì)胞2次，75%乙醇-20 ℃固定1 h，冰PBS沖洗1次，400 μL PBS重懸細(xì)胞，加入20 μL溶液A，37 ℃孵育30 min，碘化丙啶(propidium iodide，PI)于4 ℃避光染色1 h后，LSRⅡ流式細(xì)胞儀(BD)檢測細(xì)胞周期分布，每樣本獲得60 000細(xì)胞，Modfit軟件分析細(xì)胞周期各時期的百分率。

2.9 RT-qPCR 按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，利用紫外線分光光度計檢測RNA濃度與純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，定量PCR儀(Applied Biosystems 7500)平臺進(jìn)行定量分析，以U6 snRNA為內(nèi)參照，miR-542-5p的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt計算。每個樣本重復(fù)3次。

2.10 RNA干擾 進(jìn)行RNA干擾前1 d，1×105細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書配制轉(zhuǎn)染液：無血清、無雙抗的Opti-MEM培養(yǎng)液中混合適量siSphK1和Lipofectamine 2000，室溫放置20 min，每個培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染20 mmol/L的siSphK1，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后，更換普通培養(yǎng)基，48 h后收取細(xì)胞，提取RNA及蛋白質(zhì)。同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染的空白對照組和隨機(jī)序列陰性對照組(C-siRNA組)。每個樣本重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系中SphK1酶活性及S1P生成的改變

與vector細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)，SphK1的表達(dá)升高約2倍，SphK1的活性增高1.8～2.1倍，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外S1P的濃度升高(P<0.01)，SphK1/S1P信號通路處于激活狀態(tài)，見圖2、3。

Figure 2.SphK1 protein expression in control vector and stable SphK1-expressing cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector cells.

圖2 穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系SphK1蛋白表達(dá)的測定

2 SphK1/S1P升高對細(xì)胞增殖的影響

與vector細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)生長速度加快，更早到達(dá)細(xì)胞融合階段，見圖4。與vector細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系G1期細(xì)胞比例明顯減少，S期細(xì)胞所占的比例升高，見圖5。

Figure 3.SphK1 activity (A) and S1P secretion (B) in control vector and stable SphK1-expressing cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector cells.

圖3 穩(wěn)定表達(dá)SphK1細(xì)胞系SphK1酶活性以及S1P含量的測定

Figure 4.Cell growth curve assay of control vector and stable SphK1-expressing cells cultured for 15 d. Total cell number was counted daily until the cells reached confluence. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector cells.

圖4 穩(wěn)定表達(dá)SphK1細(xì)胞系的細(xì)胞生長曲線的繪制

3 SphK1/S1P對miR-542-5p表達(dá)水平的影響

與vector細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)miR-542-5p表達(dá)下降(P<0.05)。在IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)液中直接加入S1P (0.5～10 μmol/L)，共同孵育4 h，miR-542-5p的表達(dá)降低，其中S1P在2.5 μmol/L時的抑制率最高(P<0.05)，見圖6。

Figure 5.Cell cycle analysis of control vector and stable SphK1-expressing cells were determined by flow cytometry 36 h after cells were cultured.

圖5 穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系細(xì)胞周期分布情況

Figure 6.The levels of miR-542-5p in control vector and stable SphK1-expressing cells (A) and the levels of miR-542-5p in IEC-6 cells treated with S1P (0.5～10 μmol/L) for 4 h (B) were examined by RT-qPCR analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector cells；#P<0.05vs0 μmol/L.

圖6 穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系中miR-542-5p表達(dá)的測定以及IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)液加入S1P對miR-542-5p表達(dá)的影響

4 RNA干擾抑制IEC-6細(xì)胞SphK1表達(dá)對miR-542-5p水平的影響

與空白對照及C-siRNA細(xì)胞相比，IEC-6細(xì)胞轉(zhuǎn)染siSphK1 48 h后，SphK1蛋白表達(dá)下降約80%，miR-542-5p的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖7。

5 在穩(wěn)定表達(dá)SphK1細(xì)胞系轉(zhuǎn)染mimic-miR-542-5p對細(xì)胞周期分布的影響

在穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)轉(zhuǎn)染mimic-miR-542-5p，升高細(xì)胞內(nèi)miR-542-5p的表達(dá)。與轉(zhuǎn)染陰性對照scramble的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染mimic-miR-542-5p的SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2細(xì)胞中，S期細(xì)胞的所占比例下降，見圖8；在轉(zhuǎn)染后的第3天和第5天細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.01)，見圖9。

Figure 7.The expression of SphK1 (A) and miR-542-5p (B) in IEC-6 cells transfected with C-siRNA or siSphK1 Mean±SD.n=3.*P<0.05vsC-siRNA cells.

圖7 siRNA抑制IEC-6細(xì)胞SphK1蛋白表達(dá)對miR-542-5p表達(dá)的影響

討 論

鞘磷脂的代謝產(chǎn)物包括神經(jīng)酰胺(ceramide，Cer)、Sph和S1P，Cer和Sph是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子，抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；S1P則刺激細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞凋亡[2]。細(xì)胞內(nèi)的Cer、Sph和S1P可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，并通過酶促反應(yīng)維持其動態(tài)平衡。本研究在IEC-6細(xì)胞建立穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞系，升高SphK1酶活性，打破酶促反應(yīng)的平衡，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)S1P的生成和細(xì)胞外S1P的分泌，用以探討SphK1/S1P系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制。

MicroRNA在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等方面都具有重要的調(diào)節(jié)作用，研究已證實(shí)SphK1是micro-RNA的作用靶點(diǎn)[13-14]，microRNA的活性也受SphK1的調(diào)控[15]。miR-542-5p是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，能抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖[17]。本研究中穩(wěn)定表達(dá)SphK1的2個細(xì)胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)，細(xì)胞增殖速度加快的同時miR-542-5p表達(dá)降低，相反，通過RNA干擾抑制IEC-6細(xì)胞SphK1蛋白的表達(dá)，則miR-542-5p的表達(dá)升高。這提示SphK1催化而生成的產(chǎn)物S1P可能是通過抑制miR-542-5p的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。目前已經(jīng)知道S1P可以通過2種方式產(chǎn)生促細(xì)胞增殖的效應(yīng)，一是分泌至細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體S1PR結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)[3, 18]，另一種是直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮第二信使的作用，觸發(fā)Ca2+動員[19-20]。本研究中直接在IEC-6細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入S1P，也能降低miR-542-5p表達(dá)，提示S1P能通過細(xì)胞外途徑抑制miR-542-5p的表達(dá)。

Figure 8.Effects of mimic-miR-542-5p on the cell cycle of stable SphK1-expressing cells (SphK1-IEC-C1 and SphK1-IEC-C2) determined by flow cytometry.

圖8 在SphK1-IEC-C1和 SphK1-IEC-C2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染mimic-miR-542-5p對細(xì)胞周期分布的影響

目前已經(jīng)知道SphK1/S1P信號通路能對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。Kohno等[19]在大鼠腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒載體升高SphK1的表達(dá)，S期細(xì)胞所占比例升高；反之，使用N，N-二甲基鞘氨醇抑制SphK1表達(dá)，S期細(xì)胞所占比例下降；敲除了SphK1的ApcMin/+SphK1-/-小鼠腸息肉組織中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4， CDK4)蛋白表達(dá)降低。Kalhori等[21]使用FTY720抑制甲狀腺癌細(xì)胞S1P1受體表達(dá)，細(xì)胞增殖速度減慢，停留在G1期的細(xì)胞比例增多，CDK的抑制因子p2l和p27蛋白表達(dá)升高。上述研究提示，SphK1/S1P系統(tǒng)促細(xì)胞增殖效應(yīng)與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)。本研究中，高表達(dá)SphK1的細(xì)胞，miR-542-5p表達(dá)降低，S期細(xì)胞所占比例升高，細(xì)胞生長加快。反之，在穩(wěn)定表達(dá)SphK1的細(xì)胞(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)轉(zhuǎn)染mi-mic-miR-542-5p，升高miR-542-5p表達(dá)，則表現(xiàn)為停留在G1期的細(xì)胞增多，細(xì)胞生長速度減慢，提示miR-542-5p能通過調(diào)控IEC-6細(xì)胞的細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。

Figure 9.The numbers of stable SphK1-expressing cells (SphK1-IEC-C1 and SphK1-IEC-C2) transfected with scramble or mimic-miR-542-5p. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble.

圖9 在SphK1-IEC-C1和 SphK1-IEC-C2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染mimic-miR-542-5p對細(xì)胞數(shù)量的影響

綜上所述，本研究的結(jié)果顯示在IEC-6細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)SphK1，能促進(jìn)S1P合成與分泌，后者通過抑制miR-542-5p的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖。CDK4等細(xì)胞周期調(diào)控因子可能是miR-542-5p的靶基因和靶蛋白，其具體機(jī)制如何在今后研究工作中進(jìn)一步探索。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

miR-542-5p down-regulates IEC-6 cell proliferation induced by sphingosine-1-phosphate

JIANG Ping1, MU Pan-wei2, LI Jing1, Mengkegale1, NIE Yong-mei1, GU Xiao-yan1， WU Gui-xia1

(1DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofEndocrinology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:wuguixia_good@163.com)

AIM: To observe the effects of miR-542-5p on the proliferation of rat small intestine crypt epithe-lial IEC-6 cells induced by sphingosine-1-phosphate (S1P). METHODS: Two IEC-6 cell lines (SphK1-IEC-C1 and SphK1-IEC-C2) were established, which expressed sphingosine kinase-1 (SphK1) stably. Radioactive tracer was used to detect SphK1 activity and S1P secretion. The cell proliferation was observed by cell counting and described by drawing growth curve, and the cell cycle analysis was carried out by flow cytometry. The level of miR-542-5p was evaluated by RT-qPCR. RESULTS: Compared with control vector cells without SphK1 cDNA, both SphK1-IEC-C1 and SphK1-IEC-C2 cell lines showed that Sphk1 was elevated, both intracellular and extracellular S1P increased dramatically, the rate of cell growth was faster, the percentage of the cells in S phase increased, and miR-542-5p expression decreased. S1P (0.5～10 μmol/L) led to the decrease in miR-542-5p expression. On the contrary,SphK1 silencing resulted in the increase in miR-542-5p expression in the IEC-6 cells. The miR-542-5p was elevated in SphK1-IEC-C1 cells and SphK1-IEC-C2 cells, which caused the decrease in the percentage of the cells in S phase. The cell growth rate in the above-mentioned 2 cell lines decreased compared with negative control group. CONCLUSION: In IEC-6 cells, S1P promotes proliferation by inhibiting miR-542-5p expression， which induces the cell cycle transferring from G1phase to S phase.

miR-542-5p; Sphingosine-1-phosphate; Sphingosine kinase-1; IEC-6 cells; Cell proliferation

1000- 4718(2017)07- 1184- 07

2016- 11- 02

2017- 01- 06

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2013211A072)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.005

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△通訊作者 Tel: 0991-4362449; E-mail: wuguixia_good@163.com